Name: high-throughput dna extraction and genotyping of 3dpf zebrafish larvae by fin clipping
Uploaded: 2018-06-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping at JoVE.com

Gli autori vorrei ringraziare i rari modelli di malattia e meccanismo (RDMM) rete (finanziato da istituti canadesi di ricerca di salute (CIHR) e Genome Canada). CK è supportato da un premio di studio UROP (Università di Ottawa). DLJ è supportato da una borsa di studio di laurea Canada Vanier. IAP è supportato da un premio di postdoctoral fellowship istituti canadesi di ricerca di salute (CIHR). Gli autori ringraziano la genetica Society of America per la concessione dell'autorizzazione per pubblicare questo protocollo e utilizzare un adattamento della figura 5 supplementare da Pena, et al.

Le procedure che coinvolge soggetti animali sono stati approvati e sono conformi alle linee guida di cura degli animali fornite dal Consiglio canadese su Animal Care e Università di Ottawa comitati di cura degli animali.
1. preparazione
<ol><li>Preparare la superficie di dissezione registrando un coperchio di scatola di Petri di 9 cm con nastro autoclave in tutta la sua superficie interna. Posizionarlo sotto un microscopio stereo.</li>
	<li>Posizionare la post-fecondazione 3-5 giorni (dpf) larve di zebrafish in...

<ol>
	<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), (2013).</li><li>Stewart, A. M., Kalueff, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+better+and+more+valid+animal+models+of+brain+disorders.">Developing better and more valid animal models of brain disorders.</a> Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).</li><li>Grone, B. P., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+epilepsy+research:+legacies+and+new+directions.">Animal models in epilepsy research: legacies and new directions.</a> Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function.">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J Vis Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Doyon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+targeted+gene+disruption+in+zebrafish+using+designed+zinc-finger+nucleases.">Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases.</a> Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).</li><li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Genome+Editing+Using+High+Efficieny+TALENs.">In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li><li>Sander, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs.">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).</li><li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+a+CRISPR-Cas+system.">Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.</a> Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).</li><li>Pena, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyridoxine-Dependent+Epilepsy+in+Zebrafish+Caused+by+Aldh7a1+Deficiency.">Pyridoxine-Dependent Epilepsy in Zebrafish Caused by Aldh7a1 Deficiency.</a> Genetics. 207, 1501-1518 (2017).</li><li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+Scn1a+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment.">Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nat Commun. 4, 2410 (2013).</li><li>Godoy, R., Noble, S., Yoon, K., Anisman, H., Ekker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenetic+ablation+of+dopaminergic+neurons+leads+to+transient+locomotor+impairments+in+zebrafish+larvae.">Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae.</a> J Neurochem. 135, 249-260 (2015).</li><li>Scheldeman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobiology+of+Disease+mTOR-related+neuropathology+in+mutant+tsc2+zebra+fish+Phenotypic,+transcriptomic+and+pharmacological+analysis.">Neurobiology of Disease mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebra fish Phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis.</a> Neurobiol Dis. 108 (September), 225-237 (2017).</li><li>Zabinyakov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+first+knock-out+aldh7a1+zebrafish+model+for+pyridoxine-dependent+epilepsy+using+CRISPR-Cas9+technology.">Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology.</a> PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).</li><li>Grone, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epilepsy,+behavioral+abnormalities,+and+physiological+comorbidities+in+syntaxin-binding+protein+1+(STXBP1)+mutant+zebrafish.">Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish.</a> PLoS One. 11 (3), (2016).</li><li>Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+transgenic+zebrafish.">Rapid identification of transgenic zebrafish.</a> Trends Genet. 12 (1), 9-10 (1996).</li><li>Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-throughput+PCR-based+genotyping+of+larval+zebrafish+tail+biopsies.">A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies.</a> Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).</li><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+genotyping+method+for+genome-modified+animals+and+human+cells+generated+with+CRISPR/Cas9+system.">An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system.</a> Sci Rep. 4, 6420 (2014).</li><li>Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chelex+100+as+a+medium+for+simple+extraction+of+DNA+for+PCR-based+typing+from+forensic+material.">Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material.</a> Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).</li><li>Ewing, B., Green, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basecalling+of+automated+sequencer+traces+using+phred.+II.+Error+probabilities.">Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities.</a> Genome Res. 8, 175-185 (1998).</li></ol>

Gene strumenti di editing sono state impiegate per introdurre precisamente mutazioni e transgeni in zebrafish negli ultimi anni5,6,7,8. Durante la malattia di modellazione in zebrafish, primi fenotipi larvali o giovanili sono spesso osservati9,12,13,14. Il protocollo ...

Il danio zebrato (Danio rerio) è un organismo vertebrato ampiamente utilizzato come modello per le indagini di malattia anche per quanto riguarda il test preclinici di ipotesi terapeutiche1,2,3. Questi animali hanno un tempo di generazione breve, sono facili da gestire, visualizzare un alto tasso riproduttivo, basso costo e sono facilmente suscettibili di manipolazioni genetiche di microiniezione di DNA in embrioni4. Attraverso il crescente sviluppo del romanzo transgenico e gene editing tecnologie quali Zinc-Finger nucleasi (ZFN)5, TAL-come effettore nucleasi (TALENs)6,7e il cluster regolarmente intervallate breve Palindromo si ripete (CRISPR) / CRISPR-collegata 9 (Cas9) sistema8, zebrafish è pronta a migliorare sostanzialmente la comprensione delle diverse condizioni patologiche. Queste tecnologie sono state utilizzate per creare forature mirate in entrambi somatiche e cellule germinali in zebrafish, efficientemente nascimenti geneticamente modificati animali8. Esempi recenti nella letteratura includono lo sviluppo positivo di modelli genetici di epilessia e disturbi metabolici in zebrafish3,9,10,11,12 .
Con i progressi compiuti in zebrafish editing genomico, rapida e affidabile la genotipizzazione è diventato un innegabile punto dilimitazione. Identificazione delle specifiche mutazioni del DNA adiacente al luogo di destinazione prevista modifica del genoma è una fase essenziale del protocollo. Tradizionalmente, tecniche di genotipizzazione di ritaglio pinna sono di solito solo eseguita in zebrafish giovanile o adulta. Tuttavia, il tempo speso zebrafish sensibilizzazione all'età adulta (> 2 mesi) ritarda considerevolmente gli avanzamenti nella ricerca. In molti casi, l'età adulta non può essere realizzato a causa il Ko di geni essenziali (ad es., nella modellazione di malattia) o mutazioni con guadagno di funzione che conduce agli effetti nocivi fenotipici. Inoltre, diversi saggi richiedono la messa in comune delle larve, come estrazione RNA o metabolita e coinvolgono così l'identificazione preventiva dei genotipi, che può essere difficile quando sono disponibili solo post hoc, tecniche di genotipizzazione. Questi esempi di cui sopra evidenziano l'importanza delle tecniche di genotipizzazione larvale allo stesso tempo preciso e consentono il recupero completo e normale sviluppo delle larve. Genotipizzazione di zebrafish fase precoce non sembra attualmente essere ampiamente usato; Questo si riflette da recenti pubblicazioni dei modelli di malattia in cui larvali genotipi sono identificati tramite post mortem genotipizzazione anziché genotipizzazione prima dell'esecuzione dell'esperimento12,13,14. In questa carta, una strategia di clip pinna larvale è presentata con l'obiettivo di migliorare le procedure di genotipizzazione precedentemente stabilito.
In passato, strategie che impiegano la digestione della proteinasi K a genotipo live zebrafish larve hanno portato alla variabile della polimerasi reazione a catena (PCR) efficienza15. Anche se più recentemente pubblicato tecnica di biopsia della coda al microscopio fornito più promettenti risultati16, noi e altri gruppi non erano in grado di riprodurre l'alta efficienza e recupero di DNA segnalati dagli autori. Una grave battuta d'arresto del protocollo descritto da Wilkinson et al. 16 potrebbe essere il trasferimento del tessuto coda nella provetta PCR. Grazie alle sue dimensioni microscopiche, è difficile garantire che la pinna è stato correttamente raccolti e dispensata da pipettaggio. Per affrontare questa barriera, abbiamo sviluppato un protocollo migliore per grandi numeri di genotipizzazione di larve di zebrafish live con quasi il 100% di efficienza9. Utilizzando un microscalpel, la punta della coda pinna è rimosso e collocata su un pezzo di carta da filtro. Il pezzo di carta da filtro contenente il tessuto può essere visualizzato prontamente e correttamente inserito in un tubo PCR. Estrazione del DNA genomico viene quindi eseguita, seguita dall'amplificazione di PCR della regione di interesse al genotipo del campione. I vantaggi di questo metodo includono un alta efficienza PCR, un basso tasso di falsi positivi e un tasso di mortalità basso. Inoltre, la genotipizzazione di un gran numero di embrioni è possibile utilizzando questo protocollo. Il protocollo descritto nel presente documento consente pinna-ritaglio di centinaia di larve all'interno di 2-3 h utilizzando questo approccio e la corretta identificazione di pesce genotipizzati e rigenerazione di coda entro due giorni.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscalpel</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Tissue-culture plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14230232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S25548A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% Chelex 100 sodium form</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed 1x</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell Model 192 system</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>1704508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>1610158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Green Master Mix, 2X</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paper wipes (Kimwipes&#174; disposable wipers)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z188956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1kb-plus molecylar weight marker&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM1343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system)</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>1704508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput dna extraction and genotyping of 3dpf zebrafish larvae by fin clipping

