这种方法可以帮助回答艾滋病毒领域的关键问题，如确定HIV原病毒和不同细胞类型的遗传成分。特别是识别那些基因完好无损和潜在的复制能力。这项技术的主要优点是，它允许我们放大来自单个HIV感染细胞的几乎全长HIV前病毒，然后通过下一代测序来排列这些病毒。
首先，准备文本协议中概述的所有缓冲区。获得细胞颗粒，每百万个细胞添加一百微升的解解缓冲液。通过上下移液混合。
在55摄氏度的热循环器中孵育一小时，然后加入85摄氏度15分钟，将细胞酶。为了开始放大单个HIV-1 DNA原病毒，将第一轮PCR的试剂混合在一起，如文本协议表之一所列。在 96 孔 PCR 板中，在 85 孔中加入 38 微升，并将此板标记为 PCR 1。
在此之后，将 PCR 1 板移动到指定用于添加基因组 DNA 的清晰区域。使用三盐酸盐连续稀释基因组DNA的比例为一比三，比例为一比八十一，确保每次稀释的45微升。在每个样品井中加入两个稀释基因组DNA微升，在每个负控制井中加入两个三氧化三微升。
密封整个板，除了正控井。接下来，移动到指定用于添加正控的区域。将正向控制的两个微升添加到相应的井中，然后完全密封板。
使用 PCR 板微调器短暂旋转 PRC 1 板，然后从井两侧拉出任何残余物。如文本协议中所述，在热循环器中运行 PCR 1 板。接下来，混合表一中列出的第二轮PCR试剂。
将 28 微升的 PCR 2 混合物添加到 85 孔的新 96 孔 PCR 板中。将此板标记为 PCR 2。使用板微调器，短暂旋转 PCR 1 板，从井两侧拉出任何残余物。
在此板的每个井中加入80微升的三氧化三酸盐。在此之后，使用多通道移液器将两个微升器从 PCR 1 板的每个孔转移到 PCR 2 板中的相应孔中。用清晰的胶粘剂包装密封 PCR 2 板。
在板微调器中短暂旋转 PCR 2 板。同时，用热密封膜密封 PCR 1 板，在零下 20 摄氏度下长期储存。如文本协议中所述，在热循环器中运行 PCR 2 板。
然后短暂旋转 PCR 2 板，从井两侧拉出任何残留的内装物。使用多通道移液器，在每个井中加入60微升三氧化三酸盐。接下来，在两个 48 井预制 1% 的溴化乙基凝胶上运行每井 15 微升。
识别含有放大产品的井及其近似尺寸，并保存凝胶图像。在此之后，确定稀释时不超过30%的孔对放大产品呈阳性。首先，使用板微调器短暂旋转PCR 2板，然后从井两侧拉出任何残余物量。
将含有放大产品的井中输送 40 微升到新 96 井中板的相应孔中。接下来，设置一个基于磁性饲料的纯化套件，确保将磁珠带到室温，并准备80%乙醇的新鲜溶液。一旦珠子达到室温漩涡，以确保它们被彻底重新暂停。
使用多通道移液器，在中盘每个井的40微升放大产品中加入40微升珠。通过轻轻上下移液10次混合。在室温下孵育五分钟。
然后，将板转移到磁性支架上，让它休息两分钟。在此之后，取出并丢弃上经剂。当盘子还在支架上时，通过向每井添加两百微升的 80% 乙醇溶液来清洗珠子。
在室温下孵育30秒，然后取出并丢弃上一液。重复一次这种洗涤过程，从添加乙醇到丢弃上一液。使用多通道移液器去除多余的乙醇。
让珠子风干15分钟。在此之后，从支架上取下板。在每个井中加入30微升的洗脱缓冲液，然后轻轻上下移液10次。
在室温下孵育两分钟。将板放回磁性支架上，让它休息两分钟。使用多通道移液器，将25微升的上流液转移到新的96孔PCR板的相应孔中。
接下来，使用光谱光度计确定和记录每个放大DNA产品的大致浓度。设置双绞合DNA定量试剂盒，在无菌DNA无水中将缓冲液稀释1次。将缓冲液的 99 微升添加到平底组织培养板中适当数量的空孔中。
然后，在三个空白井中添加一百微升缓冲器。对于要测量的每个放大产品，在每个含有缓冲液的井中加入一个微升纯化DNA。稀释 lambda 双搁浅 DNA 10 倍，从每微升两个纳米到点零南图每微升，以准备标准。
将每双绞合DNA标准的一百微升添加到三个孔中。用缓冲液稀释荧光染料一到两百。快速向每一个包含样品、空白或标准井的井中添加一百微升，然后上下移液混合。
在此之后，用铝箔盖住板，以避免与光线接触。使用微孔板读取器记录荧光发射。使用记录的测量来确定每个样品中双链DNA的浓度。
然后用水稀释每个净化产品，浓度为每微升零点两纳米。在嵌套 PCR 之后，放大产品在 1% 的 agarose 凝胶上运行。PCR 的初始质量可以通过检查控制装置来确定。
由于含有放大产品的负对比指示污染，而不放大产品的正对控表示放大不足。只有在端点稀释含有单个扩增前病毒的井才考虑进行测序。虽然在这个阶段可以可视化含有不同长度的多种扩增前病毒的井，但不应选择它们进行测序。
对于 de novo 装配，可以评估组装的连体的质量，以保证覆盖的深度和均匀性。在现阶段，通过覆盖面不均匀，也可以确定混合种群。从一个参与者分离的序列的可视化表示显示，其序列的 97% 有缺陷。
与完整的序列发现在有效器和过渡记忆CD4阳性T细胞。在尝试此程序时，重要的是要记住，只有在限制稀释时获得的放大产品，即不超过 30% 的油井为阳性，则只含有单个前病毒。按照这个程序，可对扩增产品进行测序，以确定HIV原病毒的遗传成分。
该技术开发后，为艾滋病毒领域的研究人员探索基因完好无损的HIV原生病毒和不同细胞类型在治疗的患者中的分布铺平了道路，以确定基因完好无损和可能复制的原能性原生病毒隐藏在哪里。不要忘记，使用 HIV 感染细胞可能是危险的，在执行此程序时，应始终采取预防措施，例如佩戴适当的个人防护设备和使用经过认证的实验室。
