अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए निकट पूर्ण लंबाई एचआईवी-1 वायरस के प्रवर्धन

यह विधि एचआईवी क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रश्नों के उत्तर देने में मदद कर सकती है जैसे एचआईवी प्रोवायरस की आनुवंशिक संरचना और विभिन्न कोशिका प्रकारों का निर्धारण करना। विशेष रूप से उन लोगों की पहचान करना जो आनुवंशिक रूप से अक्षुण्ण और संभावित प्रतिकृति सक्षम हैं। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह हमें एकल एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं से पूर्ण लंबाई एचआईवी प्रोवायरस के पास बढ़ाना और फिर अगली पीढ़ी अनुक्रम द्वारा इन अनुक्रम की अनुमति देता है ।

शुरू करने के लिए, पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित सभी बफ़र्स तैयार करें। एक सेल पेलेट प्राप्त करें और प्रति मिलियन कोशिकाओं में लाइसिस बफर के एक सौ माइक्रोलीटर जोड़ें। ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं।

एक घंटे के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर एक थर्मल साइकिलर में इनक्यूबेटिंग करके कोशिकाओं को Lyse और फिर 15 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। एकल एचआईवी-1 डीएनए प्रोवायरस को बढ़ाना शुरू करने के लिए पहले दौर की पीसीआर के लिए रिएजेंट्स को टेक्स्ट प्रोटोकॉल की तालिका में सूचीबद्ध के रूप में मिलाते हैं। एक ९६ अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट में ८५ कुओं में ३८ माइक्रोलीटर जोड़ें और पीसीआर 1 के रूप में इस प्लेट लेबल ।

इसके बाद, पीसीआर 1 प्लेट को जीनोमिक डीएनए के अलावा के लिए नामित एक स्पष्ट क्षेत्र में ले जाएं। ट्राइस हाइड्रोक्लोराइड का उपयोग एक से तीन के अनुपात में जीनोमिक डीएनए को एक से ८१ के अनुपात में कमजोर कर देता है जिससे प्रत्येक कमजोर पड़ने के ४५ माइक्रोलीटर तैयार करना सुनिश्चित होता है । प्रत्येक नमूने में पतला जीनोमिक डीएनए के दो माइक्रोलीटर अच्छी तरह से जोड़ें और प्रत्येक नकारात्मक नियंत्रण के लिए ट्राइस हाइड्रोक्लोराइड के दो माइक्रोलीटर अच्छी तरह से जोड़ें।

सकारात्मक नियंत्रण को छोड़कर पूरी प्लेट को अच्छी तरह से सील करें। इसके बाद, सकारात्मक नियंत्रण के अलावा के लिए नामित क्षेत्र में जाएं। इसी के साथ सकारात्मक नियंत्रण के दो माइक्रोलीटर जोड़ें और फिर प्लेट को पूरी तरह से सील करें।

पीआरसी 1 प्लेट को संक्षेप में स्पिन करने और कुओं के किनारों से किसी भी अवशिष्ट सामग्री को नीचे खींचने के लिए पीसीआर प्लेट स्पिनर का उपयोग करें। टेक्स्ट प्रोटोकॉल में बताए गए थर्मल साइकिलर में पीसीआर 1 प्लेट चलाएं। इसके बाद, पीसीआर के दूसरे दौर के लिए रिएजेंट्स को टेबल वन में सूचीबद्ध के रूप में मिलाएं।

इस पीसीआर 2 मिक्स के 28 माइक्रोलीटर एक नई 96 वेल पीसीआर प्लेट के 85 कुओं में जोड़ें। इस प्लेट को पीसीआर 2 के रूप में लेबल करें। एक प्लेट स्पिनर का उपयोग करना, कुओं के किनारों से किसी भी अवशिष्ट सामग्री को खींचने के लिए पीसीआर 1 प्लेट को संक्षेप में स्पिन करें।

इस प्लेट के प्रत्येक कुएं में ट्राइस हाइड्रोक्लोराइड के 80 माइक्रोलीटर जोड़ें। इसके बाद पीसीआर 1 प्लेट के प्रत्येक कुएं से दो माइक्रोलीटर को पीसीआर 2 प्लेट में संबंधित कुओं में स्थानांतरित करने के लिए एक मुंगेली-चैनल पिपेट का उपयोग करें। पीसीआर 2 प्लेट को साफ चिपकने वाले रैप के साथ सील करें।

संक्षेप में प्लेट स्पिनर में पीसीआर 2 प्लेट स्पिन । इस बीच, पीसीआर 1 प्लेट को माइनस 20 डिग्री सेल्सियस पर लॉन्गटर्म स्टोरेज के लिए हीट सीलिंग फिल्म के साथ सील करें । पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित थर्मल साइकिलर में पीसीआर 2 प्लेट चलाएं।

फिर संक्षेप में कुओं के किनारों से किसी भी अवशिष्ट सामग्री को खींचने के लिए पीसीआर 2 प्लेट को स्पिन करें। एक मल्टी-चैनल पिपेट का उपयोग करके, प्रत्येक कुएं में ट्राइस हाइड्रोक्लोराइड के 60 माइक्रोलीटर जोड़ें। इसके बाद, दो 48 पर प्रत्येक कुएं के 15 माइक्रोलीटर चलाएं, एक प्रतिशत एगरेज जैल जिसमें एथिडियम ब्रोमाइड होता है।

प्रवर्धित उत्पाद और उनके अनुमानित आकार वाले कुओं की पहचान करें और जेल छवि को बचाएं। इसके बाद, कमजोर पड़ने का निर्धारण करें जिस पर 30 प्रतिशत से अधिक कुएं प्रवर्धित उत्पाद के लिए सकारात्मक नहीं हैं। सबसे पहले, पीसीआर 2 प्लेट को संक्षेप में स्पिन करने और कुओं के किनारों से किसी भी अवशिष्ट सामग्री को नीचे खींचने के लिए एक प्लेट स्पिनर का उपयोग करें।

एक नई 96 अच्छी तरह से मिडी प्लेट के संबंधित कुओं के लिए प्रवर्धित उत्पाद युक्त कुओं से 40 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करें। इसके बाद, चुंबकीय मोतियों को कमरे के तापमान में लाना सुनिश्चित करना और 80 प्रतिशत इथेनॉल का एक ताजा समाधान तैयार करना सुनिश्चित करना एक चुंबकीय फ़ीड आधारित शुद्धिकरण किट निर्धारित करें। एक बार मोती कमरे के तापमान भंवर तक पहुंचने के लिए उन्हें सुनिश्चित करें कि वे अच्छी तरह से निलंबित कर रहे हैं।

एक मल्टी-चैनल पिपेट का उपयोग करके, मिडी प्लेट के प्रत्येक कुएं में प्रवर्धित उत्पाद के 40 माइक्रोलीटर में मोतियों के 40 माइक्रोलीटर जोड़ें। धीरे-धीरे 10 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं। पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।

इसके बाद प्लेट को मैग्नेटिक स्टैंड पर ट्रांसफर कर दो मिनट के लिए आराम करने दें। इसके बाद सुपरनिट को हटाकर छोड़ दें। प्लेट के साथ अभी भी स्टैंड पर, प्रत्येक अच्छी तरह से 80 प्रतिशत इथेनॉल समाधान के दो सौ माइक्रोलीटर जोड़कर मोतियों को धोएं।

30 सेकंड के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट और फिर हटा दें और सुपरनैंट को त्याग दें। इस वॉश प्रक्रिया को एक बार इथेनॉल को जोड़ने से लेकर सुपरनैंट को त्यागने के लिए दोहराएं। एक बहु-चैनल पिपेट का उपयोग करके किसी भी अतिरिक्त इथेनॉल को हटा दें।

मोतियों की हवा को 15 मिनट तक सूखने दें। इसके बाद स्टैंड से थाली निकाल लें। प्रत्येक अच्छी तरह से एल्यूशन बफर के 30 माइक्रोलीटर जोड़ें और धीरे-धीरे 10 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं।

दो मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट। प्लेट को वापस चुंबकीय स्टैंड पर रखें और इसे दो मिनट के लिए आराम करने दें। एक मल्टी-चैनल पिपेट का उपयोग करके, सुपरनेट के 25 माइक्रोलीटर को एक नए 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट के संबंधित कुओं में स्थानांतरित करें।

इसके बाद, प्रत्येक प्रवर्धित डीएनए उत्पाद की अनुमानित एकाग्रता को निर्धारित करने और रिकॉर्ड करने के लिए स्पेक्ट्रा फोटोमीटर का उपयोग करें। एक डबल फंसे डीएनए क्वांटिफिकेशन किट को सेट करें और बाँझ डीएनए-मुक्त पानी में एक बार बफर को पतला करें। एक फ्लैट नीचे ऊतक संस्कृति प्लेट में खाली कुओं की एक उचित संख्या में बफर के ९९ माइक्रोलीटर जोड़ें ।

फिर, तीन खाली कुओं में बफर के एक सौ माइक्रोलीटर जोड़ें। प्रत्येक प्रवर्धित उत्पाद को मापा जाना चाहिए ताकि प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त बफर में त्रिपालेट में शुद्ध डीएनए का एक माइक्रोलीटर जोड़ा जा सके। तनु लैम्ब्डा डबल फंसे डीएनए 10 गुना दो नैनोग्राम प्रति माइक्रोलीटर से मानकों को तैयार करने के लिए शून्य शून्य नैनोग्राम प्रति माइक्रोलीटर बिंदु ।

तीन कुओं में प्रत्येक डबल फंसे डीएनए मानक के १०० माइक्रोलीटर जोड़ें । बफर के साथ फ्लोरेसेंस डाई एक से दो सौ तक पतला करें। जल्दी से प्रत्येक अच्छी तरह से एक सौ माइक्रोलीटर जोड़ें जिसमें एक नमूना, खाली या मानक होता है और ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिश्रण होता है।

इसके बाद, प्रकाश के संपर्क से बचने के लिए प्लेट को पन्नी से ढक दें। माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके, फ्लोरेसेंस उत्सर्जन को रिकॉर्ड करें। प्रत्येक नमूने में डबल फंसे डीएनए की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए दर्ज माप का उपयोग करें।

फिर प्रत्येक शुद्ध उत्पाद को पानी के साथ शून्य बिंदु दो नैनोग्राम प्रति माइक्रोलीटर की एकाग्रता में पतला करें। नेस्टेड पीसीआर के बाद, प्रवर्धित उत्पादों को एक प्रतिशत एगर उठे जेल पर चलाया जाता है। पीसीआर की प्रारंभिक गुणवत्ता नियंत्रणों का निरीक्षण करके निर्धारित की जा सकती है।

चूंकि प्रवर्धित उत्पाद वाले नकारात्मक नियंत्रण संदूषण का संकेत देते हैं और प्रवर्धित उत्पाद के बिना सकारात्मक नियंत्रण अपर्याप्त प्रवर्धन का संकेत देते हैं। केवल कुओं को अंत बिंदु कमजोर पड़ने पर चलाया जाता है जिसमें एकल प्रवर्धित प्रोवायरस होते हैं, अनुक्रमण के लिए विचार किया जाता है। जबकि विभिन्न लंबाई के कई प्रवर्धित प्रोवायरस युक्त कुओं को इस स्तर पर कल्पना की जा सकती है, उन्हें अनुक्रमण के लिए नहीं चुना जाना चाहिए।

डी नोवो असेंबली के लिए, इकट्ठे हुए कॉन्टिग्स की गुणवत्ता को पर्याप्त गहराई और कवरेज की समानता के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है। असमान कवरेज की उपस्थिति से इस स्तर पर मिश्रित आबादी की भी पहचान की जा सकती है । एक प्रतिभागी से अलग दृश्यों के दृश्य प्रतिनिधित्व से पता चलता है कि उनके दृश्यों का ९७ प्रतिशत दोषपूर्ण हैं ।

प्रभावक और संक्रमणकालीन स्मृति सीडी 4 सकारात्मक टी कोशिकाओं में पाए जाने वाले अक्षुण्ण दृश्यों के साथ। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि केवल सीमित कमजोर पड़ने पर प्राप्त केवल प्रवर्धित उत्पाद, यहीं पर 30 प्रतिशत से अधिक कुएं सकारात्मक नहीं होते हैं, एक भी प्रोवायरस होते हैं। इस प्रक्रिया के बाद, एचआईवी प्रोवायरस की आनुवंशिक संरचना निर्धारित करने के लिए प्रवर्धित उत्पादों को अनुक्रमित किया जा सकता है।

इसके विकास के बाद, इस तकनीक ने एचआईवी के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए चिकित्सा पर रोगियों में आनुवंशिक रूप से बरकरार एचआईवी प्रोवायरस और विभिन्न सेल प्रकारों के वितरण का पता लगाने का मार्ग प्रशस्त किया ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि आनुवंशिक रूप से अक्षुण्ण और संभावित रूप से प्रतिकृति सक्षम प्रोवायरस कहां छिपाएं। यह न भूलें कि एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं के साथ काम करना खतरनाक हो सकता है और इस प्रक्रिया को निष्पादित करते समय उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनना और प्रमाणित प्रयोगशाला में काम करना हमेशा लिया जाना चाहिए।