11.4K Views
•
10:18 min
•
October 16th, 2018
DOI :
October 16th, 2018
•0:04
Title
0:40
Lysis of HIV-1-infected Cells and Amplification of Single HIV-1 DNA Proviruses via Nested PCR
4:23
DNA Purification and Quantification
8:12
Results: Analysis of Amplified Near Full-length HIV-1 Proviruses
9:21
Conclusion
Transcript
Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i hiv-området, såsom bestemmelse af den genetiske sammensætning af HIV-provira og forskellige celletyper. Især identificere dem, der er genetisk intakt og potentielt replikation kompetente. De vigtigste fordele ved denne teknik er, at det giver os mulighed for at forstærke nær fuld længde HIV provira fra enkelt HIV-inficerede celler og derefter sekvens disse ved næste generation sekventering.
For at starte, forberede alle buffere som beskrevet i tekstprotokollen. Få en celle pellet og tilsæt hundrede mikroliter af lysis buffer per million celler. Bland ved pipettering op og ned.
Lyse cellerne ved at inkubere i en termisk cycler ved 55 grader celsius i en time og derefter tilføje 85 grader celsius i 15 minutter. For at begynde at forstærke enkelt HIV-1 DNA provira blande reagenser for den første runde PCR som anført i tabel en af tekstprotokollen. Tilføj 38 mikroliter til 85 brønde i en 96 brønd PCR plade og mærke denne plade som PCR 1.
Derefter skal du flytte PCR 1-pladen til et klart område, der er udpeget til tilsætning af genomisk DNA. Ved hjælp af tris hydrochlorid serielt fortyndet genomisk DNA fra et forhold på en til tre til et forhold på en til 81 og sørg for at forberede 45 mikroliter af hver fortynding. Der tilsættes to mikroliter fortyndet genomisk DNA til hver prøve brønd og to mikroliter af tris hydrochlorid til hver negativ kontrol godt.
Forsegle hele pladen bortset fra den positive kontrol godt. Dernæst flytte til et område, der er udpeget til tilføjelse af den positive kontrol. Tilsæt to mikroliter af den positive kontrol til den tilsvarende brønd og derefter forsegle pladen helt.
Brug en PCR plade spinner til kort dreje Prc 1 plade og trække ned eventuelle resterende indhold fra siderne af brøndene. Kør PCR 1-pladen i den termiske cycler som beskrevet i tekstprotokollen. Dernæst blandes reagenserne til anden runde af PCR som anført i tabel et.
Tilføj 28 mikroliter af denne PCR 2 mix til 85 brønde af en ny 96 brønd PCR plade. Mærg denne plade som PCR 2. Brug en plade spinner, kort dreje PCR 1 plade til at trække ned eventuelle resterende indhold fra siderne af brøndene.
Tilsæt 80 mikroliter af tris hydrochlorid til hver brønd af denne plade. Derefter skal du bruge en mutli-kanalpipette til at overføre to mikroliter fra hver brønd på PCR 1-pladen til de tilsvarende brønde i PCR 2-pladen. Seal PCR 2 pladen med klar klæbende wrap.
Drej kortvarigt PCR 2-pladen i pladespinneren. I mellemtiden forsegle PCR 1 plade med en varme forsegling film til langtidsopbevaring ved minus 20 grader celsius. Kør PCR 2-pladen i en termisk cycler som beskrevet i tekstprotokollen.
Drej derefter kort PCR 2-pladen for at trække eventuelt restindhold ned fra siderne af brøndene. Ved hjælp af en multi-kanal pipette, tilføje 60 mikroliter af tris hydrochlorid til hver brønd. Dernæst køre 15 mikroliter af hver brønd på to 48 godt præfabrikerede en procent agarose geler, der indeholder ethidium bromid.
Identificer brøndene, der indeholder det forstærkede produkt og deres omtrentlige størrelser, og gem gelbilledet. Derefter bestemmes fortyndingen, hvor højst 30 procent af brøndene er positive for forstærket produkt. Brug først en pladespind til kort at dreje PCR 2-pladen og trække eventuelle resterende indhold ned fra siderne af brøndene.
Overfør 40 mikroliter fra brøndene, der indeholder forstærket produkt, til de tilsvarende brønde i en ny 96 brønd midi plade. Dernæst skal du fastsætte et magnetisk foderbaseret rensningssæt, der sørger for at bringe de magnetiske perler til stuetemperatur og forberede en frisk opløsning på 80 procent ethanol. Når perlerne når stuetemperatur vortex dem for at sikre, at de er grundigt resuspended.
Ved hjælp af en multi-kanal pipette tilsættes 40 mikroliter perler til de 40 mikroliter af forstærket produkt i hver brønd af midi pladen. Bland ved forsigtigt pipettering op og ned 10 gange. Inkuberes ved stuetemperatur i fem minutter.
Derefter overføres pladen til et magnetisk stativ og lad den hvile i to minutter. Derefter fjernes og kasseres supernatanten. Mens pladen stadig er på stativet, skal du vaske perlerne ved at tilføje 200 mikroliter af 80 procent ethanolopløsningen til hver brønd.
Inkuber ved stuetemperatur i 30 sekunder, og fjern og kassér derefter supernatanten. Gentag denne vaskeproces én gang fra tilsætning af ethanol til kassation af supernatanten. Ved hjælp af en multi-kanal pipette fjerne overskydende ethanol.
Lad perlerne lufttørre i 15 minutter. Derefter tages pladen ud af stativet. Tilføj 30 mikroliter af elution buffer til hver brønd og bland ved forsigtigt pipettering op og ned 10 gange.
Inkuber ved stuetemperatur i to minutter. Anstne pladen tilbage på den magnetiske stativ og lad den hvile i to minutter. Ved hjælp af en multi-kanal pipette, overføre 25 mikroliter af supernatant til de tilsvarende brønde af en ny 96 brønd PCR plade.
Brug derefter et spektrefotometer til at bestemme og registrere den omtrentlige koncentration af hvert forstærket DNA-produkt. Sæt et dobbeltstrenget DNA-kvantificeringssæt, og fortyndes bufferen til én gang i sterilt DNAs-frit vand. Tilføj 99 mikroliter af bufferen til et passende antal tomme brønde i en flad bund væv kultur plade.
Derefter tilføje hundrede mikroliter af buffer til tre tomme brønde. For hvert forstærket produkt, der skal måles, tilsættes en mikroliter renset DNA i tre eksemplarer til hver brønd, der indeholder buffer. Fortyndet lambda dobbeltstrenget DNA 10 gange fra to nanogram pr. mikroliter til punkt nul nul nanogram pr. mikroliter for at forberede standarderne.
Tilføj hundrede mikroliter af hver dobbeltstrenget DNA-standard til tre brønde. Fortynd florescence farvestoffet en til to hundrede med buffer. Tilføj hurtigt hundrede mikroliter til hver brønd, der indeholder en prøve, tom eller standard og blandes ved pipettering op og ned.
Derefter dækkes pladen med folie for at undgå kontakt med lys. Brug en mikropladelæser til at registrere florescence-emissionen. Brug de registrerede målinger til at bestemme koncentrationen af dobbeltstrenget DNA i hver prøve.
Derefter fortyndes hvert renset produkt med vand til en koncentration på nulpunkt to nanogram pr. mikroliter. Efter indlejret PCR køres de forstærkede produkter på en agarosegel på én procent. PCR'ens oprindelige kvalitet kan bestemmes ved at inspicere kontrollerne.
Da negative kontroller, der indeholder forstærket produkt, indikerer kontaminering, og de positive kontroller uden forstærket produkt indikerer utilstrækkelig forstærkning. Kun brønde køre ved slutpunktet fortynding, der indeholder enkelt forstærket provirus er i betragtning til sekventering. Mens brønde, der indeholder flere forstærkede provirus af forskellig længde, kan visualiseres på nuværende tidspunkt, bør de ikke udvælges til sekvensering.
For de novo-samlingen kan kvaliteten af de samlede contigs vurderes for tilstrækkelig dybde og jævn dækning. Blandede populationer kan også på nuværende tidspunkt identificeres ved, at der er ulige dækning. Visuel repræsentation af de sekvenser, der er isoleret fra en deltager, afslører, at 97 procent af deres sekvenser er defekte.
Med intakte sekvenser fundet i effector og overgangshukommelse CD4 positive T-celler. Mens du forsøger denne procedure er det vigtigt at huske, at kun forstærkede produkter fremstillet ved den begrænsende fortynding, det er hvor ikke mere end 30 procent af brøndene er positive, indeholder en enkelt provirus. Efter denne procedure, forstærkede produkter kan sekvenseres til at bestemme den genetiske sammensætning af HIV provira.
Efter sin udvikling, denne teknik banede vejen for forskere inden for HIV til at udforske fordelingen af genetisk intakte HIV provira og forskellige celletyper hos patienter på terapi for at afgøre, hvor genetisk intakt og potentielt replikation kompetente provira skjule. Glem ikke, at arbejde med HIV-inficerede celler kan være farligt og forholdsregler såsom iført passende personlige værnemidler og arbejder et certificeret laboratorium bør altid tages, mens du udfører denne procedure.
Fuld længde individuelle proviral sekventering (FLIPS) giver en effektiv og høj overførselshastighed metode til forstærkning og sekventering af enkelt, nær fuld længde (intakt og defekte) HIV-1 provirus og giver mulighed for bestemmelse af deres potentiale replikering-kompetence. FLIPS overvinder begrænsningerne af tidligere assays designet til sekvens latent HIV-1 reservoiret.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved