Name: rapid, safe, and simple manual bedside nucleic acid extraction for the detection of virus in whole blood samples
Uploaded: 2018-06-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples at JoVE.com

Vi takker Susanne Lopes Rasmussen og Solvej Kolbjørn Jensen for deres kundestøtte og håndtering klinisk prøvene. Dette prosjektet er en del av EbolaMoDRAD consortium, som har mottatt finansiering fra den nyskapende medisin initiativ 2 felles oppgave under grant avtalen N ° 115843. Denne felles forpliktelsen mottar støtte fra EUs horisonten 2020 forskning og innovasjon programmet og EFPIA.

Komiteen for biomedisinsk forskning etikk, regioner har gitt samtykke, og alle metodene som er beskrevet her har vært fritatt fra en gjennomgang av etiske komiteen systemet, i henhold til danske analysen utviklingsprosjekter.
1. utarbeidelse av blod samling vakuum-rør for Virus deaktivering og rask NA utvinning
FORSIKTIG: Bufferen for denne protokollen inneholder guanidinium thiocyanate (GITC) og en ikke-ioniske surfactant, som er irriterende. Ta riktige laboratoriu...

<ol>
	<li>Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+Highly+Sensitive+Molecular+Diagnosis+of+Zika+Virus+by+Lateral+Flow+Assays.">Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays.</a> Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).</li><li>Benzine, J. W., Brown, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Diagnostic+Field+Test+for+Point-of-Care+Detection+of+Ebola+Virus+Directly+from+Blood.">Molecular Diagnostic Field Test for Point-of-Care Detection of Ebola Virus Directly from Blood.</a> Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 3), S234-S242 (2016).</li><li>Faye, O., Faye, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+deployment+of+a+rapid+recombinase+polymerase+amplification+Ebola+virus+detection+assay+in+Guinea+in+2015.">Development and deployment of a rapid recombinase polymerase amplification Ebola virus detection assay in Guinea in 2015.</a> Euro Surveillance. 20 (44), 10-18 (2015).</li><li>Yang, M., Ke, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Evaluation+of+a+Rapid+and+Sensitive+EBOV-RPA+Test+for+Rapid+Diagnosis+of+Ebola+Virus+Disease.">Development and Evaluation of a Rapid and Sensitive EBOV-RPA Test for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Smither, S. J., Weller, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buffer+AVL+alone+does+not+inactivate+Ebola+virus+in+a+representative+clinical+sample+type.">Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).</li><li>Byrnes, S., Fan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Portable,+Pressure+Driven,+Room+Temperature+Nucleic+Acid+Extraction+and+Storage+System+for+Point+of+Care+Molecular+Diagnostics.">A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics.</a> Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).</li><li>Rosenstierne, M. W., Karlberg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+bedside+inactivation+of+Ebola+virus+for+safe+nucleic+acid+tests.">Rapid bedside inactivation of Ebola virus for safe nucleic acid tests.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (10), 2521-2529 (2016).</li><li>Vinner, L., Fomsgaard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+orthopoxvirus+for+diagnostic+PCR+analysis.">Inactivation of orthopoxvirus for diagnostic PCR analysis.</a> Journal of Virological Methods. 146, 401-404 (2007).</li><li>Schmitz, H., K&#246;hler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+clinical+and+laboratory+data+in+two+cases+of+imported+Lassa+fever.">Monitoring of clinical and laboratory data in two cases of imported Lassa fever.</a> Microbes and Infection. 4 (1), 43-50 (2002).</li><li>De La Vega, M. A., Caleo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+viral+load+at+diagnosis+associates+with+patient+outcome+and+outbreak+evolution.">Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).</li><li>Hasanoglu, I., Guner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+viral+load+in+Crimean+Congo+hemorrhagic+fever.">Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever.</a> Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).</li><li>Biava, M., Colavita, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+rapid+and+sensitive+RT-qPCR+assay+for+the+detection+of+Ebola+Virus.">Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus.</a> Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).</li><li>Fern&#225;ndez-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous-flow,+microfluidic,+qRT-PCR+system+for+RNA+virus+detection.">Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).</li><li>Weller, S. A., Bailey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Biofire+FilmArray+Biothreat+E-test+(v2.5)+for+rapid+identification+of+Ebola+virus+disease+in+heat-treated+blood+samples+obtained+in+Sierra+Leone+and+United+Kingdom.">Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).</li><li>Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+the+GeneXpert+Ebola+Assay+for+Diagnosis+of+Ebola+Virus+Disease+in+Sierra+Leone:+A+Field+Evaluation+Study.">Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study.</a> PLoS Medicine. 13 (3), e1001980 (2016).</li><li>Biocartis. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test. , (2016).</li><li>MPLC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7. , (2015).</li></ol>

I denne rapporten beskriver vi en trygg, rask og enkel manuell sengen NA utvinning metode for nedstrøms molekylær påvisning av virus i lyse binding buffer-inaktivert fullblod. Beskrevet NA utvinning metoden ble utviklet for å utføres direkte på hele blodprøver i vakuum blod samling rør som inneholder lysis binding buffer (Tabell for materiale)7. Denne tjenestespesifikke bufferen deaktiverer EBOV7 og er den kritiske komponenten i metoden. Etter samli...

I virus utbrudd situasjoner når pasienter er begrenset til sykehus isolasjon avdelingene eller når en rask diagnose er nødvendig, er en sikker, enkel og nøyaktig point-of-care molekylær diagnose viktig for pasienten omsorg og risiko kontroll. De to siste virale utbruddene, Ebolaviruset (EBOV) i Vest-Afrika (2013) og Zika viruset i Sør-Amerika (2015), har økt interessen for forbedret point-of-care molekylær diagnostiske tester, som omvendt transkripsjon loop-mediert isotermiske forsterkning (RT-lampe)1,2 og recombinase utvalg forsterkning (RPA)3,4. Både RT-lampe og RPA er rask, følsom og spesifikk molekylær tester som kan utføres på forenklet eksempel forberedelser. Zika viruset, har RT-lampen vært kombinert med en lateral flyt analyse (LFA), som kan oppdage Zika virus i ikke-renset hele blodprøver innen 30 min1; men for EBOV, som er klassifisert som en risiko gruppe 4 patogen og er svært smittsom, prøvene skal håndteres under biosikkerhet nivå 4 (BSL-4) forhold og deaktiveres før alle trygt diagnostiske prosedyrer kan utføres.
Forenklet inaktivering metoder for EBOV, som tillegg av lysis buffere til eksempel2,3,4,5, ble brukt under utbruddet; men krever metodene håndtering under BSL-4 forhold laboratorium utstyr, slik som BSL-3 biosikkerhet skap, sentrifuger, oppvarming blokker og Pipetter, minst. Dette utstyret er normalt ikke finnes i isolasjon avdelinger eller ut i feltsykehus. For å overvinne denne utfordringen, forsøk har blitt gjort å utføre diagnostikk i kofferter3, og flere bærbare enheter og apparater har vært utviklet [f.eksen bærbar enhet for nukleinsyre (NA) utvinning]6. Men må EBOV-positive prøver fortsatt deaktiveres før disse enhetene kan brukes.
Vi har tidligere rapportert en rask sengen virus inaktivering metode for EBOV7, Vaccinia virus og Cowpox virus8 av tillegg av en kommersiell lysis binding buffer til vanlige vakuum blod samling rør, tillater for direkte overføring av blod fra pasienten i inaktivering buffer7. Denne direkte og umiddelbar inaktivering i et lukket system eliminerer behovet for håndtering prøvene med alle strenge inneslutning, som BSL-4 forhold7, og prøvene kan håndteres under normale BSL-2 forhold. Denne inaktivering metoden er kompatibel med flere NA utvinning systemer, for eksempel roboter og hånd rensing kits7; disse metodene krever imidlertid laboratorieutstyr og som roboter, sentrifuger og elektrisitet, som ikke alltid tilstede i innstillinger eller i sykehus isolasjon menigheter.
I denne rapporten beskriver vi en trygg, rask og forenklet manuell NA utvinning metode for påfølgende molekylær påvisning av virus i lyse binding buffer-inaktivert fullblod. NA utvinning metoden krever ikke utstyr enn en magnet/magnetisk holder. Ingen sentrifuger, oppvarming blokker eller strøm er nødvendig for NA utvinning. Derfor, denne metoden er ikke avhengig av laboratoriet og lett kan brukes hvor som helst (f.eksi feltet sykehus, sykehus isolasjon avdelinger eller med lav-ressurs innstillinger). NA utvinning metoden er rask og enkel og kan brukes direkte i nedstrøms NA tester, som qPCR, RT-qPCR, lampe eller RT-lampe. Denne NA utvinning metoden er kombinert med lampe og et bærbart batteri-drevet isotermiske instrument, kan sengen diagnosen oppnås innen 40 min av blod samling.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1080px;" width="1081">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:544px;">Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL)</td>
			<td style="width:251px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">368861</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plus Blood Collection</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">362725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">23G x 1 needle&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">300800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LUER LOK syringe (3 mL)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">309658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Butterfly needle with small-bore extension tubing</td>
			<td style="width:251px;">J&#248;rgen Kruuse A/S</td>
			<td style="width:119px;">121714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1% Virkon&#160;</td>
			<td>Nomeco A/S</td>
			<td style="width:119px;">849265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis/Binding Buffer - Refill</td>
			<td>Roche Diagnostics A/S</td>
			<td style="width:119px;">03246752001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit</td>
			<td>Roche Diagnostics A/S</td>
			<td style="width:119px;">3038505001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc&#8482; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">375418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc&#8482; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">379189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc&#8482; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">379146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DynaMag&#8482;-5 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12303D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer pipette (3.5 mL)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">86.1171.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific&#8482; Samco&#8482; Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Thermo Scientific&#8482; Nunc&#8482; 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">339652</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, safe, and simple manual bedside nucleic acid extraction for the detection of virus in whole blood samples

Rask diagnose av en infeksjon er viktig for utbruddet ledelse, risiko forvaring og pasient. Vi har tidligere vist en metode for rask sengen inaktivering av Ebolaviruset under blod prøvetaking for sikker nukleinsyre (NA) tester ved å legge til en kommersiell lysis binding buffer direkte inn i vakuum blod samling rørene. Med denne sengen inaktivering tilnærming, har vi utviklet en trygg, rask og forenklet sengen NA utvinning metode for påfølgende påvisning av virus i lyse binding buffer-inaktivert fullblod. NA utvinning utføres direkte i blod samling rør og krever ingen utstyr eller elektrisitet.
Når blodet samles inn i lyse binding buffer, innholdet er mikset av bla røret for hånd og blandingen er ruges i 20 minutter ved romtemperatur. Magnetisk glass partikler (MGPs) legges til røret, og innholdet er mikset av bla samling rør for hånd. MGPs er deretter samlet på siden av blod samling tuben bruke magnetisk innehaver eller en magnet og en gummi band. MGPs er vasket tre ganger, og etter tillegg av elueringsbufferen direkte inn i samling røret, NAs klar for NA tester, som qPCR eller isotermiske loop forsterkning (lampe), uten fjerning av MGPs reaksjonen. NA utvinning metoden er ikke avhengig av noen laboratoriefasiliteter og lett kan brukes hvor som helst (f.eksi feltet sykehus og sykehus isolasjon avdelinger). Denne NA utvinning metoden er kombinert med lampe og en bærbar instrument, kan en diagnose oppnås innen 40 min av blod samling.

Protokollen presenteres her er enkel og effektiv og bredt kan brukes på noen molekylær analysen utføres på smittsomme hele blodprøver inaktivert med lyse binding bufferen. Arbeidsflyten for blod inaktivering og NA utvinning er vist i figur 1, inkludert utarbeidelse av blod samling vakuum-rør7 (figur 1A), blod samling7 (figur 1B), NA utvinning (<st...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples at JoVE.com

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Her presenterer vi en protokoll for rask virus nukleinsyre utvinning fra virus-inaktivert hele blodet. Utvinning utføres direkte i blod samling rør og krever ingen utstyr eller elektrisitet. Metoden er ikke avhengig av laboratoriet og kan brukes hvor som helst (f.eksi feltet sykehus).

Rask, sikker og enkel manuell sengen nukleinsyre utvinning for påvisning av Virus i hele blodprøver

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Method for influensavirus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

Stengte Nucleic Acid flowcytometrisystemer-fluorescens In situ Hybridisering (LNA flow-FISH): En metode for Bakteriell små RNA Detection

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nøytrofile Isolering og analyse for å fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhet for Terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

En enkel og effektiv tilnærming til Konstruer Mutant vacciniavirus vektorer

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

En enkel Flowcytometriske metode for å måle glukoseopptak og Glukose Transporter Expression for Monocyttnivåene subpopulasjoner i fullblod

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flowcytometrisk analyse av Natural Killer Cell Lytisk aktivitet i humant fullblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Magnetisk rører metode for påvisning av<em&gt; trikiner</em&gt; Larver i Muscle Samples

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Karakteristikk av menneskelig Monocyte delsett av hele blod flyte cytometri analyse

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...