Name: high-throughput identification of gene regulatory sequences using next-generation sequencing of circular chromosome conformation capture (4c-seq)
Uploaded: 2018-10-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq at JoVE.com

وأيد هذا العمل نيامس (R01AR065523).

1-إنزيم تقييد التحديد
<ol><li>تحديد منطقة للفائدة (على سبيل المثال.، المروج الجينات، وتعدد الأشكال النوكليوتيدات واحدة (SNP)، ومحسن) والحصول على تسلسل الحمض النووي من مستودعات مثل المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (نكبي).</li>
	<li>تحديد إنزيمات تقييد المرشح (REs) لهضم إنزيم التقييد ال...

<ol>
	<li>Dunham, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Hoffman, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+annotation+of+chromatin+elements+from+ENCODE+data.">Integrative annotation of chromatin elements from ENCODE data.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), 827-841 (2013).</li><li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+Chromosome+Conformation.">Capturing Chromosome Conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li><li>Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long-range+interaction+landscape+of+gene+promoters.">The long-range interaction landscape of gene promoters.</a> Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+promoter-centered+chromatin+interactions+provide+a+topological+basis+for+transcription+regulation.">Extensive promoter-centered chromatin interactions provide a topological basis for transcription regulation.</a> Cell. 148 (1-2), 84-98 (2012).</li><li>Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+and+analysis+of+chromosome+architecture.">Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+chromosome+conformation+capture+(4C)+uncovers+extensive+networks+of+epigenetically+regulated+intra-+and+interchromosomal+interactions.">Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions.</a> Nature genetics. 38 (11), 1341-1347 (2006).</li><li>Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+long-range+chromatin+interactions+for+selected+genomic+sites+using+4C-seq+technology:+From+fixation+to+computation.">Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation.</a> Methods. 58 (3), 221-230 (2012).</li><li>Van De Werken, H. J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4C+technology:+Protocols+and+data+analysis.">4C technology: Protocols and data analysis.</a> Methods in Enzymology. 513, (2012).</li><li>Brouwer, R. W. W., van den Hout, M. C. G. N., van IJcken, W. F. J., Soler, E., Stadhouders, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+Interrogation+of+3D+Genome+Topology+Using+Chromosome+Conformation+Capture+Coupled+to+High-Throughput+Sequencing+(4C-Seq).">Unbiased Interrogation of 3D Genome Topology Using Chromosome Conformation Capture Coupled to High-Throughput Sequencing (4C-Seq).</a> Eukaryotic Transcriptional and Post-Transcriptional Gene Expression Regulation. , 199-220 (2017).</li><li>Matelot, M., Noordermeer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+High-Resolution+3D+Chromatin+Organization+Using+Circular+Chromosome+Conformation+Capture+(4C-seq).">Determination of High-Resolution 3D Chromatin Organization Using Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq).</a> Polycomb Group Proteins: Methods and Protocols. , 223-241 (2016).</li><li>Gheldof, N., Leleu, M., Noordermeer, D., Rougemont, J., Reymond, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Long-Range+Chromatin+Interactions+Using+the+Chromosome+Conformation+Capture+Sequencing+(4C-seq)+Method.">Detecting Long-Range Chromatin Interactions Using the Chromosome Conformation Capture Sequencing (4C-seq) Method.</a> Gene Regulatory Networks: Methods and Protocols. , 211-225 (2012).</li><li>G&#246;nd&#246;r, A., Rougier, C., Ohlsson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+circular+chromosome+conformation+capture+assay.">High-resolution circular chromosome conformation capture assay.</a> Nature. 3 (2), 303-313 (2008).</li><li>Hag&#232;ge, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+chromosome+conformation+capture+assays+(3C-qPCR).">Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR).</a> Nature. 2 (7), 1722-1733 (2007).</li><li>Anand, R. D., Sertil, O., Lowry, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+digestion+monitors+facilitate+plasmid+construction+and+PCR+cloning.">Restriction digestion monitors facilitate plasmid construction and PCR cloning.</a> BioTechniques. 36 (6), 982-985 (2004).</li><li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Galaxy+platform+for+accessible,+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses:+2016+update.">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic acids research. 44 (W1), W3-W10 (2016).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+long-read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Walter, C., Schuetzmann, D., Rosenbauer, F., Dugas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic4Cseq:+An+R/Bioconductor+package+for+analyzing+4C-seq+data.">Basic4Cseq: An R/Bioconductor package for analyzing 4C-seq data.</a> Bioinformatics. 30 (22), 3268-3269 (2014).</li><li>Raviram, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4C-ker:+A+Method+to+Reproducibly+Identify+Genome-Wide+Interactions+Captured+by+4C-Seq+Experiments.">4C-ker: A Method to Reproducibly Identify Genome-Wide Interactions Captured by 4C-Seq Experiments.</a> PLoS Computational Biology. 12 (3), (2016).</li><li>Klein, F. A., Pakozdi, T., Anders, S., Ghavi-helm, Y., Furlong, E. E. M., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FourCSeq:+analysis+of+4C+sequencing+data.">FourCSeq: analysis of 4C sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (19), 3085-3091 (2015).</li><li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fourSig+a+method+for+determining+chromosomal+interactions+in+4C-Seq+data.">fourSig a method for determining chromosomal interactions in 4C-Seq data.</a> Nucleic Acids Research. 42 (8), (2014).</li><li>McLean, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GREAT+improves+functional+interpretation+of+cis-regulatory+regions.">GREAT improves functional interpretation of cis-regulatory regions.</a> Nature Biotechnology. 28 (5), 495-501 (2010).</li><li>Stolzenburg, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+dynamics+of+11p13+suggest+a+role+for+EHF+in+modifying+CF+lung+disease+severity.">Regulatory dynamics of 11p13 suggest a role for EHF in modifying CF lung disease severity.</a> Nucleic Acids Research. 45 (15), 8773-8784 (2017).</li><li>Meddens, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+chromatin+interactions+at+disease+associated+loci+links+novel+candidate+genes+to+inflammatory+bowel+disease.">Systematic analysis of chromatin interactions at disease associated loci links novel candidate genes to inflammatory bowel disease.</a> Genome Biology. 17 (1), 1-15 (2016).</li><li>Yeung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+activity+rhythms+and+tissue-specific+chromatin+interactions+explain+circadian+gene+expression+across+organs.">Transcription factor activity rhythms and tissue-specific chromatin interactions explain circadian gene expression across organs.</a> Genome research. , 207787 (2017).</li></ol>

نتائج ج 4 لديها القدرة على الكشف عن التفاعلات الكروماتين يمكنه التعرف على العناصر التنظيمية لم تكن معروفة سابقا و/أو الجينات المستهدفة التي تعتبر مهمة في25،24،سياق البيولوجي محددة26. ومع ذلك، قد تحد من عقبات فنية البيانات المستقاة من هذه ال...

وقد تيسر تحديد العناصر التنظيمية للتعبير الجيني في المشروع موسوعة عناصر الحمض النووي (ترميز) شاملة المشروح نشاط وظيفي ل 80% من الجينوم البشري1،2. تحديد المواقع في فيفو النسخ عامل ملزم وفرط دناسي، وجينيه هيستون والحمض النووي مثلايشن التعديلات في أنواع الخلايا الفردية مهدت الطريق للتحليلات الوظيفية للمرشح التنظيمية العناصر للتعبير الجيني المستهدف. المسلحة مع هذه النتائج، أننا نواجه التحدي المتمثل في تحديد الترابط الوظيفي بين العناصر التنظيمية والجينات. على وجه التحديد، ما هي العلاقة بين جينات هدف معين ولها enhancer(s)؟ أسلوب الالتقاط (3 ج) المطابقة الكروماتين يتصدى مباشرة لهذا السؤال بتحديد التفاعلات الوظيفية، المادية، ومن المحتمل بين منطقة الاهتمام والمرشح التفاعل تسلسل من خلال أحداث تم التقاطها في الكروماتين الثابتة3 . كما ازداد فهمنا للتفاعلات الكروماتين، ولكن الواضح أن التحقيق المكاني المرشح المختارة غير كافية لتوفير فهم كامل للتفاعلات بين الجينات-محسن. على سبيل المثال، ترميز استخدمت الأسلوب نسخة كربونية (5 ج) القبض على تكيف الصبغية الفائق لدراسة جزء صغير من الجينوم البشري (1%، التجريبية مجموعة من 44 المكاني) وذكرت الترابط المعقد المكاني. الجينات والقدرة على مع التفاعلات التي تم تحديدها في المتوسط مختلف الشركاء المتفاعلة 2 – 4، كان كثير منها مئات كيلوبس بعيداً في الفضاء الخطي4. علاوة على ذلك، من لي، وآخرون. يستخدم "تحليل التفاعل الكروماتين" بالزوجي-نهاية "تسلسل العلامة" (شيا-PET) لتحليل التفاعلات مروج كل الجينوم وتبين أن 65% مواقع الربط الثاني رنا بوليميراز متورطون في التفاعلات الكروماتين. بعض هذه التفاعلات أدت إلى مجمعات كبيرة ومتعددة الجينات التي تمتد مئات كيلوبس المسافة الجينوم والتي تتضمن، في المتوسط، 8-9 الجينات كل5. معا، هذه النتائج تسلط الضوء على الحاجة إلى أساليب كل الجينوم غير منحازة لاستجواب التفاعلات الكروماتين. يتم استعراض بعض هذه الأساليب في شميت وآخرون. 6.
أساليب أكثر حداثة للدراسات التقاط تكيف الكروماتين يقترن بالجيل التالي التسلسل (مرحبا-ج وج 4-seq) تمكين اكتشاف تسلسل غير معروف التفاعل مع منطقة لفائدة6. على وجه التحديد، وضع التقاط تكيف كروموسوم التعميم مع الجيل التالي تسلسل (ج 4-seq) لتحديد مواضع التفاعل مع تسلسل اهتمامها طريقة غير متحيزة7 بتسلسل الحمض النووي من القبض على الكروماتين الدانية منطقة اهتمام في الفضاء ثلاثي الأبعاد. باختصار، هو ثابت الكروماتين للحفاظ على تفاعلاته DNA البروتين الأصلي، المشقوق مع إنزيم التقييد، ومتصلة في وقت لاحق تحت ظروف مخفف لالتقاط بيولوجيا ذات الصلة "التشابك" من التفاعل المكاني (الشكل 1). يتم عكس الروابط عبر إزالة البروتين، مما ترك الحمض النووي متاح للانقسام إضافية مع إنزيم التقييد ثانية. ربط نهائي ينشئ دوائر أصغر من التفاعل المكاني. كبسولة تفجير لتسلسل الفائدة ثم المستخدمة لإنشاء إحدى مكتبات تضخيم تسلسلات غير معروف من الشظايا سيركولاريزيد، تليها المصب تسلسل الجيل القادم.
البروتوكول المعروضة هنا، الذي يركز على إعداد عينة، يجعل من التعديلات الرئيسية اثنين إلى القائمة ج 4-seq أساليب8،9،10،،من1112. أولاً، فإنه يستخدم أسلوب المستندة إلى qPCR تجريبيا تحديد العدد الأمثل للتضخيم دورات لخطوات إعداد مكتبة ج 4-seq ومما يخفف احتمال التحيز PCR النابعة من التضخيم المفرط للمكتبات. ثانيا، يستخدم خطوة هضم قيود إضافية في محاولة للحد من توحيد تسلسل المعروفة "الطعم" الذي يعوق الدعوة قاعدة دقيقة بتسلسل الصك، ويعظم تسلسل فريدة من نوعها، غنية بالمعلومات ومن ثم، في كل عملية قراءة. بروتوكولات أخرى الالتفاف حول هذه المسألة عن طريق تجميع العديد من المكتبات seq ج 4-8 (12-15) مع تسلسل الطعم مختلفة و/أو تقييد مواقع، وحدة تخزين من التجارب التي قد لا تكون قابلة للتحقيق بمختبرات أخرى. تسمح التعديلات المعروضة هنا عدد قليل من التجارب، عينات، و/أو يعيد فهرسة وتجميع في ممر واحد.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HindIII</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CviQI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0639S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotide primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>To be designed by the reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-443-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AVSS1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, methanol free</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15172-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4059-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED2SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% SDS solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>05030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A16046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking heat block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M Tris-HCl</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-048-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mg/mL glycogen</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-46-000-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR cycler</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4453536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR plates</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4309849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AVSST-FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Magnesium chloride</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-033-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreotol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expand Long Template PCR System</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11681834001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROX</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>172-5858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End-It DNA End-Repair Kit</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>ER0720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LigaFast Rapid DNA Ligation System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M8221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0267S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraSieve Agarose</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB70054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput identification of gene regulatory sequences using next-generation sequencing of circular chromosome conformation capture (4c-seq)

تحديد العناصر التنظيمية لجين هدف معين يشكل تحديا تقنيا كبيرا نظراً للتغير في أحجام العناصر التنظيمية لجينات مستهدفة لتحديد المواقع والتأثير. وقد تم إحراز بعض التقدم مع bioinformatic التنبؤ بوجود والوظيفة لتعديلات جينية الدانية المقترنة بالتعبير الجيني تم تنشيطه باستخدام مواقع الربط عامل النسخ المصانة. الكروماتين تكيف التقاط الدراسات قد أحدثت ثورة في قدرتنا على اكتشاف اتصالات الكروماتين المادية بين متواليات وحتى داخل جينوم أكمله. التقاط تكيف الكروماتين دائرية مقترنة مع الجيل التالي تسلسل (ج 4-seq)، على وجه الخصوص، يهدف إلى اكتشاف التفاعلات المادية الكروماتين كل شيء ممكن لتسلسل معين من الفائدة (وجهة نظر)، مثل جين المستهدف أو هيئة تنظيمية محسن. ج 4-seq الاستراتيجيات الحالية مباشرة تسلسل من داخل وجهة نظر ولكن تتطلب العديد ووجهات النظر المتنوعة تكون متسلسلة في نفس الوقت لتجنب التحديات التقنية الموحدة قاعدة الدعوة (التصوير) مع منصات تسلسل الجيل القادم. قد لا يكون هذا الحجم من التجارب العملية للعديد من المختبرات. هنا، نحن تقرير نهج تعديل بروتوكول ج 4-seq الذي يشتمل على خلاصة إنزيم التقييد إضافي والخطوات التضخيم المستندة إلى قبكر التي تم تصميمها لتسهيل التقاط أكبر من ما يلي تسلسل المتنوعة والتقليل من احتمالات بكر التحيز، على التوالي. لدينا طريقة ج 4 المعدلة قابلة لمختبر البيولوجيا الجزيئية القياسية لتقييم بنية الكروماتين.

الكيراتينيه البشرية الأولية كانت معزولة من 2 – 3 فوريسكينس حديثي الولادة المهملة، والمجمعة، ومثقف في كسفم تكملة مع 30 ميكروغرام/مل البقري النخامية استخراج، 0.26 نانوغرام/مليلتر الماشوب البشري البشرة عامل النمو، وكلوريد الكالسيوم 0.09 مم (كاكل2 ) عند 37 درجة مئوية، 5% ثاني...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq at JoVE.com

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

تحديد التفاعلات الفيزيائية بين الجينات والعناصر التنظيمية الصعبة ولكن قد تيسرت بفضل أساليب التقاط تكيف كروموسوم. هذا التعديل على البروتوكول ج 4-seq يخفف التحيز PCR بالتقليل من التضخيم المفرط لقوالب بكر ويزيد من مابابيليتي لما يلي: عن طريق إدراج خطوة هضم إنزيم التقييد بإضافة.

تحديد تسلسل الجينات التنظيمية استخدام تسلسل الجيل المقبل من تكيف كروموسوم دائرية الفائق التقاط (ج 4-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التنظيم النسخي، مثل دور التفاعلات الكروماتين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر التقاطاً غير متحيز نسبياً للتفاعلات من أجل مكان الاهتمام. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في التفاعلات محسن المروج، فإنه يمكن أيضا أن تطبق لتحديد أنواع أخرى من التفاعلات الكروماتين.عموما، سوف الأفراد جديدة لهذه الطريقة النضال لأنه يأخذ عدة أيام للبروتوكول، وتصميم التمهيدي يتطلب التجربة والخطأ والتوجيه التمهيدي غير نمطية. للحفاظ على التفاعلات الكروماتين في الخلايا التي تختارها، عبر ربط لهم بإضافة 9.5 ملليلتر من 1٪ إلكتروني المجهر الصف الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني لكل 10 مليون خلية. احتضان الخلايا أثناء هزاز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.نقل أنابيب التفاعل إلى الجليد لإخماد الصليب ربط رد فعل وإضافة الجليد الباردة واحد جليسين الضرس إلى تركيز نهائي من 0.125 الضرس ومزيج من الانقلاب لطيف. بعد الطرد المركزي وغسل الخلايا وفقا لبروتوكول النص، إعادة تعليق بيليه في 125 ميكرولترات من EDTA 5 ملليمولار مع 0.5٪ SDS واحد مثبطات بروتياز X. احتضان تعليق الخلية على الجليد لمدة 10 دقائق.للتأكد من أن الخلية هو الانتهاء، مزيج ستة ميكرولترات من الخلايا مع ستة microliters من الأزرق trypan على شريحة المجهر وتغطية مع زلة الغطاء. عرض تحت المجهر لرؤية المناطق الداخلية من الخلايا الزرقاء، والخلايا غير مبيض أبيض. لأول تقييد الهضم إضافة 30 ميكرولترات من 10 X تقييد الإنزيم العازلة، و 27 ميكرولترات من 20٪ تريتون X-100 إلى تعليق الخلية وضبط الحجم الكلي إلى 300 ميكرولترات مع الماء.إزالة 15 ميكرولتر aliquot وتخزينها في أربع درجات مئوية كتحكم غير مهضّم. إلى ال ما تبقى ردّ فعل خليط يضيف 200 يوحّد من تقييد إنزيم واحدة. احتضان بين عشية وضحاها في درجة الحرارة المناسبة للأنزيم في كتلة التدفئة تهتز مع 900 اضطراب في الدقيقة الانفعالات.في اليوم التالي، إضافة 200 وحدة إضافية من الانزيم ومواصلة هذا الحضانة بين عشية وضحاها. إزالة 15 ميكرولتر aliquot وتخزينها في أربع درجات مئوية كما هضم السيطرة. لتحديد كفاءة الهضم إضافة 82.5 ميكرولترات من 10 ملليمولار تريس-HCl, 7.5 pH, إلى كل الضوابط غير مهضومة وهضم.إضافة 2.5 ميكرولترات من البروتينات K واحتضان لمدة ساعة واحدة في 65 درجة مئوية لعكس ربط عبر الفورمالديهايد. لعزل الحمض النووي المهضم، أضف 100 ميكرولترات من كلوروفورم الفينول إلى الأنبوب. مزيج من قبل العديد من التقلبات السريعة لإزالة التلوث البروتين المتبقية.جهاز طرد مركزي عند 16، 100 غ في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد الطرد المركزي، نقل المرحلة مائي إلى أنبوب جديد. إضافة خلات الصوديوم، الجليكوجين، والإيثانول 100٪ إلى الأنبوب ومزيج بلطف عن طريق عكس.احتضان في ناقص 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لتسريع الحمض النووي. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 16، 100 G في أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. إزالة ناظر، ثم إضافة 500 ميكرولترات من 70٪ الإيثانول لغسل بيليه الحمض النووي.جهاز طرد مركزي عند 16، 100 غ في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد إزالة الهواء الفائق يجف بيليه في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين لإزالة الإيثانول المتبقي. إعادة تعليق بيليه المجففة في 50 ميكرولترات النوى المياه الحرة والمضي قدما لتحديد كفاءة الهضم من قبل QPCR كما هو موضح في بروتوكول النص.للتحضير لللبلازيم، الحرارة وتنشيط إنزيم تقييد عن طريق احتضان الأنبوب لمدة 20 دقيقة في 65 درجة مئوية. ثم نقل محتويات الأنبوب إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر، وإضافة نوى كللاس ماء مجاني، 10 X عازلة للليغان، و T4 الحمض النووي ligase. تخلط بلطف عن طريق دوامة، واحتضان بين عشية وضحاها في 16 درجة مئوية والمضي قدما كما هو موضح في بروتوكول النص.لعكس ربط ربط إضافة 15 ميكرولترات من البروتينات K واحتضان بين عشية وضحاها في 65 درجة مئوية. في اليوم التالي إضافة 30 ميكرولترات من RNase A، واحتضان في 45 دقيقة في 37 درجة مئوية. للاستمرار في عزل الكروماتين، أضف سبعة ملليلترات من كلوروفورم الفينول واخلطها بعدة انقلابات سريعة.جهاز طرد مركزي الأنبوب في 3،300 G 's في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد الطرد المركزي، نقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد 50 ملليلتر، وإضافة نوىليس الماء الحر، وثلاثة خلات الصوديوم الضرس، الجليكوجين، والإيثانول 100٪. اخلطي المحتويات وحضني في درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.بعد الحضانة، الطرد المركزي الأنبوب في 3، 900 G في أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. إزالة عظمى، ثم غسل بيليه مع 10 ملليلتر من الجليد البارد 70٪ الإيثانول. جهاز طرد مركزي عند 3,300 جي في أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.إزالة المناط، وتجفيف لفترة وجيزة بيليه في درجة حرارة الغرفة. قم بحل البيليت في 150 ميكرولترات من 10 ملليمولار تريس-HCl درجة ح hH 7.5 في 37 درجة مئوية. تخزين في درجة حرارة سالبة 20 مئوية أو الاستمرار في الهضم تقييد الثاني، وربط، وتنقية الحمض النووي كما هو موضح في بروتوكول النص.بعد تنقية الحمض النووي، قم بإجراء QPCR باستخدام التمهيديات العكسية PCR وأصباغ الإنترنت و ROX لتحديد عدد دورات التضخيم لتضخيم PCR العكسي لتسلسلات التفاعل غير المعروفة كما هو موضح في النص. لإعداد الحمض النووي للتسلسل، تقليم قبالة تسلسل الطعم مع الهضم تقييد الثالث عن طريق هضم ميكروغرام واحد من المنتج النقي من PCR العكسي، فضلا عن رصد انزيم تقييد. تشغيل إنزيم تقييد هضم، أو RE رصد، على هلام agarose من تركيز مناسبة للشظايا المتوقعة.مرة واحدة تم تحديد كفاءة الهضم من قبل الكهربائي هلام، والاستمرار مع عكس تنقية المنتج PCR وإعداد مكتبة التسلسل، كما هو موضح في بروتوكول النص. هضم القيد الثالث مهم في هذا البروتوكول لتسلسل الجيل القادم من القبض على تأكيد الكروموسوم الدائري. هذا الهضم الديكورات قبالة تسلسل الطعم الذي يمكن أن يسهل تحديد معالم الجذب الكروماتين.Agarose جل electrophoresis من رصد RE هضم أشار الهضم كافية من المنتج PCR العكسي هضم بالتوازي. بعد الانتهاء من أربعة قراءات تسلسل C تم قطع وتعيينها إلى الجينوم مرجع بشري hg38، وذلك باستخدام حزمة برامج BWA. معظم القراءات محاذاة في مواقع تقييد الهندية الثالث أو مواقع CviQ1I المجاورة للمواقع HindiIII كما هو متوقع.من المهم أثناء محاولة هذا الإجراء التأكد من أن الخلايا لديك مُهضومة بما فيه الكفاية. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل هطول الامطار المناعية الكروماتين أو CHIP، من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل تحديد عوامل النسخ المشاركة في تفاعلات الكروماتين. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في حقل الكروماتين لاستكشاف الشبكات التنظيمية المادية.

Research

JoVE Journal

Genetics

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

الأمثل والتحليل المقارن لطرق التخصيب الحمض النووي النباتي أورغانيلار مناسبة للجيل القادم التسلسل

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

جيل من الكروماتين الأصلية إيمونوبريسيبيتيشن تسلسل المكتبات لتحليل كثافة نوكليوسومي

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

تحديد تركيبات المخدرات التآزر بواسطة الأسلوب2 تداخل الفائق

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

استهدفت تسلسل الجيل القادم وأنابيب المعلوماتية الحيوية لتقييم المحددات الوراثية للمرض الدستورية

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

التضخيم من القرب من كامل طول فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس للجيل التالي التسلسل

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

تحديد RNAs الدائري باستخدام تسلسل RNA

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing ChIP-seq

اكتشاف الأهداف التنظيمية CsgD في السالمونيلا biofilm باستخدام كروماتين ايمونوبريسيبيتيشن والتسلسل عاليه الانتاجيه (رقاقه-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

تحديد جهات اتصال محسن-المروج في الأجسام الجنينية من خلال التقاط تثبيت الكروموسومات الكمية (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter

استخدام تسلسل الجيل التالي لتحديد الطفرات المرتبطة بإصلاح كسر الخيط المزدوج الناجم عن CAS9 بالقرب من مروج CD4

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication ...

Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform

الاختبار الجيني قبل الزرع لمرض الصبغيات العدلية على منصة تسلسل الجيل التالي القائمة على أشباه الموصلات

Next-generation sequencing has gained increasing importance in the clinical application in the determination of genetic variants. In the pre-implantation ...