11.4K Views
•
10:18 min
•
October 16th, 2018
DOI :
October 16th, 2018
•0:04
Title
0:40
Lysis of HIV-1-infected Cells and Amplification of Single HIV-1 DNA Proviruses via Nested PCR
4:23
DNA Purification and Quantification
8:12
Results: Analysis of Amplified Near Full-length HIV-1 Proviruses
9:21
Conclusion
Transcript
Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i HIV-feltet som å bestemme den genetiske sammensetningen av HIV-provirus og forskjellige celletyper. Spesielt identifisere de som er genetisk intakt og potensielt replikering kompetent. De viktigste fordelene med denne teknikken er at det tillater oss å forsterke nær full lengde HIV provirus fra enkelt HIV-infiserte celler og deretter sekvensere disse ved neste generasjons sekvensering.
For å begynne, klargjør alle buffere som beskrevet i tekstprotokollen. Få en cellepellet og legg til hundre mikroliter lysisbuffer per million celler. Bland ved å pipetter opp og ned.
Lyse cellene ved å inkubere i en termisk cycler på 55 grader celsius i en time og deretter legge til 85 grader celsius i 15 minutter. For å begynne å forsterke enkelt HIV-1 DNA provirus blande reagenser for første runde PCR som oppført i tabell en av tekstprotokollen. Tilsett 38 mikroliter til 85 brønner i en 96-brønns PCR-plate og merk denne platen som PCR 1.
Etter dette flytter du PCR 1-platen til et klart område som er utpekt for tilsetning av genomisk DNA. Ved hjelp av trishydroklorid fortynner det genomiske DNA fra et forhold på en til tre til et forhold på en til 81, og sørg for å forberede 45 mikroliter av hver fortynning. Tilsett to mikroliter fortynnet genomisk DNA til hver prøvebrønn og to mikroliter trishydroklorid til hver negativ kontrollbrønn.
Forsegle hele platen med unntak av den positive kontrollen godt. Deretter flytter du til et område som er angitt for tillegg av den positive kontrollen. Tilsett to mikroliter av den positive kontrollen til den tilsvarende brønnen og forsegle deretter platen helt.
Bruk en PCR plate spinner til kort spinne PRC 1 plate og trekke ned eventuelle gjenværende innhold fra sidene av brønnene. Kjør PCR 1-platen i termal cycler som beskrevet i tekstprotokollen. Bland deretter reagensene for den andre runden av PCR som oppført i tabell én.
Tilsett 28 mikroliter av denne PCR 2-blandingen til 85 brønner av en ny 96-brønns PCR-plate. Merk denne platen som PCR 2. Bruk en platespinner til å spinne PCR 1-platen for å trekke ned restinnhold fra sidene av brønnene.
Tilsett 80 mikroliter trishydroklorid til hver brønn av denne platen. Etter dette bruker du en mutlikanalpipette til å overføre to mikroliter fra hver brønn på PCR 1-platen til de tilsvarende brønnene i PCR 2-platen. Forsegle PCR 2-platen med klar klebemiddelinnpakning.
Spinn kort PCR 2-platen i platespinneren. I mellomtiden forsegler du PCR 1-platen med en varmeforseglingsfilm for langsiktig lagring ved minus 20 grader celsius. Kjør PCR 2-platen i en termisk cycler som beskrevet i tekstprotokollen.
Deretter spinner du kort PCR 2-platen for å trekke ned restinnhold fra sidene av brønnene. Bruk en flerkanals pipette til å legge til 60 mikroliter trishydroklorid til hver brønn. Deretter kjører du 15 mikroliter av hver brønn på to 48 godt precast en prosent agarose geler som inneholder ethidiumbromid.
Identifiser brønnene som inneholder det forsterkede produktet og deres omtrentlige størrelser og lagre gelbildet. Etter dette bestemmer du fortynningen der ikke mer enn 30 prosent av brønnene er positive for forsterket produkt. Bruk først en platespinner til kort å spinne PCR 2-platen og trekke ned restinnhold fra sidene av brønnene.
Overfør 40 mikroliter fra brønnene som inneholder forsterket produkt til tilsvarende brønner av en ny 96 brønn midi plate. Deretter setter du ut et magnetisk fôrbasert rensesett som sørger for å bringe de magnetiske perlene til romtemperatur og forberede en frisk løsning på 80 prosent etanol. Når perlene når romtemperatur vortex dem for å sikre at de er grundig resuspended.
Bruk en flerkanals pipette til å legge til 40 mikroliter perler til de 40 mikroliter av forsterket produkt i hver brønn av midiplaten. Bland ved å forsiktig pipettering opp og ned 10 ganger. Inkuber ved romtemperatur i fem minutter.
Deretter overfører du platen til et magnetisk stativ og lar den hvile i to minutter. Etter dette fjerner og kaster du det overnaturlige. Med platen fortsatt på stativet, vask perlene ved å legge til to hundre mikroliter av 80 prosent etanolløsning til hver brønn.
Inkuber ved romtemperatur i 30 sekunder, og fjern og kast deretter overnaturvæsken. Gjenta denne vaskeprosessen en gang fra å legge til etanol til å kaste supernatanten. Bruk av en flerkanals pipette fjerne overflødig etanol.
La perlene lufttørke i 15 minutter. Etter dette, fjern platen fra stativet. Tilsett 30 mikroliter elutionbuffer til hver brønn og bland ved å forsiktig pipering opp og ned 10 ganger.
Inkuber ved romtemperatur i to minutter. Plasser platen tilbake på magnetstativet og la den hvile i to minutter. Bruk en flerkanals pipette til å overføre 25 mikroliter av supernatanten til de tilsvarende brønnene til en ny 96-brønns PCR-plate.
Deretter bruker du et spektrafotometer til å bestemme og registrere den omtrentlige konsentrasjonen av hvert forsterkede DNA-produkt. Sett ut et dobbelt strandet DNA-kvantifiseringssett og fortynne bufferen til en gang i sterilt DNAs-fritt vann. Tilsett 99 mikroliter av bufferen til et passende antall tomme brønner i en flat bunnvevskulturplate.
Deretter legger du til hundre mikroliter buffer til tre tomme brønner. For hvert forsterket produkt som skal måles, legg til en mikroliter renset DNA i triplikat til hver brønn som inneholder buffer. Fortynn lambda dobbel strandet DNA 10 fold fra to nanogram per mikroliter for å peke null null nanogram per mikroliter for å forberede standardene.
Tilsett hundre mikroliter av hver dobbelt strandet DNA-standard til tre brønner. Fortynn florescence fargestoff en til to hundre med buffer. Legg raskt til hundre mikroliter i hver brønn som inneholder en prøve, tom eller standard og bland ved å pipetter opp og ned.
Etter dette, dekk platen med folie for å unngå kontakt med lys. Ved hjelp av en mikroplateleser registrerer du florescence-utslippet. Bruk de registrerte målingene til å bestemme konsentrasjonen av dobbelt strandet DNA i hver prøve.
Deretter fortynner hvert rensede produkt med vann til en konsentrasjon på nullpunkt to nanogram per mikroliter. Etter nestet PCR kjøres de forsterkede produktene på en en prosent agarose gel. Den opprinnelige kvaliteten på PCR kan bestemmes ved å inspisere kontrollene.
Som negative kontroller som inneholder forsterket produkt indikerer forurensning og de positive kontrollene uten forsterket produkt indikerer utilstrekkelig forsterkning. Bare brønner som kjøres ved endepunktfortynning som inneholder enkeltforsterkerte provirus vurderes for sekvensering. Mens brønner som inneholder flere forsterkede provirus av forskjellige lengder kan visualiseres på dette stadiet, bør de ikke velges for sekvensering.
For de novo-monteringen kan kvaliteten på de monterte kontinger vurderes for tilstrekkelig dybde og jevnhet av dekning. Blandede populasjoner kan også identifiseres på dette stadiet ved tilstedeværelse av ujevn dekning. Visuell representasjon av sekvensene isolert fra én deltaker viser at 97 prosent av sekvensene deres er defekte.
Med intakte sekvenser funnet i effector og overgangsminne CD4 positive T-celler. Mens du prøver denne prosedyren er det viktig å huske at bare forsterkede produkter oppnådd ved begrensende fortynning, det er der ikke mer enn 30 prosent av brønnene er positive, inneholder et enkelt provirus. Etter denne prosedyren kan forsterkede produkter sekvenseres for å bestemme den genetiske sammensetningen av HIV-provirus.
Etter utviklingen banet denne teknikken vei for forskere innen HIV for å utforske fordelingen av genetisk intakte HIV-provirus og ulike celletyper hos pasienter på terapi for å avgjøre hvor genetisk intakt og potensielt replikering av kompetente provirus skjuler seg. Ikke glem at arbeid med HIV-infiserte celler kan være farlig og forholdsregler som bruk av passende personlig verneutstyr og arbeid av et sertifisert laboratorium bør alltid tas mens du utfører denne prosedyren.
Full lengde personlige proviral sekvenser (vende) gir en effektiv og høy gjennomstrømming metode for forsterkning og sekvensering av enkeltrom, nær full lengde (intakt og defekt) HIV-1 proviruses og gir mulighet for fastsettelse av sitt potensial replikering-kompetanse. KNIPSER overvinner begrensninger av tidligere analyser for sekvens latente HIV-1 reservoaret.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved