Name: rapid, safe, and simple manual bedside nucleic acid extraction for the detection of virus in whole blood samples
Uploaded: 2018-06-30T15:00:00
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その技術支援と臨床サンプルの処理のスザンヌは軽やかに駆けるラスムッセンと Solvej Kolbjørn ジェンセンに感謝しますこのプロジェクトは、革新的な医学イニシアティブ 2 共同事業助成契約 N ° 115843 下から資金を受けている EbolaMoDRAD コンソーシアムの一部です。この共同事業は、欧州連合のホライゾン 2020年研究とイノベーション プログラムおよび舵からサポートを受け取ります。

生物医学研究倫理委員会、首都圏は、インフォームド コンセントを与えているし、ここで説明したすべてのメソッドは、アッセイ開発プロジェクトに関するデンマークの法律に従って、倫理委員会システムによってレビューから除外されています。
1. ウイルス不活化と急速な NA 抽出真空採血管の準備
注意: このプロトコルに使用されるバッファーに?...

<ol>
	<li>Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+Highly+Sensitive+Molecular+Diagnosis+of+Zika+Virus+by+Lateral+Flow+Assays.">Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays.</a> Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).</li><li>Benzine, J. W., Brown, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Diagnostic+Field+Test+for+Point-of-Care+Detection+of+Ebola+Virus+Directly+from+Blood.">Molecular Diagnostic Field Test for Point-of-Care Detection of Ebola Virus Directly from Blood.</a> Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 3), S234-S242 (2016).</li><li>Faye, O., Faye, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+deployment+of+a+rapid+recombinase+polymerase+amplification+Ebola+virus+detection+assay+in+Guinea+in+2015.">Development and deployment of a rapid recombinase polymerase amplification Ebola virus detection assay in Guinea in 2015.</a> Euro Surveillance. 20 (44), 10-18 (2015).</li><li>Yang, M., Ke, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Evaluation+of+a+Rapid+and+Sensitive+EBOV-RPA+Test+for+Rapid+Diagnosis+of+Ebola+Virus+Disease.">Development and Evaluation of a Rapid and Sensitive EBOV-RPA Test for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Smither, S. J., Weller, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buffer+AVL+alone+does+not+inactivate+Ebola+virus+in+a+representative+clinical+sample+type.">Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).</li><li>Byrnes, S., Fan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Portable,+Pressure+Driven,+Room+Temperature+Nucleic+Acid+Extraction+and+Storage+System+for+Point+of+Care+Molecular+Diagnostics.">A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics.</a> Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).</li><li>Rosenstierne, M. W., Karlberg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+bedside+inactivation+of+Ebola+virus+for+safe+nucleic+acid+tests.">Rapid bedside inactivation of Ebola virus for safe nucleic acid tests.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (10), 2521-2529 (2016).</li><li>Vinner, L., Fomsgaard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+orthopoxvirus+for+diagnostic+PCR+analysis.">Inactivation of orthopoxvirus for diagnostic PCR analysis.</a> Journal of Virological Methods. 146, 401-404 (2007).</li><li>Schmitz, H., K&#246;hler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+clinical+and+laboratory+data+in+two+cases+of+imported+Lassa+fever.">Monitoring of clinical and laboratory data in two cases of imported Lassa fever.</a> Microbes and Infection. 4 (1), 43-50 (2002).</li><li>De La Vega, M. A., Caleo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+viral+load+at+diagnosis+associates+with+patient+outcome+and+outbreak+evolution.">Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).</li><li>Hasanoglu, I., Guner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+viral+load+in+Crimean+Congo+hemorrhagic+fever.">Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever.</a> Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).</li><li>Biava, M., Colavita, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+rapid+and+sensitive+RT-qPCR+assay+for+the+detection+of+Ebola+Virus.">Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus.</a> Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).</li><li>Fern&#225;ndez-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous-flow,+microfluidic,+qRT-PCR+system+for+RNA+virus+detection.">Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).</li><li>Weller, S. A., Bailey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Biofire+FilmArray+Biothreat+E-test+(v2.5)+for+rapid+identification+of+Ebola+virus+disease+in+heat-treated+blood+samples+obtained+in+Sierra+Leone+and+United+Kingdom.">Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).</li><li>Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+the+GeneXpert+Ebola+Assay+for+Diagnosis+of+Ebola+Virus+Disease+in+Sierra+Leone:+A+Field+Evaluation+Study.">Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study.</a> PLoS Medicine. 13 (3), e1001980 (2016).</li><li>Biocartis. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test. , (2016).</li><li>MPLC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7. , (2015).</li></ol>

本報告で述べる安全、迅速かつ簡単なマニュアル ベッドサイド NA 抽出換/結合バッファー不活化全血中のウイルスの下流分子検出のため。換/結合バッファー (材料表)7を含む真空採血管で収集された全血サンプルで直接実行するのに記載されている NA 抽出法が開発されました。この特定のバッファー EBOV7を不活性化し、メソッドの重要なコン?...

ウイルスの発生状況は、患者が隔離病棟または迅速な診断が必要な場合に限られているとき、安全で簡単、かつ正確なポイント ・ オブ ・ ケアの分子診断は患者のケアとリスクの封じ込めのため不可欠です。2 つウイルスの最近の発生、エボラ出血熱ウイルス (EBOV) 西アフリカ (2013)、南アメリカ (2015)、ジカの改善ポイント ・ オブ ・ ケアの診断テスト分子、逆のトランスクリプションのループを介した等温などに対する関心が高まってください。増幅 (RT ランプ)1,2編シュプリンガー ・ ポリメラーゼ増幅 (RPA)3,4。RT ランプ、RPA は、簡単なサンプル準備を行うことが急速な敏感な特定の分子テストです。ジカ ウイルスの RT ランプは 30 分1; 内非精製の全血試料中ジカ ウイルスを検出することができます側方流動試金 (LFA) と結合されていますただし、リスク グループ 4 病原体として分類される、非常に伝染性、EBOV のサンプルは、バイオ セーフティの下で処理する必要がある 4 (BSL-4) 条件、任意の安全な診断手順を実行前に不活化します。
EBOV、3,2,54,サンプル、換散バッファーの追加など簡略化された不活化方法が発生; 中に使用されました。ただし、これらのメソッドには、BSL 3 バイオ セーフティ キャビネット、遠心分離機、加熱ブロック、最低、ピペットなどの実験装置と BSL 4 条件下で処理が不要です。病棟別や野戦病院でこの装置は通常ありません。このような課題を克服するために、スーツケース3診断を実行する試みがなされ、いくつかのポータブル デバイスとマシンを開発 [例えば核酸 (NA) 抽出のためのポータブル デバイス] されている6。ただし、この EBOV 肯定的なサンプルは、これらのデバイスを使用することができます前に不活化する必要があります。
について報告した急速なベッドサイド ウイルス不活化法による EBOV7、ワクシニア ウイルス、牛痘ウイルス8商業換/結合バッファーの添加による普通の真空採血管に直接を可能にします。患者から不活化バッファー7へ血液の転送。クローズド システムのこの直接および即時の不活化 BSL 4 条件7など、厳密な包含を使用してサンプルを処理する必要がある、通常の BSL 2 条件下でサンプルを処理できます。この不活化方法はロボットや手浄化キット7など、いくつかの NA 抽出システムとの互換性ただし、これらのメソッドには、実験装置、ロボット、遠心分離機、や電気のフィールドの設定または隔離病棟内存在とは限らないなどが必要があります。
本報告で述べる安全・迅速かつ簡易マニュアル NA 抽出換/結合バッファー不活化全血中のウイルスのそれに続く分子検出のため。NA の抽出法では、マグネット ・ マグネット ホルダー以外の装備は必要ありません。NA を抽出するための遠心分離機、ブロック、または電気暖房は不要です。したがって、このメソッドは実験施設に依存しないとすることができます簡単に任意の場所 (例えば、野戦病院、病棟の分離または低リソースの設定で) 使用します。NA 抽出法は、迅速かつ簡単な qPCR、RT qPCR、ランプ、または RT ランプなどのすべてのダウン ストリーム NA テストで直接使用することができます。この NA 抽出法をランプとポータブル バッテリー駆動の恒温器と組み合わせれば、血液のコレクション 40 分内ベッドサイド診断を取得できます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1080px;" width="1081">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:544px;">Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL)</td>
			<td style="width:251px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">368861</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plus Blood Collection</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">362725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">23G x 1 needle&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">300800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LUER LOK syringe (3 mL)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">309658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Butterfly needle with small-bore extension tubing</td>
			<td style="width:251px;">J&#248;rgen Kruuse A/S</td>
			<td style="width:119px;">121714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1% Virkon&#160;</td>
			<td>Nomeco A/S</td>
			<td style="width:119px;">849265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis/Binding Buffer - Refill</td>
			<td>Roche Diagnostics A/S</td>
			<td style="width:119px;">03246752001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit</td>
			<td>Roche Diagnostics A/S</td>
			<td style="width:119px;">3038505001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc&#8482; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">375418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc&#8482; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">379189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc&#8482; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">379146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DynaMag&#8482;-5 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12303D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer pipette (3.5 mL)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">86.1171.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific&#8482; Samco&#8482; Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Thermo Scientific&#8482; Nunc&#8482; 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">339652</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, safe, and simple manual bedside nucleic acid extraction for the detection of virus in whole blood samples

アウトブレイク管理、リスクの抑制、および患者のケアのための感染症の迅速診断が欠かせません。以前、真空採血管に直接商業換/結合バッファーを追加することによって安全な核酸 (NA) テストのための血液採取中にエボラ ウイルスの急速なベッドサイド不活性化する方法を示しました。このベッドサイド不活化アプローチを使用して、我々 手法を開発した安全、迅速かつ簡単なベッドサイド NA 抽出換/結合バッファー不活化全血中のウイルスの後続の検出。NA の抽出は、採血管で直接実行され、機器や電気を必要としません。
換/結合バッファーには採血後チューブを手で弾くことによってのコンテンツが混在し、混合物は室温で 20 分間インキュベートします。チューブに磁性ガラス粒子 (MGPs) が追加され、コレクション チューブを手で弾くことによってのコンテンツが混在します。ゴムや磁石マグネット ホルダーを使用して、採血管の側面に、MGPs を収集します。MGPs 3 回洗浄し、コレクションの管に直接溶出バッファーの追加により、NAs NA 試験、qPCR 反応から MGPs を取り外すことがなく等温ループ増幅 (ランプ) などの準備が整います。NA の抽出法があらゆる所に依存しないと簡単にすることができます (例えば、野戦病院の隔離病棟) どこでも使用されます。この NA 抽出法をランプとポータブル機器と組み合わせれば、血液のコレクション 40 分以内で診断が可能です。

ここで提示されたプロトコルは単純で効率的と換/結合バッファーで不活化感染全血サンプルで実行される任意の分子アッセイに広く適用できます。血の不活性化および NA 抽出のワークフローはに示す図 1血コレクション真空管7 (図 1 a)、血液コレクション7 (図 1 b)?...

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Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

ここでは、ウイルス不活化全血から急速なウイルス核酸抽出のためのプロトコルを提案する.抽出は、採血管に直接行い機器や電気を必要としません。メソッドは実験施設に依存しないとすることができます (例えば、野戦病院で) どこでも使用されます。

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