11.4K Views
•
10:18 min
•
October 16th, 2018
DOI :
October 16th, 2018
•0:04
Title
0:40
Lysis of HIV-1-infected Cells and Amplification of Single HIV-1 DNA Proviruses via Nested PCR
4:23
DNA Purification and Quantification
8:12
Results: Analysis of Amplified Near Full-length HIV-1 Proviruses
9:21
Conclusion
Transcript
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van HIV, zoals het bepalen van de genetische samenstelling van HIV-provirussen en verschillende celtypen. Vooral het identificeren van degenen die genetisch intact en potentieel replicatie competent. De belangrijkste voordelen van deze techniek is dat het ons in staat stelt om bijna volledige lengte HIV provirussen uit enkele HIV geïnfecteerde cellen te versterken en deze vervolgens te sequencen door de volgende generatie sequencing.
Om te beginnen, bereid alle buffers zoals beschreven in het tekstprotocol. Verkrijg een celpellet en voeg honderd microliters lysebuffer per miljoen cellen toe. Meng door pipetting op en neer.
Lyse de cellen door uit te broeden in een thermische cycler op 55 graden Celsius gedurende een uur en voeg vervolgens 85 graden Celsius gedurende 15 minuten. Om te beginnen met het versterken van enkele HIV-1 DNA provirussen mengen de reagentia voor de eerste ronde PCR zoals vermeld in tabel een van de tekst protocol. Voeg 38 microliters toe aan 85 putten in een 96 goed PCR plaat en label deze plaat als PCR 1.
Verplaats hierna de PCR 1-plaat naar een duidelijk gebied dat is aangewezen voor de toevoeging van genomisch DNA. Met behulp van tris hydrochloride serie verdunnen de genomische DNA van een verhouding van een tot drie tot een verhouding van een tot 81 ervoor te zorgen voor 45 microliters van elke verdunning voor te bereiden. Voeg twee microliters van verdund genomic DNA aan elk monster goed en twee microliters van tris hydrochloride aan elke negatieve controle goed.
Verzegel de hele plaat, behalve de positieve controle goed. Ga vervolgens naar een gebied dat is aangewezen voor de toevoeging van de positieve controle. Voeg twee microliter van de positieve controle toe aan de overeenkomstige put en sluit de plaat vervolgens volledig af.
Gebruik een PCR-plaatspinner om de PRC 1-plaat kort te draaien en eventuele restinhoud van de zijkanten van de putten naar beneden te trekken. Voer de PCR 1-plaat uit in de thermische cyclusr zoals beschreven in het tekstprotocol. Meng vervolgens de reagentia voor de tweede ronde van PCR zoals vermeld in tabel één.
Voeg 28 microliter van deze PCR 2 mix toe aan 85 putten van een nieuwe 96 well PCR plaat. Label deze plaat als PCR 2. Met behulp van een plaatspinner draait u de PCR 1-plaat kort om de restinhoud van de zijkanten van de putten naar beneden te trekken.
Voeg 80 microliter tris hydrochloride toe aan elke put van deze plaat. Gebruik hierna een mutlikanaalpipet om twee microliter van elke put van de PCR 1-plaat over te zetten naar de overeenkomstige putten in de PCR 2-plaat. Verzegel de PCR 2 plaat met een duidelijke kleefwrap.
Draai kort de PCR 2 plaat in de plaatspinner. Verzegel ondertussen de PCR 1-plaat met een warmteafdichtingsfilm voor langdurige opslag bij min 20 graden Celsius. Voer de PCR 2-plaat uit in een thermische cycler zoals beschreven in het tekstprotocol.
Draai vervolgens kort de PCR 2-plaat om eventuele restinhoud van de zijkanten van de putten naar beneden te trekken. Met behulp van een multi-channel pipet, voeg 60 microliter tris hydrochloride aan elke put. Vervolgens lopen 15 microliter van elke put op twee 48 goed precast een procent agarose gels die ethidium bromide bevatten.
Identificeer de putten die het versterkte product en hun geschatte maten bevatten en sla het gelbeeld op. Bepaal hierna de verdunning waarbij niet meer dan 30 procent van de putten positief is voor versterkt product. Gebruik eerst een plaatspinner om de PCR 2-plaat kort te draaien en eventuele restinhoud van de zijkanten van de putten naar beneden te trekken.
Breng 40 microliter uit de putten met versterkt product naar de overeenkomstige putten van een nieuwe 96 goed midi plaat. Stel vervolgens een magnetische feed gebaseerde zuivering kit ervoor om de magnetische kralen op kamertemperatuur te brengen en een nieuwe oplossing van 80 procent ethanol voor te bereiden. Zodra de kralen bereiken kamertemperatuur vortex hen om ervoor te zorgen dat ze grondig worden geresuspended.
Voeg met behulp van een multi-channel pipet 40 microliter kralen toe aan de 40 microliter van versterkt product in elke put van de midi-plaat. Meng door zachtjes pipetten op en neer 10 keer. Vijf minuten op kamertemperatuur uitbroeden.
Breng de plaat vervolgens over op een magnetische standaard en laat deze twee minuten rusten. Verwijder en gooi hierna de supernatant weg. Met de plaat nog steeds op de stand, was de kralen door het toevoegen van tweehonderd microliter van de 80 procent ethanol oplossing aan elke put.
Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 seconden en verwijder en gooi de supernatant weg. Herhaal dit wasproces een keer van het toevoegen van de ethanol aan het weggooien van de supernatant. Met behulp van een multi-channel pipet verwijderen van overtollige ethanol.
Laat de kralen 15 minuten aan de lucht drogen. Verwijder hierna de plaat van de standaard. Voeg 30 microliter elutie buffer aan elke put en meng door zachtjes pipetteren op en neer 10 keer.
Incubeer bij kamertemperatuur gedurende twee minuten. Plaats de plaat terug op de magnetische standaard en laat deze twee minuten rusten. Met behulp van een multi-channel pipet, overdracht 25 microliter van de supernatant naar de overeenkomstige putten van een nieuwe 96 goed PCR plaat.
Gebruik vervolgens een spectra fotometer om de geschatte concentratie van elk versterkt DNA-product te bepalen en vast te leggen. Zet een dubbelstrenged DNA kwantificeringskit uit en verdun de buffer tot één keer in steriel AS-vrij water. Voeg 99 microliter van de buffer toe aan een passend aantal lege putten in een platte bodemweefselkweekplaat.
Voeg vervolgens honderd microliter buffer toe aan drie lege putten. Voor elk versterkt product te meten voeg een microliter gezuiverd DNA in drievoud aan elke put met buffer. Verdun lambda dubbel gestrand DNA 10 keer van twee nanogram per microliter tot nul nul nanogram per microliter om de normen voor te bereiden.
Voeg honderd microliter van elke dubbelstrengs DNA-standaard toe aan drie putten. Verdun de florescentiekleurstof één tot tweehonderd met buffer. Voeg snel honderd microliters toe aan elke put die een monster, blanco of standaard bevat en meng door op en neer te pipetten.
Bedek hierna de plaat met folie om contact met licht te voorkomen. Met behulp van een microplate lezer, record de florescence emissie. Gebruik de geregistreerde metingen om de concentratie van dubbelstrengs DNA in elk monster te bepalen.
Verdun vervolgens elk gezuiverd product met water tot een concentratie van nulpunt twee nanogram per microliter. Na geneste PCR, de versterkte producten worden uitgevoerd op een een procent agarose gel. De initiële kwaliteit van de PCR kan worden bepaald door de besturingselementen te inspecteren.
Omdat negatieve controles die versterkt product bevatten, duiden op verontreiniging en de positieve controles zonder versterkt product duiden op onvoldoende versterking. Alleen putten draaien op het eindpunt verdunning die enkele versterkte provirussen bevatten worden overwogen voor sequencing. Terwijl putten met meerdere versterkte provirussen van verschillende lengtes in dit stadium kunnen worden gevisualiseerd, moeten ze niet worden geselecteerd voor sequencing.
Voor de de novo-assemblage kan de kwaliteit van de geassembleerde aaneengesloten worden beoordeeld op voldoende diepte en gelijkmatigheid van de dekking. Gemengde populaties kunnen in dit stadium ook worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van ongelijke dekking. Visuele weergave van de sequenties geïsoleerd van een deelnemer blijkt dat 97 procent van hun sequenties defect zijn.
Met intacte sequenties gevonden in effector en overgangsgeheugen CD4 positieve T-cellen. Tijdens een poging tot deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat alleen versterkte producten verkregen bij de beperkende verdunning, dat is waar niet meer dan 30 procent van de putten positief zijn, bevatten een enkel provirus. Na deze procedure kunnen versterkte producten worden gesequenced om de genetische samenstelling van HIV-provirussen te bepalen.
Na de ontwikkeling ervan maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van HIV om de verspreiding van genetisch intacte HIV-provirussen en verschillende celtypen bij patiënten op therapie te onderzoeken om te bepalen waar genetisch intacte en potentieel replicatie competente provirussen zich verbergen. Vergeet niet dat het werken met hiv-geïnfecteerde cellen gevaarlijk kan zijn en voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van passende persoonlijke beschermingsmiddelen en het werken aan een gecertificeerd laboratorium moet altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.
Full-length individuele proviraal sequencing (FLIPS) een efficiënte en hoog-productie methode voorziet in de versterking en sequentiebepaling van één, in de buurt van full-length (intact en defecte) HIV-1 proviruses en zorgt voor de bepaling van hun potentieel replicatie-competentie. FLIPS overwint beperkingen van eerdere tests ontworpen om de volgorde van het latente reservoir van HIV-1.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved