Name: modeling charcot-marie-tooth disease in vitro by transfecting mouse primary motoneurons
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons at JoVE.com

"Derneği pour le développement de la neurogénétique" Dr. Jacquier'ın bursu ve AFM-Telethon için MyoNeurAlp stratejik planı ile verdiği destek için teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca Dr Chris Henderson, Dr William Camu, Dr. Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul ve Doktor Georg Haase, geliştirme ve teknik geliştirme katılan ve onların bilgi yaymak teşekkür etmek istiyorum.

Hayvanları içeren tüm işlemleri kurum etik kurul tarafından kabul edildi.
1. çözüm hazırlık
<ol><li>10 mL % 4 BSA L-15 ortamda diyaliz hazırlayın.<ol>
<li>Sığır serum albümin toz % 4 (w/v) 10 mL L-15 orta geçiyoruz.</li>
		<li>20 mL diyaliz kaset 20 kDa kesme ile çözüm ekleyin. Ajitasyon 4 ° C'de altında 3 gündür L-15 orta karşı 500 mL diyaliz L-15 orta her gün değiştirin.</li>
		<li>Çözüm bir 0,22 µm membran ve aliquot 15 mL tüpler aracılığıyla filtre. ...

<ol>
	<li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mutation+in+VCP+causes+Charcot-Marie-Tooth+Type+2+disease.">A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease.</a> Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).</li><li>Johnson, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+reveals+VCP+mutations+as+a+cause+of+familial+ALS.">Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS.</a> Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).</li><li>Watts, G. D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+body+myopathy+associated+with+Paget+disease+of+bone+and+frontotemporal+dementia+is+caused+by+mutant+valosin-containing+protein.">Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein.</a> Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).</li><li>Brown, R. H., Al-Chalabi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).</li><li>Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+ALS:+from+genes+to+mechanism.">Decoding ALS: from genes to mechanism.</a> Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).</li><li>Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+embryonic+motoneurons.">Purified embryonic motoneurons.</a> Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).</li><li>Henderson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDNF:+a+potent+survival+factor+for+motoneurons+present+in+peripheral+nerve+and+muscle.">GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle.</a> Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).</li><li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons.">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).</li><li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alsin/Rac1+signaling+controls+survival+and+growth+of+spinal+motoneurons.">Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons.</a> Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).</li><li>Raoul, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+activation+in+presymptomatic+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+mice+of+a+feedback+loop+involving+Fas,+Daxx,+and+FasL.">Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).</li><li>Madji Hounoum, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wildtype+motoneurons,+ALS-Linked+SOD1+mutation+and+glutamate+profoundly+modify+astrocyte+metabolism+and+lactate+shuttling.">Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling.</a> Glia. 65 (4), 592-605 (2017).</li><li>Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dynamics+and+Bioenergetic+Dysfunction+Is+Associated+with+Synaptic+Alterations+in+Mutant+SOD1+Motor+Neurons.">Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).</li><li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptic+amyloidogenic+elements+in+mutant+NEFH+causing+Charcot-Marie-Tooth+2+trigger+aggresome+formation+and+neuronal+death.">Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).</li><li>Aebischer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN&#947;+triggers+a+LIGHT-dependent+selective+death+of+motoneurons+contributing+to+the+non-cell-autonomous+effects+of+mutant+SOD1.">IFN&#947; triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).</li><li>Wiese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+enrichment+of+embryonic+mouse+motoneurons+from+the+lumbar+spinal+cord+of+individual+mouse+embryos.">Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos.</a> Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).</li><li>Camu, W., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+embryonic+rat+motoneurons+by+panning+on+a+monoclonal+antibody+to+the+low-affinity+NGF+receptor.">Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor.</a> Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).</li><li>Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin-based+Isolation+and+Culture+of+Mouse+Embryonic+Motoneurons.">Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110 (3), 385-397 (2002).</li><li>Francius, C., Clotman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+spinal+motor+neuron+diversity:+a+long+quest+for+neuronal+identity.">Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, (2016).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+method+for+gene+delivery+into+mouse+dorsal+root+ganglia+neurons.">Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).</li><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).</li></ol>

Bu iletişim kuralı kritik noktaları fare embriyo sırasında geliştirme (E12.5) sonunda elde edilen un miktarı optimize etmek için bir kesin zaman penceresinde disseke biridir. Buna ek olarak, en iyi verim için diseksiyon sabah ya da öğleden sonra erken yapılmalıdır. Daha önce E12.5 (Örneğin, E11.5 adlı), diseksiyon meninkslerde kaldırılması ile ilgili özellikle zordur. E12.5 sonra elde edilen MNs sayısı önemli ölçüde düşer. Gelişiminin embriyo aşamasında denetlemek için yetişkin...

A değişiklik-in kas ve/veya sinir sisteminin değiştirilmesini tarafından karakterize klinik ve genetik olarak farklı patolojiler nöromüsküler hastalıklar kapsamaktadır. Sıralama teknolojik gelişmeler nedeniyle, son on yılda genlerin bu nadir hastalıklar için sorumlu yüzlerce tespit edilmiştir (liste Neuromuscular hastalığı Merkezi, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). Tek bir gen farklı mutasyon farklı fenotipleri ve hastalıkları1,2,3 neden olabilir ve farklı genlerdeki mutasyonlar benzer fenotipleri üretebilir saptanan mutasyon çeşitli gösterir 4 , 5. Bu bağlamda, mutasyon sonuçları ve patolojik mekanizmalarını analiz etmek için güçlü araçlar olabilir hücresel modellerinin geliştirilmesi için çaba vardır.
Omurilik MNs ventral boynuzları omurilik, iskelet kas lifleri hedef ve nöromüsküler kavşak, asetilkolin serbest yoluyla gönüllü hareketler için izin vermek için form uzun aksonlar yer alan büyük somas var. MNs nöromüsküler hastalıklar gibi amyotrofik lateral skleroz, Charcot Marie Tooth hastalığı (CMT), etkilenen ve spinal kas atrofisi, Dr Henderson ve arkadaşları ekimi için izin verilen ilk Protokolü6 geliştirilmiş Tüp bebek spinal MNs ve keşif nörotrofik faktör GDNF7 (gliyal hücreye türetilmiş Nörotrofik faktörü). O zamandan beri teknik ayrıntılandırmaları spinal MNs ve FACS8kullanarak kendi alt türlerinden daha doğru arıtma için izin vermiş, ancak güçlü ve yaygın olarak kullanılan birincil spinal MNs ile çalışmakta laboratuarlarında zenginleştirme yoğunluk gradient tarafından kalır 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. daha sonra immunopanning bir daha yüksek MN arıtma sınıfa yüzey işaret p75(NTR)15,16,17yararlanarak elde etmek mümkündür.
Omurilik boyun, göğüs ve bel MNs yanı sıra ön boynuz dorso-ventral ekseninde konumlarında arasında farklılık medyan ve yanal motor sütunları farklı alt türlerinden içerir ve hedefler arasında onlar8, innervate 18. birincil MN kültürleri tüm fizyolojik oranlarda bu MN türlerinden kurtarabilirsiniz. Ana bu teknik MNs yordamın bitiminde elde edilen az sayıda kısıtlamasıdır; Aslında, yaklaşık 105 MNs mikroskobu ama Biyokimya deneyler için sınırlama için uygun olan altı embriyolar elde etmek için beklenebilir. Deneyler daha standart alt türlerini ve bol MNs gerçekleştirmek için (> 106 hücreler), embriyonik kök hücre kaynaklı MNs18düşünülmelidir.
Birincil MNs içine vahşi-türü/mutant transgenes veya devirme endojen genlerin transfection özellikle fare modelleri kullanılamaz olduğunda fizyopatolojik yolları, deşifre için hızlı ve yararlı bir araçtır. Magnetofection için transfecting birincil nöronlar, lipofection ilgili nörotoksisite olmadan benzer bir tekniktir. Ayrıca, transfection olgun nöronlar üzerinde birkaç gün vitro, adım9tarihinde temel teknikleri aksine sonra gerçekleştirilebilir. Ancak, bu tekniğin bir dezavantaj boncuk DAPI etiketleme gürültü neden kültür, nükleik asitler bağlamak olduğunu. Viral enfeksiyon büyük olasılıkla transfecting MNs için en etkili tekniktir; Ancak, magnetofection viral üretim ve hücresel enfeksiyon için gerekli bazı güvenlik prosedürleri gerektirmez.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone dissection dish</td>
			<td>Living systems instrumentation</td>
			<td>DD-90-S-BLK-3PK</td>
			<td>Sylgard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>round coverslip</td>
			<td>NeuVitro, Knittel glass</td>
			<td>GG-12-Pre</td>
			<td>12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide a Lyzer cassettes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>66030</td>
			<td>20,000 MWCO ; 30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGVU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP Sterile Syringe Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>167063</td>
			<td>Nunclon Delta treated plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>#5 forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissor</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>14060-10</td>
			<td>fine scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>10035-20</td>
			<td>curved blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>10316-14</td>
			<td>micro-knife scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>663102</td>
			<td>&#248; x h = 100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>Watman</td>
			<td>1001125</td>
			<td>circle, 125 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass chamber slide</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154526</td>
			<td>4 chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pCAGEN</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#11160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions and mediums</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11415056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium, no red phenol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conalbumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-DL-Ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin 2.5%, 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS w/o Ca Mg</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>without Mg2+ Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuron cell culture medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A3582901</td>
			<td>Neurobasal Plus medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer 1 M</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradiant medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optiprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>supplement medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A3582801</td>
			<td>B-27 Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline/streptomycine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno fluorescence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>X0515</td>
			<td>without Mg2+ Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline Acetyl Transferase (CHAT)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>Ab144P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament H non phosphorylated (SMI32)</td>
			<td>Biolegends</td>
			<td>SMI-32P</td>
			<td>IF at 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>40.2D6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>39.4D5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hb9</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>81.5C10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta3 tubulin (Tuj1 clone)</td>
			<td>Biolegends</td>
			<td>801201</td>
			<td>IF at 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lc3b</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#2775</td>
			<td>IF at 1/200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling charcot-marie-tooth disease in vitro by transfecting mouse primary motoneurons

Spinal motoneurons (MNs) ateş içinde nörolojik bozukluklar amyotrofik lateral skleroz, Charcot Marie Tooth hastalığı ve spinal kas atrofisi, kas atrofisi ile ilişkili tüm olan da dahil olmak üzere geniş bir yelpazede karıştığı. Omurilik MNs birincil kültürleri belirli genler gibi hastalıklar tutulumu göstermek ve onların mutasyonların hücresel sonuçları karakterize yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu iletişim kuralı modelleri birincil MN kültür Henderson ve arkadaşları seminal işten daha fazla yirmi yıl önce türetilmiş. İlk olarak, bir fare embriyo Medulla Spinalis ön boynuzları anatomi ve hücreleri bir yoğunluk gradient kullanarak komşu gelen MNs izole bir yöntem ayrıntı. O zaman, biz verimli bir şekilde transfecting MNs magnetofection kullanarak ifade Plasmid'ler ile yeni bir yol mevcut. Son olarak, biz nasıl düzeltmek için ve immunostain MNs. Charcot Marie Tooth hastalığı tip 2 neden neurofilament mutasyon kullanarak, bu iletişim kuralını proteinler ilgi ifade ve onların katılımı eğitim nitel bir yaklaşım gösteriyor birincil göstermek MN büyüme, bakım ve hayatta kalma.

Kültür 24 saat sonra motoneurons (MNs) zaten önemli aksonal büyüme (soma boyutundan en az 6 kat daha uzun) göstermelidir. Takip eden günlerde, akson büyümek ve dallanma (Şekil 2) görüntülemek devam etmelidir. Alt tür özelliklerine nedeniyle farklı türleri morfoloji olacak. Örneğin, ortalama sütun Aksiyel kasları innervate MNs daha kısa ve daha dallı aksonlar bacak kasları18innervate yanal motor sütun MNs daha v...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons at JoVE.com

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Bu teknik amacı birincil motoneurons (MNs) fare omurilik üzerinden zenginleştirilmiş kültürünün hazırlamaktır. Tarif MN hastalıklar neden mutasyonlar sonuçlarını değerlendirmek için biz burada bu yalıtım MNs ve onların transfection magnetofection tarafından izole.

Fare birincil Motoneurons Transfecting tarafından Charcot Marie Tooth hastalığı Vitro modelleme

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

Bu yöntem nörobiyolojide motor nöron polaritesi, akson rehberliği, akson ticareti ve nörodejeneratif mekanizmalar gibi önemli soruları nöralize etmeye yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, nakavt proteinimizi dakika sevgiyle ifade ederken yüksek oranda zenginleştirilmiş bir motor nöron kültürü elde etmektir. Bu prosedüre başlamak için, silikon ile kodlanmış diseksiyon ortamı bir çanak bir embriyo yerleştirin.Mikroskop altında, karın ile embriyo tutun forceps ile silikon karşı. İkinci çift forceps ile, rostrad omuriliğin merkezi kanalına uçlardan birini yerleştirin. Daha sonra, biraz dorsal doku yırtmak için forceps kapatın.Tüm omurilik açılana kadar connell tarafına doğru bu işlemi tekrarlayın. Daha sonra, açık omurilik silikon karşı böylece embriyo konumlandırın. Daha sonra, vücuttan omurilik rostrad kısmını ayırmak.Omuriliğin rostrad kısmını çimdikle ve omuriliği çıkarmak için embriyoyu kafasından çekin. Omurilikte kalan menenjleri ve DRG'leri dikkatlice çekin. Silikon üzerinde omurilik düzleştirmek ve bir neşter kullanarak, her iki tarafın ortasında boyunca keserek kordon dorsal yarısını çıkarın.Orta kısmı on parçaya ayırın ve yeni bir tüpe aktarın. Omurilik hücre süspansiyon hazırlamak için, tüpün altındaki omurilik parçaları toplamak. HBSS'yi bir mililitre Ham F-10 orta ile değiştirin ve on mikrolitre tripsin ekleyin.Tüpü 37 derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Enzimatik sindirimi durdurmak için, parçaları tam L-15 orta 800 mikrolitre, 4% BSA 100 mikrolitre ve 100 mikrolitre DNA ve titrat içeren yeni bir 15 mililitre tüp, iki kez aktarın. Parçaları taze bir 15 mililitrelik tüp içinde supernatant toplamadan önce iki dakika razı olsun.Yavaşça supernatant tüp altında% 4 BSA iki mililitre ekleyin. Centro onu 470 x yerçekiminde 5 dakika kaynaştırır. 5 dakika sonra, supernatant çıkarın ve tam L-15 orta 2 mililitre ile hücre paletyeniden askıya.Motonöron zenginleştirme için, iki 15 mililitre tüpler halinde hücre süspansiyon bölün. Daha sonra, her tüp e iki mililitre L-15 PH orta ekleyin. Altı embriyo ile başlayarak, tüp başına üç embriyo eşdeğer kullanın, ve orta üç mililitre.Keskin bir arayüz elde etmek için her tüpün altına 2 mililitre yoğunluk gradience çözeltisi ekleyin. Sonra, centro oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 830 x yerçekimi sigorta. Bu adımdan sonra, küçük hücreler tüpün alt kısmında, motoneuron gibi büyük hücreler ise yoğunluk gradyan çözüm/orta arabirimde olmalıdır.Arayüzdeki hücrelerin 1 ila 2 mililitreasperae ve taze bir 15 mililitre tüp aktarın. L-15 PH orta ile on mililitre ses ayarlayın. Daha sonra, iki tüpün altına %4'lük BSA yastığının iki mililitresini ekleyin.Ve oda sıcaklığında 5 dakika 470 x yerçekiminde centro sigorta. 5 dakika sonra, supernatant çıkarın ve palet ve tam L-15 orta 3 mililitre yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında 5 dakika 470 x yerçekimi nde santrifüj tekrarlayın.Sonra, supernatant çıkarın ve hücre palet ve tam kültür orta iki mililitre askıya. Kültür motor nöronlar için, 5, 000-10, 000 hücreleri 500 mikrolitre kültür orta başına 24 kuyu plaka onları seyreltin. Daha sonra, P-1, 000 pipet ucu ile lamina çözeltisi çıkarın.Hemen kültür ortamda seyreltilmiş motor nöronları aktarın. kurumasını önlemek için kodlama plakalarına. DNA hazırlamak için, nöronal kültür ortamının 50 mikrolitresinde 1 mikrogram DNA'yı yeniden askıya alın.Ve 5 saniyelik girdap. B tüpünü hazırlamak için, nöronal kültür ortamının 50 mikrolitresinde 1,5 mikrolitre boncuk askıya alın. 50 mikrolitre DNA çözeltisine 50 mikrolitre boncuk çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın.Bu kuluçka sırasında, 100 mikrolitre kültür ortamını nakledilecek kuyudan çekin. Daha sonra, her kuyuya 100 mikrolitre DNA boncuk karışımı aktarın. Ve 24 kuyu plakasını kuluçkaya yatırın, manyetik plakada 20-30 dakika 37 santigrat derecede.Burada gösterilen, endojen non-fosforile nörofilament ağır zincir dört gün sonra ayakta tarafından ortaya modem nöron morfolojisi. Bu görüntülerde, modem nöron morfolojisi dört gün in vitro sonra göstermek ve ikinci gün magnetofection tarafından EGFP trans geni için transfected. Motto nöronlar smi-32 veya pan-nöro marker TUJ-1 ile karşı-lekeli ve oklar nöronların soma gösterir.Bu manyeto dışkılı motor nöronlar onların konfokal görüntüleri, yabani tip veya mutant EGFP NEFH yapıları ifade ve otofajik marker LC-3B için lekeli. Oklar mutant EGFP NEFH protein agregaları da LC-3B pozitif bu prosedürü takip eden göstermek, montoholda curcha akson ticareti görselleştirmek ve bazı rehberlik eklemek için video mikroskobu ile analiz edilebilir. Nöral biyolojideki temel soruları ele almak için ilk gelişiminden sonra, bu teknik aynı zamanda toksik şok sendromu hastalığı, samuel trofik lateral skleroz veya spinal müsküler atrofi gibi motonöron bozukluklarının spektrumunu kapsayan fizyopatolojik mekanizmaları keşfetmek için güçlü bir araç olduğunu kanıtlamaktadır.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Nöritik plaklar Alzheimer Hastalığı Fare Modeli Algılama

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Fare Embriyonik motor nöronlar lektin tabanlı İzolasyon ve Kültür

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Endojen NADH Floresans iki-foton Imaging tarafından Fare Serebral Korteks olarak Microregional Hipoksi Algılama

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

Sırt kök ganglion Modeli: Kanserli Sinir Invasion Vitro Modelleme

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modelleme nöronal ölüm ve fare birincil serebellar granül nöronlar dejenerasyon

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Fare birincil Oligodendrocytes hızlı ve spesifik Immunomagnetic izolasyonu

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Fare Embriyonik Kök Hücre in vitro nöronal farklılaşma

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Modeling Stroke in Mice: Focal Cortical Lesions by Photothrombosis

Farelerde Modelleme İnme: Fototomboz ile Fokal Kortikal Lezyonlar

Stroke is a leading cause of death and acquired adult disability in developed countries. Despite extensive investigation for novel therapeutic strategies, ...