11.4K Views
•
10:18 min
•
October 16th, 2018
DOI :
October 16th, 2018
•0:04
Title
0:40
Lysis of HIV-1-infected Cells and Amplification of Single HIV-1 DNA Proviruses via Nested PCR
4:23
DNA Purification and Quantification
8:12
Results: Analysis of Amplified Near Full-length HIV-1 Proviruses
9:21
Conclusion
Transcript
Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom HIV-området som att bestämma den genetiska sammansättningen av HIV-provirus och olika celltyper. Speciellt identifiera de som är genetiskt intakt och potentiellt replikering kompetent. De främsta fördelarna med denna teknik är att det tillåter oss att förstärka nära full längd HIV proviruses från enda HIV-infekterade celler och sedan sekvens dessa genom nästa generations sekvensering.
Börja med att förbereda alla buffertar som skisseras i textprotokollet. Erhåll en cell pellet och tillsätt hundra mikroliter av lysbuffert per miljon celler. Blanda genom pipettering upp och ner.
Lysa cellerna genom att inkubera i en termisk cycler vid 55 grader celsius i en timme och sedan lägga till 85 grader celsius i 15 minuter. Till att börja förstärka enda HIV-1 DNA proviruses blanda reagenserna för den första omgången PCR som anges i tabell ett av textprotokollet. Lägg till 38 mikroliter till 85 brunnar i en 96 väl PCR-platta och märk denna platta som PCR 1.
Efter detta, flytta PCR 1-plattan till ett tydligt område som utsetts för tillägg av genomisk DNA. Använda tris hydroklorid seriellt späda det genomiska DNA från ett förhållande av ett till tre till ett förhållande av ett till 81 se till att förbereda 45 mikroliter av varje spädning. Tillsätt två mikroliter av utspädd genomisk DNA till varje prov väl och två mikroliter av tris hydroklorid till varje negativ kontroll väl.
Täta hela plattan förutom den positiva kontroll väl. Därefter flyttar du till ett område som utsetts för tillägg av den positiva kontrollen. Tillsätt två mikroliter av den positiva kontrollen till motsvarande brunn och sedan försegla plattan helt.
Använd en PCR-plattspinnare för att kort snurra på PRC 1-plattan och dra ner eventuellt restinnehåll från sidorna av brunnarna. Kör PCR 1-plattan i termisk cycler som beskrivs i textprotokollet. Därefter blanda reagenserna för den andra omgången av PCR som anges i tabell ett.
Lägg till 28 mikroliter av denna PCR 2 mix till 85 brunnar av en ny 96 väl PCR-platta. Märk denna platta som PCR 2. Med hjälp av en tallriksspinnare snurrar du kortfattat PÅ PCR 1-plattan för att dra ner eventuellt restinnehåll från sidorna av brunnarna.
Tillsätt 80 mikroliter av trishydroklorid till varje brunn av denna platta. Efter detta, använd en mutli-kanalpipett för att överföra två mikroliter från varje brunn av PCR 1-plattan till motsvarande brunnar i PCR 2-plattan. Täta PCR 2-plattan med klar självhäftande inpackning.
Kort snurra PCR 2 plattan i plattan spinner. Under tiden försegla PCR 1-plattan med en värme tätning film för långsiktig lagring vid minus 20 grader celsius. Kör PCR 2-plattan i en termisk cycler enligt textprotokollet.
Snurra sedan kort på PCR 2-plattan för att dra ner eventuellt restinnehåll från sidorna av brunnarna. Med hjälp av en flerkanalspipett, tillsätt 60 mikroliter av trishydroklorid till varje brunn. Därefter kör 15 mikroliter av varje brunn på två 48 väl precast en procent agarosgeler som innehåller ethidiumbromid.
Identifiera de brunnar som innehåller den förstärkta produkten och deras ungefärliga storlekar och spara gelbilden. Efter detta, bestämma utspädningen vid vilken högst 30 procent av brunnar är positiva för förstärkt produkt. Använd först en tallriksspinnare för att kort snurra PCR 2-plattan och dra ner eventuellt restinnehåll från sidorna av brunnarna.
Överför 40 mikroliter från brunnarna som innehåller förstärkt produkt till motsvarande brunnar av en ny 96 brunns midiplatta. Därefter anges en magnetisk matning baserad reningssats se till att föra de magnetiska pärlorna till rumstemperatur och förbereda en ny lösning på 80 procent etanol. När pärlorna når rumstemperatur virvel dem att se till att de är grundligt återanvänds.
Med hjälp av en flerkanalig pipetter, tillsätt 40 mikroliter av pärlor till de 40 mikroliter av förstärkt produkt i varje brunn av midiplattan. Blanda genom att försiktigt pipettera upp och ner 10 gånger. Inkubera i rumstemperatur i fem minuter.
Överför sedan plattan till ett magnetiskt stativ och låt den vila i två minuter. Efter detta, ta bort och kasta supernatanten. Med plattan fortfarande på stativet, tvätta pärlorna genom att lägga till två hundra mikroliter av 80 procent etanollösning till varje brunn.
Inkubera i rumstemperatur i 30 sekunder och ta sedan bort och kassera supernatanten. Upprepa denna tvättprocess en gång från att tillsätta etanol till att kassera supernatanten. Med hjälp av en flerkanalspipett avlägsnas eventuellt överskott av etanol.
Låt pärlorna lufttorka i 15 minuter. Efter detta, ta bort plattan från stativet. Tillsätt 30 mikroliter elueringsbuffert till varje brunn och blanda genom att försiktigt pipettera upp och ner 10 gånger.
Inkubera i rumstemperatur i två minuter. Placera tillbaka plattan på magnetstativet och låt den vila i två minuter. Med hjälp av en flerkanalspipett överför du 25 mikroliter av supernatanten till motsvarande brunnar av en ny 96 brunns PCR-platta.
Därefter använder en spektra fotometer för att bestämma och registrera den ungefärliga koncentrationen av varje förstärkt DNA-produkt. Ställ ut en dubbelsträngad DNA-kvantifieringssats och späd bufferten till en gång i sterilt DNAs-fritt vatten. Tillsätt 99 mikroliter av bufferten till ett lämpligt antal tomma brunnar i en platt bottenvävnadskulturplatta.
Lägg sedan till hundra mikroliter av buffert till tre tomma brunnar. För varje förstärkt produkt som skall mätas tillsätt en mikroliter av renat DNA i tre exemplar till varje brunn som innehåller buffert. Späd lambda dubbelsträngad DNA 10 gånger från två nanogram per mikroliter till punkt noll noll nanogram per mikroliter för att förbereda standarderna.
Lägg till hundra mikroliter av varje dubbelsträngad DNA-standard till tre brunnar. Späd florescensfärgmedlet ett till två hundra med buffert. Tillsätt snabbt hundra mikroliter till varje brunn som innehåller ett prov, blankt eller standard och blanda genom pipettering upp och ner.
Täck plattan efter detta med folie för att undvika kontakt med ljus. Med hjälp av en mikroplattläsare, spela in florescence utsläpp. Använd de registrerade mätningarna för att bestämma koncentrationen av dubbelsträngat DNA i varje prov.
Späd sedan varje renad produkt med vatten till en koncentration av nollpunkt två nanogram per mikroliter. Efter kapslade PCR, de förstärkta produkterna körs på en en procent agarose gel. Den initiala kvaliteten på PCR kan bestämmas genom att kontrollera kontrollerna.
Eftersom negativa kontroller som innehåller förstärkt produkt indikerar kontaminering och de positiva kontrollerna utan förstärkt produkt tyder på otillräcklig förstärkning. Endast brunnar köra vid slutpunkt utspädning som innehåller enda amplifierade proviruses anses för sekvensering. Medan brunnar som innehåller flera förstärkta provirus av olika längder kan visualiseras i detta skede, bör de inte väljas för sekvensering.
För de novo-monteringen kan de hopmonterade contigsnas kvalitet bedömas med hänsyn till tillräckligt djup och jämnhet i täckningen. Blandade populationer kan också identifieras i detta skede genom förekomsten av ojämn täckning. Visuell representation av sekvenser isolerade från en deltagare visar att 97 procent av deras sekvenser är defekta.
Med intakt sekvenser som finns i effector och övergångsminne CD4 positiva T-celler. Samtidigt försöker detta förfarande är det viktigt att komma ihåg att endast förstärkta produkter som erhållits vid den begränsande utspädning, det är där inte mer än 30 procent av brunnarna är positiva, innehåller en enda provirus. Efter detta förfarande kan förstärkta produkter sekvenseras för att bestämma den genetiska sammansättningen av HIV provirus.
Efter dess utveckling, banade denna teknik vägen för forskare inom hiv-området att utforska fördelningen av genetiskt intakt HIV provirus och olika celltyper hos patienter på terapi för att avgöra var genetiskt intakt och potentiellt replikering kompetenta proviruses dölja. Glöm inte att arbeta med HIV-infekterade celler kan vara farligt och försiktighetsåtgärder såsom bär lämplig personlig skyddsutrustning och arbetar ett certifierat laboratorium bör alltid vidtas när du utför detta förfarande.
Fullängds enskilda proviral sekvensering (VOLTER) ger en effektiv och hög genomströmning metod för förstärkning och sekvensering av singel, nära fullängds (intakt och defekta) HIV-1-proviruses och möjliggör bestämning av deras potential replikering-kompetensen. FLIPS övervinner begränsningarna i tidigare analyser för att sekvensera reservoaren latent HIV-1.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved