Name: rapid, safe, and simple manual bedside nucleic acid extraction for the detection of virus in whole blood samples
Uploaded: 2018-06-30T15:00:00
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Wir danken Susanne Lopes Rasmussen und Solvej Kolbjørn Jensen für ihre technische Unterstützung und für den Umgang mit der klinischen Proben. Dieses Projekt ist Teil des Konsortiums EbolaMoDRAD, die Mittel aus der innovativen Medizin Initiative 2 gemeinsamen Unternehmens unter Grant Vereinbarung N ° 115843 erhalten hat. Dieses gemeinsame Unternehmen erhält Unterstützung von der Europäischen Union Horizont 2020 Forschungs- und Innovationsprogramm und EFPIA.

Der Ausschuss für biomedizinische Forschungsethik, Hauptstadtregion Einwilligung gegeben hat, und alle hier beschriebene Verfahren befreit aus einer Überprüfung durch die Ethik-Ausschuß-System gemäß dem dänischen Gesetz über Assay-Entwicklung-Projekte.
1. Vorbereitung des Vakuum Blutentnahmeröhrchen für Virus-Inaktivierung und schnellen NA-Extraktion
Achtung: Der Puffer verwendet für dieses Protokoll enthält Guanidinium-Thiocyanat (GITC) und nichtionischen...

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	<li>Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+Highly+Sensitive+Molecular+Diagnosis+of+Zika+Virus+by+Lateral+Flow+Assays.">Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays.</a> Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).</li><li>Benzine, J. W., Brown, K. 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J., Weller, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buffer+AVL+alone+does+not+inactivate+Ebola+virus+in+a+representative+clinical+sample+type.">Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).</li><li>Byrnes, S., Fan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Portable,+Pressure+Driven,+Room+Temperature+Nucleic+Acid+Extraction+and+Storage+System+for+Point+of+Care+Molecular+Diagnostics.">A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics.</a> Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).</li><li>Rosenstierne, M. 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A., Caleo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+viral+load+at+diagnosis+associates+with+patient+outcome+and+outbreak+evolution.">Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).</li><li>Hasanoglu, I., Guner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+viral+load+in+Crimean+Congo+hemorrhagic+fever.">Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever.</a> Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).</li><li>Biava, M., Colavita, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+rapid+and+sensitive+RT-qPCR+assay+for+the+detection+of+Ebola+Virus.">Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus.</a> Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).</li><li>Fern&#225;ndez-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous-flow,+microfluidic,+qRT-PCR+system+for+RNA+virus+detection.">Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).</li><li>Weller, S. A., Bailey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Biofire+FilmArray+Biothreat+E-test+(v2.5)+for+rapid+identification+of+Ebola+virus+disease+in+heat-treated+blood+samples+obtained+in+Sierra+Leone+and+United+Kingdom.">Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).</li><li>Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+the+GeneXpert+Ebola+Assay+for+Diagnosis+of+Ebola+Virus+Disease+in+Sierra+Leone:+A+Field+Evaluation+Study.">Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study.</a> PLoS Medicine. 13 (3), e1001980 (2016).</li><li>Biocartis. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test. , (2016).</li><li>MPLC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7. , (2015).</li></ol>

In diesem Bericht beschreiben wir eine sichere, schnelle und einfache manuelle am Krankenbett NA Extraktionsmethode für die nachgelagerten molekulare Erkennung eines Virus im Vollblut Lyse/Bindung Puffer inaktiviert. Die beschriebenen NA-Extraktions-Verfahren wurde entwickelt, um direkt auf Vollblut-Proben im Vakuum Blutentnahmeröhrchen, enthält die Lyse/Bindung Puffer (Table of Materials)7durchgeführt werden. Dieser spezielle Puffer inaktiviert EBOV7 u...

In Virus Ausbruch Situationen wenn Patienten auf das Krankenhaus Isolierstationen oder wenn eine schnelle Diagnose benötigt wird beschränkt sind, ist eine sichere, einfache und genaue Molekulare Diagnostik der Point-of-Care unerlässlich, dass die Patienten Pflege und Risiko Containment. Die zwei jüngsten virale Ausbrüche, das Ebola-Virus (EBOV) in Westafrika (2013) und der Zika-Virus in Südamerika (2015), haben das Interesse an verbesserte Point-of-Care Molekulare diagnostische Tests, wie z. B. reverse Transkription Schleife-vermittelten Isothermen erhöht. Verstärkung (RT-Lampe)1,2 und Rekombinase Polymerase Verstärkung (RPA)3,4. RT-Lampe und RPA sind schnelle, sensitive und spezifische Molekulare Tests, die auf vereinfachtes Beispiel Vorbereitungen durchgeführt werden können. Für das Zika-Virus wurde RT-Lampe mit einem lateralflow-Assay (LFA), kombiniert die Zika-Virus in Vollblut-gereinigte Proben innerhalb von 30 min1erkennen kann; für EBOV, das ist ein Risiko-Gruppe 4-Pathogen eingestuft und ist hoch ansteckend, die Proben müssen jedoch unter Biosafety behandelt werden Stufe 4 (BSL-4) Bedingungen und inaktiviert werden, bevor eine sichere diagnostischen Verfahren durchgeführt werden können.
Vereinfachte Inaktivierungsverfahren für EBOV, wie die Zugabe von Lyse Puffer auf die Probe2,3,4,5, dienten während des Ausbruchs; Diese Methoden erfordern jedoch Handhabung BSL-4 Bedingungen mit Laborgeräten, wie BSL-3 Biosafety Schränke, Zentrifugen, Heizblöcke und Pipetten, auf ein Minimum. Dieses Gerät ist normalerweise nicht vorhanden, Isolierstationen oder in Feldlazaretten. Um diese Herausforderung zu meistern, wurden Versuche unternommen, im Koffer3Diagnostik durchzuführen, und mehrere tragbare Geräte und Maschinen wurden entwickelt [z. B.ein tragbares Gerät zur Gewinnung von Nukleinsäure (NA)]6. EBOV-positiven Proben müssen jedoch noch inaktiviert werden, bevor diese Geräte verwendet werden können.
Wir haben zuvor eine schnelle am Krankenbett Virus-Inaktivierung-Methode zur EBOV7, Vaccinia Virus und Kuhpocken-Virus8 durch Zugabe eines kommerziellen Lyse/Bindung-Puffers zu gewöhnlichen Vakuum Blutentnahmeröhrchen, berichtet ermöglicht den direkten Übertragung von Blut aus dem Patienten in die Inaktivierung Puffer7. Diese direkte und sofortige Inaktivierung in einem geschlossenen System eliminiert die Notwendigkeit für die Proben unter Verwendung strikte Einschließung, z. B. BSL-4 Bedingungen7, Handhabung und die Proben können unter Normalbedingungen BSL-2 behandelt werden. Diese Inaktivierung Methode ist kompatibel mit mehreren NA Absauganlagen, wie Roboter und Hand-Reinigung-Kits-7; Diese Methoden erfordern jedoch Laborgeräte wie Roboter, Zentrifugen und Elektrizität, die nicht immer in den Bereich Einstellungen oder im Krankenhaus Isolierstationen vorhanden sind.
In diesem Bericht beschreiben wir eine sichere, schnelle und vereinfachte manuelle NA Extraktionsmethode für die anschließende molekulare Erkennung eines Virus im Vollblut Lyse/Bindung Puffer inaktiviert. Die NA-Extraktions-Verfahren erfordert keine Geräte außer einem Magnet/Magnethalter. Für die NA-Extraktion werden keine Zentrifugen, Heizung, Blöcke oder Strom benötigt. Daher, diese Methode ist nicht abhängig von Laboreinrichtungen und lässt sich problemlos überall (z.B.in Feldlazaretten in Isolation Krankenstationen oder mit geringen Ressourcen Einstellungen) verwendet. Die NA-Extraktions-Verfahren ist schnell und einfach und kann direkt in alle nachgelagerten NA-Tests wie qPCR, RT-qPCR, Lampe oder RT-Lampe verwendet werden. Wenn diese NA-Extraktions-Verfahren mit Lampe und ein tragbares batteriebetriebenes Isothermen Instrument kombiniert wird, erhalten Sie eine Nachttisch Diagnose innerhalb von 40 Minuten die Blutentnahme.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1080px;" width="1081">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:544px;">Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL)</td>
			<td style="width:251px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">368861</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plus Blood Collection</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">362725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">23G x 1 needle&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">300800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LUER LOK syringe (3 mL)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">309658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Butterfly needle with small-bore extension tubing</td>
			<td style="width:251px;">J&#248;rgen Kruuse A/S</td>
			<td style="width:119px;">121714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1% Virkon&#160;</td>
			<td>Nomeco A/S</td>
			<td style="width:119px;">849265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis/Binding Buffer - Refill</td>
			<td>Roche Diagnostics A/S</td>
			<td style="width:119px;">03246752001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit</td>
			<td>Roche Diagnostics A/S</td>
			<td style="width:119px;">3038505001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc&#8482; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">375418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc&#8482; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">379189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc&#8482; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">379146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DynaMag&#8482;-5 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12303D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer pipette (3.5 mL)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">86.1171.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific&#8482; Samco&#8482; Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Thermo Scientific&#8482; Nunc&#8482; 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">339652</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, safe, and simple manual bedside nucleic acid extraction for the detection of virus in whole blood samples

Die schnelle Diagnose einer Infektion ist entscheidend für den Ausbruch Management, Risiko Containment und Patientenversorgung. Wir haben zuvor eine Methode für die schnelle am Krankenbett Inaktivierung des Ebola-Virus während der Blutentnahme für sichere Nukleinsäure (NA) Tests gezeigt, indem man einen kommerziellen Lyse/Bindung Puffer direkt in das Vakuum Blutentnahmeröhrchen. Mit diesem Ansatz am Krankenbett Inaktivierung, entwickelten wir eine sichere, schnelle und vereinfachte am Krankenbett NA Extraktionsmethode für die spätere Entdeckung eines Virus im Vollblut Lyse/Bindung Puffer inaktiviert. Die NA-Extraktion erfolgt direkt in die Blutentnahmeröhrchen und erfordert keine Ausrüstung oder Strom.
Nachdem das Blut in den Lyse/Bindung Puffer gesammelt, die Inhalte werden durch Umklappen das Rohr von hand gemischt und die Mischung wird für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Magnetische Glaspartikeln (Map) werden hinzugefügt, um das Rohr, und der Inhalt sind durch Umklappen das sammelröhrchen von hand gemischt. Die Map werden dann auf der Seite das blutsammelröhrchen mit einem Magnethalter oder ein Magnet und ein Gummiband gesammelt. Die Map werden dreimal gewaschen, und nach der Zugabe der Elution Puffer direkt in das sammelröhrchen, die NAs sind bereit für NA-Tests, wie qPCR oder Isothermen Schleife Verstärkung (Lampe), ohne die Entfernung von der Map aus der Reaktion. Die NA-Extraktions-Verfahren ist nicht abhängig von jedem Laboreinrichtungen und lässt sich problemlos überall (z.B.in Feldlazaretten und Krankenhaus Isolierstationen) verwendet. Wenn diese NA-Extraktions-Verfahren mit Lampe und ein tragbares Gerät kombiniert wird, erhalten Sie eine Diagnose innerhalb von 40 Minuten die Blutentnahme.

Die hier vorgestellten Protokoll ist einfach und effizient und kann auch im großen und ganzen auf eine molekulare Assay auf infektiöse Vollblut Proben mit dem Puffer Lyse/Bindung inaktiviert durchgeführt werden. Der Workflow für die Inaktivierung von Blut und NA-Extraktion ist in Abbildung 1, einschließlich der Vorbereitung von Blut Sammlung Vakuumröhren7 (Abbildung 1A), die Blut Sammlung<sup class="...

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Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die schnelle Virus Nukleinsäure-Extraktion aus der Vollblut-Virus inaktiviert. Die Extraktion erfolgt direkt in die Blutentnahmeröhrchen und erfordert keine Ausrüstung oder Strom. Die Methode ist nicht abhängig von Laboreinrichtungen und kann überall (z.B.in Feldlazaretten) verwendet.

