この方法は、HIVプロウイルスおよび異なる細胞タイプの遺伝的組成を決定するなど、HIV分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。特に遺伝的に無傷で、潜在的に複製能力のあるものを特定する。この技術の主な利点は、単一のHIV感染細胞からほぼ全長HIVプロウイルスを増幅し、次に次世代シーケンシングによってこれらを配列できることです。
まず、テキスト プロトコルで説明されているように、すべてのバッファを準備します。細胞ペレットを取得し、100万個の細胞あたり100マイクロリットルのライシスバッファーを追加します。上下にピペットを入れ、混ぜます。
サーマルサイクラーで55°Cで1時間インキュベートし、摂氏85度を15分間加えて細胞をライスします。単一のHIV-1 DNAプロウイルスの増幅を開始するには、テキストプロトコルの表1に示すように、第1ラウンドPCR用試薬を混合します。96ウェルPCRプレートの85ウェルに38マイクロリットルを加え、このプレートをPCR 1とラベル付けします。
この後、PCR1プレートをゲノムDNAの添加用に指定した透明な領域に移動させます。塩酸トリ酸塩を使用して、1〜3の比から1〜81の比率からゲノムDNAを連続的に希釈し、各希釈液の45マイクロリットルを調製することを確認する。希釈したゲノムDNAを各サンプルウェルに2マイクロリットル、塩酸塩トリトリリットルを各陰性対照ウェルに2マイクロリットル加えます。
正のコントロールを除いてプレート全体を密封します。次に、正のコントロールを追加するために指定された領域に移動します。対応するウェルに正のコントロールの2マイクロリットルを追加し、完全にプレートをシールします。
PCR プレート スピナーを使用して、PRC 1 プレートを短時間回転させ、残りの内容物をウェルの側面から引き下げます。テキストプロトコルで概説されているように、サーマルサイクラーでPCR 1プレートを実行します。次に、表1に示したPCRの第2ラウンドの試薬を混合します。
このPCR 2ミックスの28マイクロリットルを新しい96ウェルPCRプレートの85ウェルに加えます。このプレートに PCR 2 というラベルを付けます。プレートスピナーを使用して、PCR 1プレートを簡単に回転させて、ウェルの側面から残った内容物を引き下げる。
このプレートの各ウェルに塩酸塩トリトリリットル80マイクロリットルを加えます。この後、マルチチャネルピペットを使用して、PCR 1プレートの各ウェルからPCR 2プレート内の対応するウェルに2マイクロリットルを転送します。PCR 2プレートを透明な粘着ラップでシールします。
プレートスピナーでPCR 2プレートを簡単に回転させます。一方、PCR 1プレートをヒートシールフィルムで密封し、長期保存のためマイナス20°Cで保存します。テキストプロトコルで説明されているように、サーマルサイクラーでPCR 2プレートを実行します。
次に、PCR 2プレートを簡単に回転させて、残った内容物をウェルの側面から引き下げる。マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに塩酸塩トリ60マイクロリットルを加えます。次に、エチジウム臭化物を含む2つの48ウェルに15マイクロリットルのアガロースゲルを1%プリキャストして実行します。
増幅された製品を含むウェルとそのおおよそのサイズを特定し、ゲル画像を保存します。この後、30%以下のウェルが増幅産物に陽性である希釈を決定する。まず、プレートスピナーを使用して、PCR 2プレートを短時間回転させ、残りの内容物をウェルの側面から引き下げます。
増幅された製品を含むウェルから40マイクロリットルを新しい96ウェルミディプレートの対応する井戸に移します。次に、磁性ビーズを室温に持ち込み、80%エタノールの新鮮な溶液を調製することを確認する、磁気フィードベースの精製キットをセットします。ビーズが室温に達すると、それらが完全に再中断されていることを確認するためにそれらを渦。
マルチチャンネルピペットを使用して、ミディプレートの各ウェルに40マイクロリットルの増幅産物に40マイクロリットルのビーズを加えます。上下に10回軽くピペットで混ぜます。室温で5分間インキュベートします。
その後、プレートを磁気スタンドに移し、2分間放置します。この後、上清を取り除き、廃棄します。プレートをスタンドに残したまま、各ウェルに80%エタノール溶液の200マイクロリットルを加えてビーズを洗います。
室温で30秒間インキュベートし、上清を取り除いて捨てます。この洗浄プロセスをエタノールを添加して上澄み物を捨てるまで一度繰り返します。マルチチャネルピペットを使用して、余分なエタノールを除去します。
ビーズを15分間乾燥させます。この後、スタンドからプレートを取り外します。各ウェルに溶出バッファーの30マイクロリットルを追加し、10回上下に軽くピペットで混ぜます。
室温で2分間インキュベートします。プレートを磁気スタンドに戻し、2分間放置します。マルチチャンネルピペットを使用して、上清の25マイクロリットルを新しい96ウェルPCRプレートの対応するウェルに移します。
次に、スペクトル光度計を使用して、各増幅されたDNA産物の近似濃度を決定し、記録します。二本鎖DNA定量キットをセットし、無菌DNAフリー水でバッファーを1回希釈します。平底組織培養プレートの適切な数の空の井戸に99マイクロリットルのバッファーを追加します。
その後、100マイクロリットルのバッファーを3つの空き井戸に加えます。測定される増幅産物ごとに、精製されたDNAを1マイクロリットルずつ三重に加えて、各ウェル含有緩衝液に添加する。希釈ラムダ二本鎖DNAは、マイクロリットル当たり2ナノグラムから10倍に、マイクロリットル当たりゼロナノグラムをポイントし、標準を調製する。
各二本鎖DNA標準の100マイクロリットルを3つの井戸に加えます。蛍光染料をバッファーで1~200個希釈します。サンプル、ブランクまたは標準を含む各井戸に100マイクロリットルを素早く加え、上下にピペットを入れます。
この後、光との接触を避けるためにホイルでプレートを覆います。マイクロプレートリーダーを使用して、蛍光放出を記録します。各サンプルに二本鎖DNAの濃度を測定するために記録された測定値を使用してください。
その後、各精製物を水で希釈し、マイクロリットル当たり2ナノグラムの濃度をゼロポイントにします。入れ子 PCR に続いて、増幅産物は1%アガロースゲルで実行されます。PCR の初期品質は、コントロールを検査することによって決定できます。
増幅産物を含む陰性制御は汚染を示し、増幅産物を含まない正の対照は不十分な増幅を示す。単一増幅プロウイルスを含む終点希釈時に実行されるウェルのみがシーケンシング用に考慮されます。異なる長さの複数の増幅されたプロウイルスを含む井戸は、この段階で視覚化することができますが、シーケンシングのために選択しないでください。
デノボアセンブリの場合、組み立てられたコンティグの品質は、カバレッジの十分な深さと均一性を評価することができます。混合集団は、不均一なカバレッジの存在によってこの段階で識別することもできます。1人の参加者から分離された配列の視覚的表現は、その配列の97%に欠陥があることを明らかにする。
エフェクターおよび過渡的メモリCD4陽性T細胞に見られる無傷の配列を有する。この手順を試みる一方で、限度希釈で得られた増幅産物(ウェルの30%以下が陽性)だけが単一のプロウイルスを含んでいるということを覚えておくことが重要です。この手順に従って、増幅産物を配列決定してHIVプロウイルスの遺伝子組成を決定することができる。
その開発後、この技術は、HIV分野の研究者が、遺伝的に無傷のHIVプロウイルスおよび治療中の患者の異なる細胞タイプの分布を探求し、遺伝的に無傷で潜在的に複製可能な有能なプロウイルスが隠れる場所を決定する道を開いた。HIV感染細胞との作業は危険であり、適切な個人用保護具の着用や認定ラボの作業などの予防措置は、常にこの手順を実行しながら取られる必要があることを忘れないでください。
