Name: rapid, safe, and simple manual bedside nucleic acid extraction for the detection of virus in whole blood samples
Uploaded: 2018-06-30T15:00:00
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그들의 기술 지원 및 임상 샘플 처리에 대 한 우리 감사 수잔 달리기 라 스무 센 및 Solvej Kolbjørn 젠 슨. 이 프로젝트는 혁신적인 의학 이니셔티브 2 공동 사업 보조금 계약 N ° 115843 아래에서 자금을 받고 있다 EbolaMoDRAD 컨소시엄의 일부입니다. 이 공동 사업 유럽 연합의 지평선 2020 연구와 혁신 프로그램 EFPIA에서 지원을 받습니다.

생명 의학 연구 윤리 위원회, 수도권은 동의 그리고 여기에 설명 된 모든 방법을 분석 결과 개발 프로젝트에 덴마크 법률에 따라 윤리 위원회 시스템에 의해 검토에서 제외 된.
1. 바이러스 비활성화 및 빠른 나 추출을 위한 혈액 컬렉션 진공관의 준비
주의:이 프로토콜에 사용 되는 버퍼 guanidinium 안산 (GITC)과 비 이온 계면 활성 제, irritants을 포함 되어 있습?...

<ol>
	<li>Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+Highly+Sensitive+Molecular+Diagnosis+of+Zika+Virus+by+Lateral+Flow+Assays.">Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays.</a> Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).</li><li>Benzine, J. W., Brown, K. 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J., Weller, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buffer+AVL+alone+does+not+inactivate+Ebola+virus+in+a+representative+clinical+sample+type.">Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).</li><li>Byrnes, S., Fan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Portable,+Pressure+Driven,+Room+Temperature+Nucleic+Acid+Extraction+and+Storage+System+for+Point+of+Care+Molecular+Diagnostics.">A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics.</a> Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).</li><li>Rosenstierne, M. W., Karlberg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+bedside+inactivation+of+Ebola+virus+for+safe+nucleic+acid+tests.">Rapid bedside inactivation of Ebola virus for safe nucleic acid tests.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (10), 2521-2529 (2016).</li><li>Vinner, L., Fomsgaard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+orthopoxvirus+for+diagnostic+PCR+analysis.">Inactivation of orthopoxvirus for diagnostic PCR analysis.</a> Journal of Virological Methods. 146, 401-404 (2007).</li><li>Schmitz, H., K&#246;hler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+clinical+and+laboratory+data+in+two+cases+of+imported+Lassa+fever.">Monitoring of clinical and laboratory data in two cases of imported Lassa fever.</a> Microbes and Infection. 4 (1), 43-50 (2002).</li><li>De La Vega, M. A., Caleo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+viral+load+at+diagnosis+associates+with+patient+outcome+and+outbreak+evolution.">Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).</li><li>Hasanoglu, I., Guner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+viral+load+in+Crimean+Congo+hemorrhagic+fever.">Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever.</a> Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).</li><li>Biava, M., Colavita, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+rapid+and+sensitive+RT-qPCR+assay+for+the+detection+of+Ebola+Virus.">Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus.</a> Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).</li><li>Fern&#225;ndez-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous-flow,+microfluidic,+qRT-PCR+system+for+RNA+virus+detection.">Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).</li><li>Weller, S. A., Bailey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Biofire+FilmArray+Biothreat+E-test+(v2.5)+for+rapid+identification+of+Ebola+virus+disease+in+heat-treated+blood+samples+obtained+in+Sierra+Leone+and+United+Kingdom.">Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).</li><li>Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+the+GeneXpert+Ebola+Assay+for+Diagnosis+of+Ebola+Virus+Disease+in+Sierra+Leone:+A+Field+Evaluation+Study.">Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study.</a> PLoS Medicine. 13 (3), e1001980 (2016).</li><li>Biocartis. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test. , (2016).</li><li>MPLC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7. , (2015).</li></ol>

이 보고서에서 우리는, 신속, 안전 하 고 간단한 수동 침대 나 추출 방법 세포/바인딩 버퍼 비활성화 전체 혈액에서 바이러스의 다운스트림 분자 검출에 대 한 설명합니다. 직접 세포/바인딩 버퍼 (자료 테이블)7를 포함 하는 진공 혈액 컬렉션 튜브에 수집 된 전체 혈액 샘플에 수행 되어야 할 설명된 나 추출 방법 개발 되었다. 이 특정 버퍼 EBOV7 생긴...

