Name: high-throughput dna extraction and genotyping of 3dpf zebrafish larvae by fin clipping
Uploaded: 2018-06-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping at JoVE.com

המחברים רוצה להודות מודלים מחלה נדירה ורשת מנגנון (RDMM) (במימון את קנדי מוסדות של הבריאות מחקר (CIHR) ואת הגנום קנדה). CK נתמכת על ידי פרס מלגת UROP (מאוניברסיטת אוטווה). DLJ נתמך על ידי מלגה לתואר שני של קנדה וניהר. חוג ידידי הפקולטה נתמכת על ידי פרס בתר קנדי מוסדות של הבריאות מחקר (CIHR). המחברים תודה על גנטיקה החברה של אמריקה למתן הרשאה לפרסם פרוטוקול זה וכדי להשתמש עיבוד של 5 איור משלים מ פנה, ואח.

נהלים מעורבים בעלי חיים אושרו והנושאים הם על פי הנחיות טיפול בבעלי חיים מסופקים על ידי המועצה הקנדית על בעלי חיים והטיפול מאוניברסיטת אוטווה ועדות טיפול בבעלי חיים.
1. הכנה
<ol><li>להכין את השטח לנתיחה על ידי מקליטה מכסה פטרי 9 ס מ עם קלטת autoclave על פני השטח הפנימי שלו. מקם את זה תחת מיקרוסקו?...

<ol>
	<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), (2013).</li><li>Stewart, A. M., Kalueff, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+better+and+more+valid+animal+models+of+brain+disorders.">Developing better and more valid animal models of brain disorders.</a> Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).</li><li>Grone, B. P., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+epilepsy+research:+legacies+and+new+directions.">Animal models in epilepsy research: legacies and new directions.</a> Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function.">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J Vis Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Doyon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+targeted+gene+disruption+in+zebrafish+using+designed+zinc-finger+nucleases.">Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases.</a> Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).</li><li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Genome+Editing+Using+High+Efficieny+TALENs.">In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li><li>Sander, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs.">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).</li><li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+a+CRISPR-Cas+system.">Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.</a> Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).</li><li>Pena, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyridoxine-Dependent+Epilepsy+in+Zebrafish+Caused+by+Aldh7a1+Deficiency.">Pyridoxine-Dependent Epilepsy in Zebrafish Caused by Aldh7a1 Deficiency.</a> Genetics. 207, 1501-1518 (2017).</li><li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+Scn1a+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment.">Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nat Commun. 4, 2410 (2013).</li><li>Godoy, R., Noble, S., Yoon, K., Anisman, H., Ekker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenetic+ablation+of+dopaminergic+neurons+leads+to+transient+locomotor+impairments+in+zebrafish+larvae.">Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae.</a> J Neurochem. 135, 249-260 (2015).</li><li>Scheldeman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobiology+of+Disease+mTOR-related+neuropathology+in+mutant+tsc2+zebra+fish+Phenotypic,+transcriptomic+and+pharmacological+analysis.">Neurobiology of Disease mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebra fish Phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis.</a> Neurobiol Dis. 108 (September), 225-237 (2017).</li><li>Zabinyakov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+first+knock-out+aldh7a1+zebrafish+model+for+pyridoxine-dependent+epilepsy+using+CRISPR-Cas9+technology.">Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology.</a> PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).</li><li>Grone, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epilepsy,+behavioral+abnormalities,+and+physiological+comorbidities+in+syntaxin-binding+protein+1+(STXBP1)+mutant+zebrafish.">Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish.</a> PLoS One. 11 (3), (2016).</li><li>Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+transgenic+zebrafish.">Rapid identification of transgenic zebrafish.</a> Trends Genet. 12 (1), 9-10 (1996).</li><li>Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-throughput+PCR-based+genotyping+of+larval+zebrafish+tail+biopsies.">A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies.</a> Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).</li><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+genotyping+method+for+genome-modified+animals+and+human+cells+generated+with+CRISPR/Cas9+system.">An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system.</a> Sci Rep. 4, 6420 (2014).</li><li>Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chelex+100+as+a+medium+for+simple+extraction+of+DNA+for+PCR-based+typing+from+forensic+material.">Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material.</a> Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).</li><li>Ewing, B., Green, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basecalling+of+automated+sequencer+traces+using+phred.+II.+Error+probabilities.">Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities.</a> Genome Res. 8, 175-185 (1998).</li></ol>

ג'ין כלי עריכה יש כבר מועסקים בדיוק להציג מוטציות, transgenes של דג זברה האחרונות שנים5,6,7,8. בעת ביצוע המחלה דוגמנות בשנת דג זברה, פנוטיפים זחל או ילדותי המוקדמות הם נצפו לעתים קרובות9,12,<su...

דג זברה (רזבורה rerio) הוא יצור חוליות בשימוש נרחב כמודל לחקירה המחלה, כמו גם לגבי בדיקות פרה של השערות טיפולית-1,-2,-3. בעלי חיים אלה יש זמן דור קצר, קל לטפל, להציג שיעור הרבייה גבוה, בעלות נמוכה, ולא נתונות בקלות שינויים גנטיים על-ידי microinjection של ה-DNA עוברי4. דרך ההתפתחות הגוברת של הרומן הטרנסגניים וג'ין עריכה טכנולוגיות כגון אבץ-אצבע nucleases (ZFN)5,6,Nucleases אפקטור כמו טל (TALENs)7, וקצר את מקובצים באופן קבוע Interspaced Palindromic חוזר (CRISPR) / CRISPR-הקשורים 9 (Cas9) מערכת8, דג זברה צפוי באופן משמעותי לשפר את ההבנה של מספר תנאים פיפטות. טכנולוגיות אלה שימשו כדי ליצור כיסויים ממוקד בשני סומאטית ולשנות germline בתאים דג זברה, ביעילות מחורזות גנטית בעלי חיים8. הדוגמאות האחרונות בספרות כוללות פיתוח מוצלח של דגמים גנטיים של אפילפסיה, הפרעות מטבוליות דג זברה3,9,10,11,12 .
עם ההתקדמות בעריכת הגנום דג זברה, מהיר ואמין genotyping הפך צעד הגבלת קצב מוטל בספק. זיהוי מוטציות DNA ספציפיים סמוכים לאתר החזוי לעריכת הגנום היעד היא שלב חיוני של הפרוטוקול. באופן מסורתי, טכניקות genotyping מאת פין מסיכה בדרך כלל רק שבוצעו בנער או מבוגר דג זברה. עם זאת, הזמן בילה דג זברה העלאת לבגרות (> 2 חודשים) מעכב במידה ניכרת התקדמות במחקר. במקרים רבים, לבגרות אינה יכולה להיות מושגת בשל הסתרה באמצעות גנים חיוניים (למשל, בדוגמנות מחלה) או רווח-של-פונקציה מוטציות שמוביל פנוטיפי השפעות מזיקות. בנוסף, מספר מבחני דורשים איגום של הזחלים, כגון ה-RNA או מטבוליט החילוץ, ולערב ובכך זיהוי מראש של אחרים, אשר עשויה להיות מאתגרת כאשר רק פוסט הוק genotyping טכניקות זמינים. את הדוגמאות הנ ל מדגישים את החשיבות של טכניקות genotyping זחל אשר נמצאים באותו זמן מדויק ולאפשר החלמה מלאה, התפתחות תקינה של הזחלים. Genotyping דג זברה בשלב מוקדם לא מופיע כעת כדי להיות בשימוש נרחב; זה משתקף על ידי פרסומים אחרונים של מודלים מחלה שבה הזחל אחרים מזוהים באמצעות פוסט-מורטם genotyping ולא genotyping לפני ביצוע הניסוי12,13,14. בנייר זה, אסטרטגיה קליפ פין זחל מוצגת במטרה לייעל את ההליכים genotyping שנוצרו קודם לכן.
בעבר, אסטרטגיות העסקת מערכת העיכול proteinase K גנוטיפ חיים דג זברה הזחלים הובילו פולימראז משתנה-תגובת שרשרת (PCR)-יעילות-15. למרות יותר שפורסם לאחרונה טכניקה ביופסיה הזנב מיקרוסקופיים סיפק תוצאות מבטיחות יותר16, אנחנו וארגונים אחרים לא היו מסוגלים להפיק את נצילות גבוהה והתאוששות DNA שדווחו על-ידי המחברים. עיכוב העיקריים של פרוטוקול מתוארת על ידי ווילקינסון. et al. 16 יכול להיות ההעברה של הרקמה זנב אל הצינור ה-PCR. בשל גודלו מיקרוסקופיים, קשה להבטיח הנוסח היה כראוי שנאספו על ידי pipetting. כדי לטפל מחסום זה, פיתחנו פרוטוקול משופרת עבור מספרים גדולים genotyping של הזחלים חיים דג זברה עם כמעט 100% יעילות9. שימוש של microscalpel, קצה הזנב סנפיר הוסר, להציב על גבי פיסת נייר סינון. פיסת נייר סינון המכיל את הרקמה יכול להיות בקלות דמיינו והניח כהלכה לתוך צינור ה-PCR. הפקת דנ א גנומי מתבצע לאחר מכן, ואחריו PCR הגברה של האזור בעל עניין עד גנוטיפ הדגימה. היתרונות של שיטה זו כוללים PCR יעילות גבוהה, קצב נמוך חיובי כוזב, התמותה נמוכה. בנוסף, genotyping מספר גדול של עוברי אפשרי באמצעות פרוטוקול זה. הפרוטוקול המתואר במסמך זה מאפשר סנפיר-מסיכה של מאות הזחלים בתוך 2-3 h באמצעות גישה זו ועל זיהוי נכון של דגים genotyped והתחדשות הזנב בתוך יומיים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscalpel</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Tissue-culture plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14230232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S25548A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% Chelex 100 sodium form</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed 1x</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell Model 192 system</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>1704508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>1610158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Green Master Mix, 2X</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paper wipes (Kimwipes&#174; disposable wipers)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z188956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1kb-plus molecylar weight marker&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM1343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system)</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>1704508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput dna extraction and genotyping of 3dpf zebrafish larvae by fin clipping

דג זברה (רזבורה rerio) בעלי orthologues 84% של הגנים הידועים להיות מזוהה עם מחלות אנושיות. בנוסף, בעלי חיים אלה יש זמן דור קצר, קל לטפל, להציג שיעור הרבייה גבוה, בעלות נמוכה, ואת נתונות בקלות שינויים גנטיים על-ידי microinjection של ה-DNA של העוברים. התפתחויות אחרונות ג'ין כלי עריכה מפעיל את הקדמה מדויק של מוטציות, transgenes של דג זברה. מחלת דוגמנות בשנת דג זברה לעיתים קרובות מוביל פנוטיפים זחל ומוות מוקדם, אשר עשויה להיות מאתגרת לפרש אם אחרים אינם ידועים. זה זיהוי מוקדם של אחרים הוא גם הצורך בניסויים הדורשים מדגם איגום, כגון גנים ביטוי או מסה ספקטרומטר מחקרים. עם זאת, ההקרנה נרחב genotypic מוגבל באמצעות שיטות מסורתיות, אשר במעבדות רוב מבוצעות רק על דג זברה למבוגרים או הזחלים לאחר המוות. אנחנו פתרנו בעיה זו על ידי התאמת שיטת הבידוד של DNA גנומי מוכן-PCR הזחלים חיים דג זברה ניתן להשיג מוקדם ככל 72 h שלאחר ההפריה (hpf). הזמן הזה, טכניקה חסכונית, השתפרו מפרוטוקול genotyping שפורסמו בעבר, מאפשר זיהוי אחרים מן מיקרוסקופיים פין. ביופסיות. הסנפירים במהירות להתחדש כאשר הזחלים מתפתחים. חוקרים יכולים ואז בחר ולגדל את אחרים הרצוי לבגרות על ידי ניצול זה תפוקה גבוהה הליך genotyping מבוססי ה-PCR.

היעילות של protocoll הודגם על ידי genotyping הצאצאים הצלב משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים (aldh7a1/ ot100, המוצג כאן כ aldh7a1+ /-) (איור 3A- C)9. אלל mutant aldh7a1ot100יש 5-(bp) הכניסה אקסון קידוד הראשון של הגן aldh7a1 דג זב?...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping at JoVE.com

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

מיצוי DNA תפוקה גבוהה, Genotyping של הזחלים דג זברה 3dpf על-ידי המסיכה פין

דג זברה שימשו מודל גנטי אמין האורגניזמים במחקר ביו-רפואי, במיוחד עם כניסתו של טכנולוגיות לעריכת ג'ין. כאשר הזחל פנוטיפים צפויים, זיהוי ה-DNA החילוץ, גנוטיפ יכול להיות מאתגר. כאן, אנו מתארים הליך genotyping יעיל עבור הזחלים דג זברה, מאת הזנב מסיכה, מוקדם ככל 72-h שלאחר ההפריה.

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

This method can help answer key questions in the biomedical field. Such as the use of zebrafish to generate genetic models of disease. The main advantage of this technique is that it allows early identification of genotypes using a simple high-throughput method.Though this method can enable extensive research using zebrafish models of genetic epilepsies, it can also be applied to other genetic disease models and any type of mutation study. Generally, individuals new to this method may have difficulties as the transection of the larval fin must be precisely performed within the pigment gap of the tail. Prior to starting the fin clipping of the zebrafish larvae, prepare the dissection surface.Tape a piece of autoclave tape across the interior surface of a nine centimeter Petri dish lid and position the lid under a stereo microscope. Prepare a P1000 pipette tip for accommodating a three dpf larva with minimal stress, by cutting off the end of the pipette tip to a diameter of two millimeters. Place three to five days post fertilization, or dpf, zebrafish larvae in a Petri dish and anesthetize in 1.5 millimolar tricaine in 1x E3 embryo medium.Using the modified P1000 micro pipette, pick up and anesthetize zebrafish larva and place it onto the positioned Autoclave tape on the Petri dish lid. Remove excess tricaine solution surrounding the larva. The area should be as dry as possible to successfully section and pick up the fin, but still wet to ensure survival.To avoid bleeding and ensure survival of the larva during fin clipping, the transection must occur within the pigment gap. Distal to the limit of the blood circulation, as indicated in this image. Working under a stereo microscope, use a micro scalpel to section the caudal fin.During the incision, apply a steady but gentle downward pressure to avoid damaging the notochord. Visualize the sectioned fin under the microscope, and position the piece on top of the tip of the micro scalpel blade. Place the micro scalpel containing the fin onto the surface of a small piece of filter paper.Due to the presence of melanocytes in the transected tissue, the fin appears as a small black spot. To ensure successful DNA extraction, it is important that a black dot marking the placement of the fin is observed on the filter paper before continuing with the protocol. Using scissors and tweezers, transfer the filter paper containing the fin to a well of a 96-well PCR plate containing 25 microliters of a 50 millimolar sodium hydroxide solution.Next, prepare a flat bottom 96-well tissue culture plate, numbering the wells according to the label of the PCR plate. Using the modified P1000 pipette, filled with 200 microliters of fresh e3 embryo medium, carefully collect the zebrafish larva using gentle pressure. Dispense the larva in the 96-well plate in the same well number as the PCR plate.Make sure the filter paper containing the fin is well submerged in the solution. To prevent cross contamination between each cut, clean the blade of the micro scalpel and the tweezers by dipping into a 70%ethanol solution. Wipe the blade with a clean paper tissue or wipe.When all larvae have been clipped, store the larvae in the 96-well plate at 28 degrees Celsius until their genotypes have been identified. Begin this procedure by sealing the 96-well PCR plate containing the fin pieces and centrifuging the samples at 1000 times G for one minute. To make sure all the filter papers are submerged in the sodium hydroxide solution.For tissue lysis, heat the samples in a thermal cycler at 95 degrees Celsius for five minutes. Followed by cooling to four degrees Celsius for 10 minutes. Next, add six microliters of 500 millimolar tris-HCL pH8.0 to each sample.Vortex the samples. Briefly centrifuge the plate at 1500 times G for five minutes at room temperature. To extract genomic DNA using this method, clip the fin as demonstrated earlier, but add the filter paper with the clipped fin to a well of a 96-well PCR plate containing 30 microliters of 5%chelating resin.After all fin pieces have been clipped, seal the 96-well PCR plate and briefly centrifuge the samples to make sure all filter papers are submerged with the chelating resin. Heat the samples in a thermal cycler at 95 degrees Celsius for 15 minutes, followed by cooling to four degrees Celsius for 10 minutes. Briefly centrifuge the samples to pellet the resin beads and obtain the DNA in the suspension.A multiplex PCR assay will enable the discrimination between homozygous mutants, heterozygotes, and wild type larvae. Set up the PCR reaction as detailed in the text protocol. Perform the PCR reactions in 96-well thermal cycler.Prepare a 1%agarose gel in sodium borate buffer, stained with 1x gel red. To facilitate the process, if possible, use a gel system that is compatible with multi channel pipettes to enable higher throughput capabilities by reducing the time to load samples. Run the gel in 1x sodium borate buffer at 250 volts for 15 minutes.Image the gel under ultraviolet light to allow discrimination of the different genotypes. Start this assay by preparing two 12%polyacrylamide gels using the 1.5 millimeter spacer plate and the 15 sample combs as described in the text protocol. Use a vertical electrophoresis system and 1x TBE buffer as the running buffer.After performing PCR as described in the text protocol, heat the PCR products at 94 degrees Celsius for five minutes, followed by cooling at four degrees Celsius for 10 minutes. Load 10 microliters per PCR sample, and eight microliters of molecular weight marker. Run the gel at 150 volts for one hour, or until the molecular weight marker almost reaches the foot line of the glass plate.Image the gel under ultraviolet light to allow discrimination of the different genotypes. This protocol was used to genotype of the offspring of a heterozygous cross, in which the mutant ileal has a 5 base pair insertion in the first coating exon of the aldh7a1 gene. The expected result from PCR amplification of both wild type and mutant ileals is a 434 BP amplicon.A 293 BP band arises from amplification of the mutant ileal, and a 195 BP band is obtained for the wild type ileal. Analysis of PCR reactions on a 1%agarose sodium borate gel identified wild type genotypes in lanes two and six, heterozygous genotypes in lanes three, four, and five, and a homozygous mutant genotype in lane one. Various mutations where genotyped by a heteroduplex melting assay.The plpbpot101 and plpbpot102 mutant ileals of the plpbp gene each let to a frame shift and early stop codon. After denaturation and annealing, the PCR fragments for heterozygous animals would contain heteroduplex and homoduplex DNA that are easily separated and visualized using polyacrylamide gel electrophoreses. Compound heterozygous mutant genotypes were identified in lanes two, four, and eight, heterozygous genotypes in lanes three, six, seven, nine, and ten, and a wild type genotype in lane five.Once mastered, fin clipping 96 larvae using this technique can be done in less than an hour, if performed properly. Following this procedure, other methods, like pooling of zebrafish larvae of the same genotype for tissue extraction, can be performed and ordered to answer additional questions, such as, biomarker investigation and disease models. After it's development, this technique paved the way for research in the field of models of metabolic epilepsy to explore disease path physiology in zebrafish.After watching this video, you should have a good understanding of how to properly genotype three day old zebrafish larvae by microdissection of a caudal fin.

Research

JoVE Journal

Genetics

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

שרשרת פולימראז משופר אורך קטע התגובה הגבלת Genotyping פולימורפיזם של נפוחיתיים רעילים ידי נוזלי כרומטוגרפיה / ספקטרומטריית מסה

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

קביעת הגנום כולו של תזמון שכפול יונק ידי מדידת תוכן DNA

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

בשומן האכלה ואת וזמינותו Triacylglyceride תפוקה גבוהה בדרוזופילה Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

דור של כרומטין יליד Immunoprecipitation רצף ספריות לניתוח צפיפות נוקלאוזום

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: תפוקה גבוהה המבוססת על רצף טכניקה לזיהוי מאוחר לבצע שיכפול אזורים בגנום

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

DNA חזקים בידוד ובנייה ספריית רצף תפוקה גבוהה עבור דגימות עשבייה

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

פרופיל תזמון שכפול ה-DNA באמצעות דג זברה כמערכת מודל In Vivo

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

זיהוי תפוקה גבוהה של שילובים תרופתיים סינרגטי בשיטת חפיפה2

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

התפוקה הגבוהה של DNA פלאגיסינג ומעבר באמצעות טכנולוגיית ננו-לחילוק אקוסטית

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...