Name: caenorhabditis sieve: a low-tech instrument and methodology for sorting small multicellular organisms
Uploaded: 2018-07-04T15:00:00
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Gli autori vorrei ringraziare Heather Currey per il suo contributo iniziale per lo studio di progettazione e Dr. Swarup Mitra per la sua revisione critica del manoscritto. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Michael B. Harris per commenti, perfezionamenti e assistenza nella produzione la dimostrazione di questa metodologia. I ceppi sono stati forniti dal centro Caenorhabditis genetica, che è finanziato dall'ufficio NIH di programmi di ricerca dell'infrastruttura (P40 OD010440). La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Institute Of General Medical Sciences del National Institutes of Health, sotto Premio numeri UL1GM118991, TL4GM118992 o RL5GM118990 e di un premio per lo sviluppo istituzionale (IDeA) da il National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health, sotto concessione numero 5P20GM103395-15. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. UA è un datore di lavoro AA/EO e istituzione educativa e vieta la discriminazione illegale contro qualsiasi individuo: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.

1. Caenorhabditis setaccio costruzione e uso
<ol><li>
Protocollo di costruzione
	<ol>
<li>Acquisire 2 coperchi da provette coniche da 50 mL (Figura 1A).</li>
		<li>Rimuovere l'area di centro all'interno del labbro interno dei coperchi (quando hanno visto dal basso, Figura 1B) utilizzando un bruciatore di Bunsen e una sonda di metallo caldo o un saldatore o ha fatto un passo trapano. Nota: Utilizza il calore per tagliare il coperchi...

<ol>
	<li>C elegans Sequencing Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans:+a+platform+for+investigating+biology.">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).</li><li>Herman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hermaphrodite+cell-fate+specification.">Hermaphrodite cell-fate specification.</a> WormBook. , 1-16 (2006).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Chalfie, M., Hart, A. C., Rankin, C. H., Goodman, M. 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M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1.">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing Development. 132 (10), 519-521 (2011).</li><li>Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+maintaining+large,+aging+populations+of+Caenorhabditis+elegans.">A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans.</a> Mechanisms of Ageing Development. 12 (2), 137-150 (1980).</li><li>Aitlhadj, L., St&#252;rzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+FUdR+can+cause+prolonged+longevity+in+mutant+nematodes.">The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131 (5), 364-365 (2010).</li><li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans.">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mechanisms of Ageing Development. 133 (1), 46-49 (2012).</li><li>Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+improves+Caenorhabditis+elegans+proteostasis+independent+of+reproduction+onset.">Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset.</a> PLoS One. 9 (1), e85964 (2014).</li><li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+analysis,+sorting,+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system.">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> Methods Molecular Biology. 351, 275-286 (2006).</li><li>Argon, Y., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+fertilization-defective+mutants+with+abnormal+sperm.">Caenorhabditis elegans fertilization-defective mutants with abnormal sperm.</a> Genetics. 96 (2), 413-433 (1980).</li><li>Lee, S. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span.">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mechanisms of Ageing Development. 6 (6), 413-429 (1977).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+Temperature+Differentially+Modulates+C.+elegans+Longevity+through+a+Thermosensitive+TRP+Channel.">Environmental Temperature Differentially Modulates C. elegans Longevity through a Thermosensitive TRP Channel.</a> Cell Reports. 11 (9), 1414-1424 (2015).</li><li>Michaelson, L. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+and+genetic+factors+influence+tissue-specific+decline+in+ageing+C.+elegans.">Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans.</a> Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).</li><li>Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+neuronal+RNAi+in+C.+elegans+using+SID-1.">Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1.</a> Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).</li><li>Henderson, S. T., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daf-16+integrates+developmental+and+environmental+inputs+to+mediate+aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">daf-16 integrates developmental and environmental inputs to mediate aging in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 11 (24), 1975-1980 (2001).</li><li>Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stress-sensitive+reporter+predicts+longevity+in+isogenic+populations+of+Caenorhabditis+elegans.">A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans.</a> Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).</li><li>Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+activities+of+C.+elegans+DAF-16+in+the+regulation+of+lifespan.">Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan.</a> Cell. 115 (4), 489-502 (2003).</li><li>Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+healthspan+and+stress-resistance+assay+toolkit.">The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit.</a> Methods. 68 (3), 476-486 (2014).</li><li>Scerbak, C., Vayndorf, E. M., Hernandez, A., McGill, C., Taylor, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensory+neuron+aging:+Differential+trajectories+with+lifespan-extending+alaskan+berry+and+fungal+treatments+in+Caenorhabditis+elegans.">Mechanosensory neuron aging: Differential trajectories with lifespan-extending alaskan berry and fungal treatments in Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 8, 173 (2016).</li><li>Vayndorf, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+remodeling+of+C.+elegans+neurons+during+aging+is+modified+by+compromised+protein+homeostasis.">Morphological remodeling of C. elegans neurons during aging is modified by compromised protein homeostasis.</a> npj Aging and Mechanisms of Disease. 2, 16001 (2016).</li><li>Murakami, S., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+pathway+conferring+life+extension+and+resistance+to+UV+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">A genetic pathway conferring life extension and resistance to UV stress in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 143 (3), 1207-1218 (1996).</li><li>Abbas, S., Wink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+Tea+Extract+Induces+the+Resistance+of+Caenorhabditis+elegans+against+Oxidative+Stress.">Green Tea Extract Induces the Resistance of Caenorhabditis elegans against Oxidative Stress.</a> Antioxidants (Basel). 3 (1), 129-143 (2014).</li><li>Yanase, S., Hartman, P. S., Ito, A., Ishii, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+pretreatment+increases+the+X-radiation+resistance+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Oxidative stress pretreatment increases the X-radiation resistance of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Mutation Research. 426 (1), 31-39 (1999).</li><li>Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+on-chip+rapid+microscopy,+phenotyping+and+sorting+of+C.+elegans.">Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans.</a> Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).</li></ol>

Nel presente documento, abbiamo introdotto la progettazione e l'uso del setaccio Caenorhabditis accessibile, efficace come strumento per l'ordinamento e il mantenimento di c. elegans. Questo strumento presenta diversi vantaggi per picking manualmente singoli animali, popolazioni, trattamenti chimici (ad esempio, FUDR) e metodi più costosi degli animali segregating di lavaggio. In primo luogo, il Caenorhabditis setaccio efficientemente e rapidamente (meno di 20 min) Ordina progenie da ...

Il verme nematode Caenorhabditis elegans, è un organismo modello premier. Oltre la natura semplice e controllata della loro coltivazione in laboratorio, è loro intero genoma sequenziato1 e il destino dello sviluppo di ogni cellula è noto2. Grazie a queste caratteristiche, c. elegans è un organismo di modello ampiamente usato per gli studi genetici. Tuttavia, insieme con queste caratteristiche benefiche vengono alcune sfide per i ricercatori. A causa del loro tempo di generazione rapida, popolazioni di c. elegans possono rapidamente a corto di cibo e/o diventano popolazioni con più generazioni miste e stadi di sviluppo presentano in una sola volta. Così, gli esperimenti eseguiti su supporti di solida crescita del nematode (NGM) richiedono ricercatori spostare fisicamente gli animali in piatti freschi prima esaurisce la fonte alimentare batterica e nuove larve si sviluppano. Questo può essere noioso come un frequente trasferimento degli animali è necessaria per prevenire le popolazioni sperimentali da diventando mescolato con generazioni di prole. Ancora, alcuni esperimenti richiedono entrambi i grandi numeri di animali e punti di tempo prolungato (ad es., estrazione di DNA o RNA in età adulta). Questo composti le sfide di accuratamente mantenendo una popolazione sincronizzata e il trasferimento di grandi quantità di animali.
Attuali metodi di trasferimento di c. elegans coltivati su NGM sono picking o lavare gli animali da piastra a piastra; trattare chimicamente gli animali (per esempio, con il DNA replica inibitore fluorodeossiuridina o FUDR); o mediante citometria a flusso per ordinare gli animali in piastre multi-pozzetto. Picking prevede l'utilizzo di uno strumento a mano, realizzato con un sottile filo di platino o un ciglio, trasferire manualmente i singoli o più animali3,4. Questo metodo è preciso ma richiede abilità e il tempo ed è una limitazione per gli studi che coinvolgono un numero elevato di animali. Picking maggio anche essere fisicamente dannosa e stressante per gli animali sottoponendo gli individui potenzialmente importi innaturali e incoerenti della dispersione e della forza. Lavaggio comporta una piastra di coltura con una soluzione tampone di risciacquo e trasferimento della soluzione con gli animali tramite vetro pipetta Pasteur di una nuova piastra di coltura. Questo metodo è rapido ed efficiente, ma non è accurato come più generazioni e stadi di sviluppo degli animali vengono trasferiti alla rinfusa. Trattamenti chimici, ad esempio FUDR, possono essere sciolto in coltura media per prevenire la produzione di prole attraverso il blocco di qualsiasi replica del DNA e quindi, lo sviluppo di uova e produzione di gameti. Mentre efficace, questo metodo deve essere applicato dopo la maturazione dello sviluppo per non interferire con i normali processi di sviluppo, e questo significa che c'è ancora un requisito per trasferire gli animali prima della sua amministrazione3. Questo metodo influisce anche più cellulari vie di segnalazione, con conseguente effetti notevoli sugli animali che invecchiano (ad esempio, un'estensione di durata della vita o un'alterata proteostasis) a seconda del ceppo di c. elegans utilizzato5, 6,7,8,9,10. Il flusso cytometry metodi automaticamente ordinare e trasferire singoli c. elegans da una piastra multi-pozzetto per un altro11. Mentre questo metodo è molto efficace ed efficiente, apparecchiatura di citometria a flusso è proibitivamente costosi e inaccessibili per molti ricercatori. Un'alternativa al trasferimento di animali consiste nell'utilizzare modelli di mutanti che sono termosensibili, quali fer-15 e fem-1, che diventano sterili con temperatura regolazione12. Durante l'utilizzo di animali mutanti è utile in alcune situazioni, questi ceppi specifici crescono più lentamente rispetto agli animali wild type e fanno affidamento su un genoma alterato, che serve come poveri rappresentanti per invecchiamento o sani vermi. Inoltre, il ricorso a un cambiamento di temperatura per indurre sterilità risultati anche in assenza di un ambiente statico, e cambiamenti di temperatura sono state prontamente indicati per influenzare gene espressioni13,14, 15. gruppi di ricerca sono pubblicati in precedenza tecniche che descrivono l'uso di una mesh per filtrare c. elegans di dimensioni16. Tuttavia, siamo riusciti a trovare un lavoro precedente test per eventuali modifiche negli esiti di salute globale che possono essere associati con l'uso di tali filtri.
C'è, così, un'esigenza di un metodo conveniente, efficiente, rapida e accurata per trasferire grandi quantità di animali tra piastre di coltura all'interno della comunità di ricerca di c. elegans . Abbiamo sviluppato un migliorato, accessibile pezzo di equipaggiamento (denominato il setaccio di Caenorhabditis ) e un protocollo associato per la fabbricazione e il suo funzionamento che soddisfa le esigenze della comunità di ricerca di c. elegans . Qui, condividiamo il design del setaccio di Caenorhabditis e metodi per il suo utilizzo, e dimostriamo che il suo utilizzo non influisce la salute comune o eventuali marcatori di stress rispetto alla raccolta manuale standard e un trattamento con il comunemente usati, limitare la fertilità chimica FUDR.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="654">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Safety glasses</td>
			<td style="width:129px;">Uline</td>
			<td style="width:119px;">S-21076&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Protective heat resistant glove</td>
			<td style="width:129px;">Grainger</td>
			<td style="width:119px;">Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 mL conical tube</td>
			<td style="width:129px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Synthetic Nylon mesh</td>
			<td style="width:129px;">Dynamic 
			Aqua-Supply Ltd</td>
			<td style="width:119px;">NTX20 and NTX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cyanoacrylate glue</td>
			<td style="width:129px;">Scotch Super Glue Liquid</td>
			<td style="width:119px;">SAD114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pliers</td>
			<td style="width:129px;">Vampliers</td>
			<td style="width:119px;">VMPVT-001-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dremmel tool with circular file</td>
			<td style="width:129px;">Lowe&#39;s</td>
			<td style="width:119px;">Item # 525945 Model # 100-LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FUDR</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin)</td>
			<td style="width:129px;">BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest)</td>
			<td style="width:119px;">BD bioscience 211677, Lab Express 1001,&#160; Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pluronic F-127</td>
			<td style="width:129px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">P2443&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraquat dichloride hydrate</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">36541&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td style="width:119px;">FSX100&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

caenorhabditis sieve: a low-tech instrument and methodology for sorting small multicellular organisms

Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un organismo di modello consolidata utilizzato in una gamma di ricerca biomedica di base. All'interno della comunità di ricerca del nematode, c'è un bisogno di un modo conveniente ed efficace per mantenere la popolazione di grande, di pari età di c. elegans. Qui, presentiamo una metodologia per meccanicamente l'ordinamento e la pulizia di c. elegans. Il nostro obiettivo è quello di fornire un processo conveniente, efficiente, veloce e semplice per ottenere animali di dimensioni uniformi e fasi della vita per il loro uso negli esperimenti. Questo strumento, il setaccio di Caenorhabditis , utilizza un sistema di coperchio su misura che discussioni sui tubi conici laboratorio comune e Ordina di c. elegans basato sulla dimensione del corpo. Inoltre dimostriamo che il setaccio di Caenorhabditis trasferisce efficacemente animali dalla piastra di una cultura ad un'altra che consente un ordinamento rapido, la sincronizzazione e pulizia senza impattare gli indicatori di salute, tra cui motilità e lo stress-viscoelastico reporter gene. Questo strumento innovativo e accessibile è un'opzione veloce, efficiente e non stressante per il mantenimento di popolazioni di c. elegans .

Il setaccio di Caenorhabditis è costituito da 2 tappi a vite, protezione di un'area di monofilo di nylon tessuto inferiore al diametro del corpo dell'età dello sviluppo desiderato, utilizzato per estrarre dal vivo popolazioni di organismi usando una tecnica semplice lavaggio. Si attacca ai tubi conici standard e utilizza il setaccio a maglie per ordinare meccanicamente animali di diametro del corpo, lasciando gli animali desiderati nel tubo pronto per la successiva manutenzione...

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Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

Il protocollo corrente include una metodologia per la cernita e la pulizia delle popolazioni di pari età di elegans di Caenorhabditis. Utilizza un semplice, poco costoso ed efficiente strumento su misura per ottenere una grande popolazione sperimentale dei nematodi per la ricerca.

Caenorhabditis Setaccio: Uno strumento low-tech e metodologia per l'ordinamento di piccoli organismi multicellulari

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a well-established model organism used across a range of basic and biomedical research. Within the nematode ...

This method can help answer key questions in molecular biology, involving assays that require specific developmental stages of C.elegans. Like assays of gene and protein expression levels. The advantage of this technique is that it allows for accurate and efficient selection of large numbers of C.elegans by body size, this facilitates the use of assays that would normally be time and cost prohibitive.Generally, individuals new to this method will struggle because they can't perform the arching turnover step or they don't keep solution flow in the center of the mesh. Visual demonstration of this method is critical, as the washing and flipping steps are difficult to learn. Some may have trouble interpreting and visualizing specific motions in text.To begin, acquire two 50 mL conical tubes with lids, then use a stepped drill bit to remove the center from the inner lip of the lids. If necessary, use a file, sandpaper, or a rotary tool to clean and sand the edges and tops of the lids. Then cut a disc of nylon monofilament woven mesh, slightly smaller than the diameter of the lid.Texture the top surfaces of the lids, and clean them with ethanol. After allowing the lids to dry, apply cyanoacrylate glue to the top surfaces of both lids. Next, lay the monofilament mesh disc on one glued lid.Invert the second lid on top of the mesh, and press the lids firmly together. After the first layer of glue dries, apply a generous ring of cyanoacrylate glue around the outer gap between the lids. Next, label the filter with its respective mesh pore size.First, place the sieve over a labeled 50 mL conical tube. Then pipette saline solution through the center of the sieve until a droplet forms, coalesces, and drips off of the center of the filter. Using M9 buffer, wash a population of C.elegans off of an auger plate, then use a glass pasteur pipette to transfer the buffer containing the worms on the top side of the monofilament mesh.Operating in the center of the mesh, rinse the filter with M9 buffer, repeat this rinse step as needed to pass all bacteria and smaller worms through the mesh. Next, attach a new 50 mL conical tube to the top of the sieve, the previously collected worms larger than the pores in the mesh will be facing the inside of the new tube. Remove the waste tube and quickly flip the sieve.Then rinse the mesh with M9 buffer into the new collection tube. Allow the collected worms to settle for approximately one minute, then carefully aspirate the buffer solution away from the pellet of worms. Using a glass pasteur pipette, create droplets of worms on an NGM plate and allow them to dry.Finally, rinse the sieve with reverse-osmosis water and ethanol. After the sieve dries, store it in a clean container for future use. Discard the sieve when it develops a sagging appearance.In this protocol a sieve was constructed to sort and clean age-matched populations of C.elegans. Animals in the sieve treatment group exhibited normal and spontaneous movement pattern throughout adulthood. Additionally, the pick and sieve groups did not show any significant differences in pharyngeal pump rate.Animals in the sieve group also responded normally to anterior or posterior mechanical stimulus when compared to all of the treatment groups on any of the testing days. Finally, the fecundity of the treatment groups was compared;the use of the sieve did not significantly impact the number of progeny when compared to the pick treatment group. Once mastered, this technique can be done in less than ten minutes.While attempting this procedure, it's important to remember to operate in the center of the mesh area. After watching this video, you should have a good understanding of how to assemble and properly use a Caenorhabditis sieve to sort worms by body size.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

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Ricerca

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Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

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Immobilizzazione del Caenorhabditis elegans per analizzare il trasporto intracellulare nei neuroni

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Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

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Misurare la guida dello sperma e la motilità all'interno del tratto riproduttivo ermafrodita di Caenorhabditis elegans

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...