바이러스 발생 상황에서 환자 병원 격리 병 동 또는 때 빠른 진단이 필요 하 고에 수감 되는 때, 간단 하 고, 안전 하 고 정확한 포인트의 케어 분자 진단 환자 관리 및 위험 포함에 대 한 필수적입니다. 에볼라 바이러스 (EBOV) 서 부 아프리카 (2013) 및 남미 (2015), Zika 바이러스의 2 개의 최근 바이러스 발생, 향상 된 관리 포인트 분자 진단 테스트, 반전 녹음 방송 루프 중재 등온 등에 대 한 관심 증가 증폭 (RT-램프)1,2 , recombinase 중 합 효소 증폭 (RPA)3,4. RT-램프와 RPA는 단순화 된 샘플 준비에 수행할 수 있는 빠른, 민감한, 그리고 특정 분자 테스트. Zika 바이러스에 대 한 실시간 램프는 측면 흐름 분석 결과 (LFA), 30 분1; 내 정화 비 전체 혈액 샘플에서 Zika 바이러스를 검출할 수 있는 결합 되었습니다. 그러나, 위험 그룹 4 병원 체로 분류 되는 매우 전염성이 EBOV 샘플 biosafety 아래 처리 될 필요 레벨 4 (BSL-4) 조건 및 안전 진단 절차를 수행할 수 있습니다 전에 비활성화.
단순화 된 비활성화 방법 EBOV, 샘플2,3,,45에 세포의 용 해 버퍼의 추가 같은 발발; 하는 동안 사용 되었다 그러나, 이러한 방법을 BSL-3 biosafety 캐비닛, 원심 분리기, 난방 블록 및 펫, 최소한 같은 실험실 장비와 BSL-4 조건 하에서 처리를 해야합니다. 이 장비는 격리 병 동에 또는 필드 병원에 일반적으로 존재. 이 문제를 해결 하려면 시도에 가방3, 진단 수행 되었습니다 되며 여러 휴대용 장치 및 기계 개발 [예를 들어, (나) 핵 산 추출에 대 한 휴대용 장치]6. 그러나, EBOV 긍정적인 샘플 여전히이 장치를 사용할 수 있습니다 비활성화 될 필요 합니다.
우리가 이전에 보고 된 EBOV7, Vaccinia 바이러스 및 Cowpox 바이러스8 에 대 한 신속한 머리 맡 바이러스 비활성화 방법 상업 세포/바인딩 버퍼의 추가 의해 일반 진공 혈액 컬렉션 튜브를 직접 허용 양도 혈액 환자에서 비활성화 버퍼7에. 어떤 엄격한 봉쇄, BSL-4 조건7, 등을 사용 하 여 샘플 처리에 대 한 필요성을 제거 하는 닫힌된 시스템에서이 직접적이 고 즉각적인 비활성화 하 고 샘플 정상적인 BSL-2 조건 하에서 처리 될 수 있습니다. 이 비활성화 방법은 여러 나 추출 시스템, 로봇 등 손 정화 키트7;와 호환 그러나, 이러한 방법은 항상 병원 격리 병 동 내부 또는 필드 설정에 존재 하지 않는 로봇, 원심 분리기, 전기, 등 실험실 장비가 필요 합니다.
이 보고서에서 우리는, 신속, 안전 하 고 단순화 된 수동 나 추출 방법 세포/바인딩 버퍼 비활성화 전체 혈액에서 바이러스의 후속 분자 검출에 대 한 설명합니다. 나 추출 방법에는 어떤 장비의 자석/자석 홀더 필요 하지 않습니다. 아니 원심 분리기, 블록, 또는 전기 난방 나 추출 필요 합니다. 따라서,이 방법은 실험실 시설에 의존 하지 않습니다 하 고 쉽게 될 수 있다 (예를 들어, 필드 병원, 병원 격리 병 동, 또는 낮은 리소스 설정을) 어디서 나 사용할. 나 추출 방법 신속 하 고 간단 하 고 모든 다운스트림 나 테스트, 정량, 실시간 정량, 램프, 또는 RT 램프 등에서 직접 사용할 수 있습니다. 이 나 추출 방법은 램프와 휴대용 배터리 구동 등온선 악기와 결합 하면 머리 맡 진단 혈액 컬렉션의 40 분 이내 얻어질 수 있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1080px;" width="1081">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:544px;">Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL)</td>
			<td style="width:251px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">368861</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plus Blood Collection</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">362725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">23G x 1 needle&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">300800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LUER LOK syringe (3 mL)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">309658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Butterfly needle with small-bore extension tubing</td>
			<td style="width:251px;">J&#248;rgen Kruuse A/S</td>
			<td style="width:119px;">121714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1% Virkon&#160;</td>
			<td>Nomeco A/S</td>
			<td style="width:119px;">849265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis/Binding Buffer - Refill</td>
			<td>Roche Diagnostics A/S</td>
			<td style="width:119px;">03246752001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit</td>
			<td>Roche Diagnostics A/S</td>
			<td style="width:119px;">3038505001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc&#8482; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">375418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc&#8482; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">379189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc&#8482; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">379146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DynaMag&#8482;-5 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12303D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer pipette (3.5 mL)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">86.1171.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific&#8482; Samco&#8482; Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Thermo Scientific&#8482; Nunc&#8482; 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">339652</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, safe, and simple manual bedside nucleic acid extraction for the detection of virus in whole blood samples

감염의 급속 한 진단 발발 관리, 위험 봉쇄, 그리고 환자 치료를 위해 필수적 이다. 우리 이전 진공 혈액 컬렉션 튜브에 직접 상업 세포/바인딩 버퍼를 추가 하 여 안전한 핵 산 (나) 테스트를 위한 혈액 샘플링 동안 에볼라 바이러스의 급속 한 머리 맡 비활성화 하는 방법을 나타났습니다. 이 침대 비활성화 접근을 사용 하 여, 신속, 안전 하 고 단순화 된 머리 맡 나 추출 방법 세포/바인딩 버퍼 비활성화 전체 혈액에서 바이러스의 후속 검색에 대 한 개발 했습니다. 나 추출 혈액 컬렉션 튜브에서 직접 수행 하 고 아무 장비 또는 전기를 요구 한다.
혈액 세포/바인딩 버퍼에 수집 후 내용을 손으로 튜브를 틀 지 하 여 혼합 하 고 혼합물은 실 온에서 20 분 동안 알을 품을. 자석 유리 입자 (MGPs) 튜브에 추가 되 고 내용을 손으로 컬렉션 튜브를 틀 지 하 여 혼합 됩니다. MGPs는 다음 자석 홀더 또는 자석 및 고무 밴드를 사용 하 여 혈액 컬렉션 튜브 측에 수집 됩니다. MGPs는 세 번 씻어 그리고 컬렉션 튜브에 직접 차입 버퍼의 추가, NAs 나 테스트, 정량 등의 반응에서 MGPs 제거 없이 등온선 루프 증폭 (램프)에 대 한 준비가. 나 추출 메서드는 모든 실험실 시설에 의존 하지 않으며 쉽게 될 수 있다 (예를 들어, 필드 병원 및 병원 격리 병 동에서) 어디서 나 사용할. 이 나 추출 방법은 램프 및 휴대용 악기와 결합 하면 진단 혈액 컬렉션의 40 분 이내 얻어질 수 있다.

여기에 제시 된 프로토콜 간단 하 고 효율적 이며 세포/바인딩 버퍼와 비활성화 전염 성 전체 혈액 샘플에 수행 되어야 할 모든 분자 분석 결과에 광범위 하 게 적용할 수 있습니다. 혈액 비활성화 및 나 추출에 대 한 워크플로 나온 그림 1혈액 컬렉션 진공관7 (그림 1A), 혈액 컬렉션7 (<strong clas...

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Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

여기, 우리는 바이러스 비활성화 전체 혈액에서 급속 한 바이러스 핵 산 추출에 대 한 프로토콜을 제시. 추출 혈액 컬렉션 튜브에 직접 수행 되 고 필요 없는 장비 또는 전기. 방법과 실험실 시설에 의존 하지 않습니다 수 있습니다 어디서 나 (예를 들어, 필드 병원에서) 사용.

전체 혈액 샘플에서 바이러스의 검출, 안전, 신속 하 고 간단한 수동 침대 핵 산 추출

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

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