Schnelle, sichere und einfache manuelle am Krankenbett Nukleinsäure-Extraktion für den Nachweis des Virus in Vollblut-Proben

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

This method can help when performing point of care diagnostics, of patients with signs of viral infections. The main advantage of this technique is that it can be performed without laboratory equipment and electricity, and hence it can be performed in a hospital ward. Demonstrating the blood collection procedure, will be Medical Doctor Anders Fomsgaard, and Scientist Morten Rasmussen, both from my laboratory.Begin by preparing the blood collection tubes. Use a 25 gauge one inch needle attached to a 3ML syringe, to inject 1.6ML of a commercial lysis buffer into a 4ML EDTA vacuum tube. It is critical to maintain the vacuum in the blood collection tube for blood collection.Hence, always use a needle to inject the lysis buffer into the blood collection tube. Next completely re-suspend a 960 micro-liter volume of magnetic glass particles, or MGPs, and transfer to a labeled 1.8ML tube. Next pipet 4ML of wash buffer one into a 4.5ML tube labeled WB-1.1.5ML of wash buffer two into a 3.6ML tube labeled WB-2, and 3ML of wash buffer three into a 4.5ML tube labeled WB-3.Finally add 100 micro-liters of elution buffer to a 1.8ML tube labeled EB, and leave the tubes at room temperature until use. To collect intravenous whole blood from the patient, use a butterfly needle with a small bore extension tubing, and one of the previously prepared blood collection vacuum tubes containing lysis buffer. Rest the patient's arm in a downward position.Insert the butterfly needle into the vein of the patient, and attach the blood collection vacuum tube to the small bore extension. After blood collection mix the contents of the tube, by flipping the tube five to ten times. Disinfect the outside of the tube using 70%ethanol.Then incubate the tubes for 20 minutes at room temperature for virus inactivation. To purify nucleic acids from the collected blood, again mix the contents of the tube by flipping the vacuum tube by hand five to ten times. Pour the prepared aliquot of MGP's directly into the blood collection tube.The place a new lid from an unused blood collection tube on the tube containing the sample. Place a finger on the lid to ensure that the tube is tightly closed, and mix the contents of the tube by flipping five to ten times. Place the tube in the magnetic holder and keep a finger on the lid, to ensure the tube is tightly closed.Then flip the magnetic holder with the tube a few times to disperse the MGP's before they collect on the side of the tube with the magnet. Remove the lid of the tube, and discard the contents of the tube into a 50ML collection tube, using a disposable pipet. Pour the prepared aliquot of WB-1 directly into the blood collection tube and close the lid on the tube.Mix the content by hand five to ten times. Then collect the beads at the side of the tube, using the magnet and remove the liquid as before. Re-suspend the beads in the prepared aliquot of WB-2, then discard the solution, and repeat the procedure with a prepared aliquot of WB-3.Finally, remove the tube from the magnetic holder and pour the prepared aliquot of EB directly into the blood collection tube. Place the lid on the tube, and re-suspend the MGP's by tapping five to ten times with a finger. Finally, use a 1.5ML disposable pipet to transfer one droplet of the re-suspended MGP's to the downstream nucleic acid amplification reaction mix.Be sure to fully re-suspend the MGP's before transferring only one droplet into the PCR reaction. To demonstrate proof of concept, negative whole blood was spiked with 10 fold dilutions of the Ebola virus standard, prepared from the recent outbreak in southern Guinea, or three different concentrations of Epstein Barr virus. The extracted nucleic acids were analyzed by in-house virus specific R2 qPCR or qPCR.The lower the crossing threshold, or CT, the higher the viral genome copy number. Here, whole bloods spiked with different concentrations of Ebola virus was detected by an Ebola virus specific lamp. The final concentration of virus in the spiked whole blood sample is seen on the X axis, and the minutes to positive is seen on the Y axis.Here, whole blood was spiked with 10 fold dilutions of a hepatitis C WHO standardized serum sample, with detection by HCV specific RT qPCR. Finally, this image shows the results of an Epstein Barr virus specific lamp reaction, on Epstein Barr virus positive whole blood. While attempting this procedure it's important to use the specified lysis binding buffer.This is a crucial step, and a crucial re-agent for the method. This lysis binding buffer will inactivate virus in the sample. Following this technique you can perform different molecular detection methods like lamp and PCR, and hence you can perform a differential diagnosis.

Research

JoVE Journal

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Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

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This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Forschung

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Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

Locked Nucleic Acid Durchflusszytometrie-Fluoreszenz In situ Hybridisierung (LNA Flow-FISH): Eine Methode für die bakterielle RNA-Detektion

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

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A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Eine einfache und effiziente Methode zu konstruieren Mutant Vacciniavirusvektoren

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