Zebrafish (Danio rerio) possiedono ortologhi per l'84% dei geni conosciuti per essere associati con malattie umane. Inoltre, questi animali hanno un tempo di generazione breve, sono facili da gestire, visualizzare un alto tasso riproduttivo, basso costo e sono facilmente suscettibili di manipolazioni genetiche di microiniezione di DNA negli embrioni. Gli avanzamenti recenti nel gene strumenti di editing consentono precisa introduzione di mutazioni e transgeni in zebrafish. Malattia di modellazione in zebrafish spesso porta a fenotipi larvali e morte precoce, che può essere difficile da interpretare se genotipi sono sconosciuti. Questa identificazione precoce dei genotipi è anche necessario negli esperimenti che richiedono la messa in comune di campione, come studi di gene expression o massa spettrometria. Tuttavia, vasta selezione genotipica è limitata dai metodi tradizionali, che nella maggior parte dei laboratori vengono eseguite solo su zebrafish adulto o nelle larve post mortem. Abbiamo affrontato questo problema adattando un metodo per l'isolamento di DNA genomic di PCR-pronto da larve di zebrafish live che può essere raggiunta anche prima, come la post-fecondazione 72h (hpf). Questo tempo e tecnica economica, migliorato da un protocollo di genotipizzazione precedentemente pubblicati, permette l'identificazione di genotipi da biopsie di pinna al microscopio. Le pinne rigenerano rapidamente come si sviluppano le larve. I ricercatori sono quindi in grado di selezionare e raccogliere i genotipi desiderati all'età adulta utilizzando questa procedura basata sulla PCR genotyping di alto-rendimento.

L'efficienza del protocollo è stato dimostrato dalla genotipizzazione la prole di una croce eterozigoti (aldh7a1+ ot100, qui indicato come aldh7a1+ /-) (Figura 3A- C)9. L'allele del mutante aldh7a1ot100ha un inserimento 5-base pair (bp) nel primo esone codifica del gene aldh7a1 di zebrafish che conduce a frameshift e perdita di funzi...

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High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Estrazione del DNA high-throughput e genotipizzazione delle larve di Zebrafish 3dpf di pinna Clipping

Zebrafish sono stati usati come organismi modello genetico affidabile nella ricerca biomedica, soprattutto con l'avvento delle tecnologie di modifica del gene. Quando sono previsti fenotipi larvali, identificazione di estrazione ed il genotipo di DNA può essere impegnativo. Qui, descriviamo una procedura efficiente genotipizzazione per larve di zebrafish, coda di ritaglio, più presto 72 h post-fertilizzazione.

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

This method can help answer key questions in the biomedical field. Such as the use of zebrafish to generate genetic models of disease. The main advantage of this technique is that it allows early identification of genotypes using a simple high-throughput method.Though this method can enable extensive research using zebrafish models of genetic epilepsies, it can also be applied to other genetic disease models and any type of mutation study. Generally, individuals new to this method may have difficulties as the transection of the larval fin must be precisely performed within the pigment gap of the tail. Prior to starting the fin clipping of the zebrafish larvae, prepare the dissection surface.Tape a piece of autoclave tape across the interior surface of a nine centimeter Petri dish lid and position the lid under a stereo microscope. Prepare a P1000 pipette tip for accommodating a three dpf larva with minimal stress, by cutting off the end of the pipette tip to a diameter of two millimeters. Place three to five days post fertilization, or dpf, zebrafish larvae in a Petri dish and anesthetize in 1.5 millimolar tricaine in 1x E3 embryo medium.Using the modified P1000 micro pipette, pick up and anesthetize zebrafish larva and place it onto the positioned Autoclave tape on the Petri dish lid. Remove excess tricaine solution surrounding the larva. The area should be as dry as possible to successfully section and pick up the fin, but still wet to ensure survival.To avoid bleeding and ensure survival of the larva during fin clipping, the transection must occur within the pigment gap. Distal to the limit of the blood circulation, as indicated in this image. Working under a stereo microscope, use a micro scalpel to section the caudal fin.During the incision, apply a steady but gentle downward pressure to avoid damaging the notochord. Visualize the sectioned fin under the microscope, and position the piece on top of the tip of the micro scalpel blade. Place the micro scalpel containing the fin onto the surface of a small piece of filter paper.Due to the presence of melanocytes in the transected tissue, the fin appears as a small black spot. To ensure successful DNA extraction, it is important that a black dot marking the placement of the fin is observed on the filter paper before continuing with the protocol. Using scissors and tweezers, transfer the filter paper containing the fin to a well of a 96-well PCR plate containing 25 microliters of a 50 millimolar sodium hydroxide solution.Next, prepare a flat bottom 96-well tissue culture plate, numbering the wells according to the label of the PCR plate. Using the modified P1000 pipette, filled with 200 microliters of fresh e3 embryo medium, carefully collect the zebrafish larva using gentle pressure. Dispense the larva in the 96-well plate in the same well number as the PCR plate.Make sure the filter paper containing the fin is well submerged in the solution. To prevent cross contamination between each cut, clean the blade of the micro scalpel and the tweezers by dipping into a 70%ethanol solution. Wipe the blade with a clean paper tissue or wipe.When all larvae have been clipped, store the larvae in the 96-well plate at 28 degrees Celsius until their genotypes have been identified. Begin this procedure by sealing the 96-well PCR plate containing the fin pieces and centrifuging the samples at 1000 times G for one minute. To make sure all the filter papers are submerged in the sodium hydroxide solution.For tissue lysis, heat the samples in a thermal cycler at 95 degrees Celsius for five minutes. Followed by cooling to four degrees Celsius for 10 minutes. Next, add six microliters of 500 millimolar tris-HCL pH8.0 to each sample.Vortex the samples. Briefly centrifuge the plate at 1500 times G for five minutes at room temperature. To extract genomic DNA using this method, clip the fin as demonstrated earlier, but add the filter paper with the clipped fin to a well of a 96-well PCR plate containing 30 microliters of 5%chelating resin.After all fin pieces have been clipped, seal the 96-well PCR plate and briefly centrifuge the samples to make sure all filter papers are submerged with the chelating resin. Heat the samples in a thermal cycler at 95 degrees Celsius for 15 minutes, followed by cooling to four degrees Celsius for 10 minutes. Briefly centrifuge the samples to pellet the resin beads and obtain the DNA in the suspension.A multiplex PCR assay will enable the discrimination between homozygous mutants, heterozygotes, and wild type larvae. Set up the PCR reaction as detailed in the text protocol. Perform the PCR reactions in 96-well thermal cycler.Prepare a 1%agarose gel in sodium borate buffer, stained with 1x gel red. To facilitate the process, if possible, use a gel system that is compatible with multi channel pipettes to enable higher throughput capabilities by reducing the time to load samples. Run the gel in 1x sodium borate buffer at 250 volts for 15 minutes.Image the gel under ultraviolet light to allow discrimination of the different genotypes. Start this assay by preparing two 12%polyacrylamide gels using the 1.5 millimeter spacer plate and the 15 sample combs as described in the text protocol. Use a vertical electrophoresis system and 1x TBE buffer as the running buffer.After performing PCR as described in the text protocol, heat the PCR products at 94 degrees Celsius for five minutes, followed by cooling at four degrees Celsius for 10 minutes. Load 10 microliters per PCR sample, and eight microliters of molecular weight marker. Run the gel at 150 volts for one hour, or until the molecular weight marker almost reaches the foot line of the glass plate.Image the gel under ultraviolet light to allow discrimination of the different genotypes. This protocol was used to genotype of the offspring of a heterozygous cross, in which the mutant ileal has a 5 base pair insertion in the first coating exon of the aldh7a1 gene. The expected result from PCR amplification of both wild type and mutant ileals is a 434 BP amplicon.A 293 BP band arises from amplification of the mutant ileal, and a 195 BP band is obtained for the wild type ileal. Analysis of PCR reactions on a 1%agarose sodium borate gel identified wild type genotypes in lanes two and six, heterozygous genotypes in lanes three, four, and five, and a homozygous mutant genotype in lane one. Various mutations where genotyped by a heteroduplex melting assay.The plpbpot101 and plpbpot102 mutant ileals of the plpbp gene each let to a frame shift and early stop codon. After denaturation and annealing, the PCR fragments for heterozygous animals would contain heteroduplex and homoduplex DNA that are easily separated and visualized using polyacrylamide gel electrophoreses. Compound heterozygous mutant genotypes were identified in lanes two, four, and eight, heterozygous genotypes in lanes three, six, seven, nine, and ten, and a wild type genotype in lane five.Once mastered, fin clipping 96 larvae using this technique can be done in less than an hour, if performed properly. Following this procedure, other methods, like pooling of zebrafish larvae of the same genotype for tissue extraction, can be performed and ordered to answer additional questions, such as, biomarker investigation and disease models. After it's development, this technique paved the way for research in the field of models of metabolic epilepsy to explore disease path physiology in zebrafish.After watching this video, you should have a good understanding of how to properly genotype three day old zebrafish larvae by microdissection of a caudal fin.

Research

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Genetics

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Identificazione di High-throughput di combinazioni di farmaci sinergici con il metodo2 di sovrapposizione

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Plasmid di DNA ad alto throughput e trasfezione utilizzando la tecnologia di nanoedispensing acustico

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...