Name: high-throughput identification of gene regulatory sequences using next-generation sequencing of circular chromosome conformation capture (4c-seq)
Uploaded: 2018-10-05T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por NIAMS (R01AR065523).

1. selección de la enzima de la restricción
<ol><li>Identificar una región de interés (por ej., promotor del gene, polimorfismo de nucleótido único (SNP), potenciador) y obtener la secuencia del ADN de los repositorios como centro nacional para información biotecnológica (NCBI).</li>
	<li>Identificar las enzimas de restricción del candidato (REs) de la primera enzima de la restricción digestión (RE1) que no corte dentro de la secuencia de interés, que producir extremos pegajosos (termini de ADN con...

<ol>
	<li>Dunham, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Hoffman, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+annotation+of+chromatin+elements+from+ENCODE+data.">Integrative annotation of chromatin elements from ENCODE data.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), 827-841 (2013).</li><li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+Chromosome+Conformation.">Capturing Chromosome Conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li><li>Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long-range+interaction+landscape+of+gene+promoters.">The long-range interaction landscape of gene promoters.</a> Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+promoter-centered+chromatin+interactions+provide+a+topological+basis+for+transcription+regulation.">Extensive promoter-centered chromatin interactions provide a topological basis for transcription regulation.</a> Cell. 148 (1-2), 84-98 (2012).</li><li>Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+and+analysis+of+chromosome+architecture.">Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+chromosome+conformation+capture+(4C)+uncovers+extensive+networks+of+epigenetically+regulated+intra-+and+interchromosomal+interactions.">Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions.</a> Nature genetics. 38 (11), 1341-1347 (2006).</li><li>Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+long-range+chromatin+interactions+for+selected+genomic+sites+using+4C-seq+technology:+From+fixation+to+computation.">Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation.</a> Methods. 58 (3), 221-230 (2012).</li><li>Van De Werken, H. J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4C+technology:+Protocols+and+data+analysis.">4C technology: Protocols and data analysis.</a> Methods in Enzymology. 513, (2012).</li><li>Brouwer, R. W. W., van den Hout, M. C. G. N., van IJcken, W. F. J., Soler, E., Stadhouders, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+Interrogation+of+3D+Genome+Topology+Using+Chromosome+Conformation+Capture+Coupled+to+High-Throughput+Sequencing+(4C-Seq).">Unbiased Interrogation of 3D Genome Topology Using Chromosome Conformation Capture Coupled to High-Throughput Sequencing (4C-Seq).</a> Eukaryotic Transcriptional and Post-Transcriptional Gene Expression Regulation. , 199-220 (2017).</li><li>Matelot, M., Noordermeer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+High-Resolution+3D+Chromatin+Organization+Using+Circular+Chromosome+Conformation+Capture+(4C-seq).">Determination of High-Resolution 3D Chromatin Organization Using Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq).</a> Polycomb Group Proteins: Methods and Protocols. , 223-241 (2016).</li><li>Gheldof, N., Leleu, M., Noordermeer, D., Rougemont, J., Reymond, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Long-Range+Chromatin+Interactions+Using+the+Chromosome+Conformation+Capture+Sequencing+(4C-seq)+Method.">Detecting Long-Range Chromatin Interactions Using the Chromosome Conformation Capture Sequencing (4C-seq) Method.</a> Gene Regulatory Networks: Methods and Protocols. , 211-225 (2012).</li><li>G&#246;nd&#246;r, A., Rougier, C., Ohlsson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+circular+chromosome+conformation+capture+assay.">High-resolution circular chromosome conformation capture assay.</a> Nature. 3 (2), 303-313 (2008).</li><li>Hag&#232;ge, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+chromosome+conformation+capture+assays+(3C-qPCR).">Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR).</a> Nature. 2 (7), 1722-1733 (2007).</li><li>Anand, R. D., Sertil, O., Lowry, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+digestion+monitors+facilitate+plasmid+construction+and+PCR+cloning.">Restriction digestion monitors facilitate plasmid construction and PCR cloning.</a> BioTechniques. 36 (6), 982-985 (2004).</li><li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Galaxy+platform+for+accessible,+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses:+2016+update.">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic acids research. 44 (W1), W3-W10 (2016).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+long-read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Walter, C., Schuetzmann, D., Rosenbauer, F., Dugas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic4Cseq:+An+R/Bioconductor+package+for+analyzing+4C-seq+data.">Basic4Cseq: An R/Bioconductor package for analyzing 4C-seq data.</a> Bioinformatics. 30 (22), 3268-3269 (2014).</li><li>Raviram, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4C-ker:+A+Method+to+Reproducibly+Identify+Genome-Wide+Interactions+Captured+by+4C-Seq+Experiments.">4C-ker: A Method to Reproducibly Identify Genome-Wide Interactions Captured by 4C-Seq Experiments.</a> PLoS Computational Biology. 12 (3), (2016).</li><li>Klein, F. A., Pakozdi, T., Anders, S., Ghavi-helm, Y., Furlong, E. E. M., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FourCSeq:+analysis+of+4C+sequencing+data.">FourCSeq: analysis of 4C sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (19), 3085-3091 (2015).</li><li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fourSig+a+method+for+determining+chromosomal+interactions+in+4C-Seq+data.">fourSig a method for determining chromosomal interactions in 4C-Seq data.</a> Nucleic Acids Research. 42 (8), (2014).</li><li>McLean, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GREAT+improves+functional+interpretation+of+cis-regulatory+regions.">GREAT improves functional interpretation of cis-regulatory regions.</a> Nature Biotechnology. 28 (5), 495-501 (2010).</li><li>Stolzenburg, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+dynamics+of+11p13+suggest+a+role+for+EHF+in+modifying+CF+lung+disease+severity.">Regulatory dynamics of 11p13 suggest a role for EHF in modifying CF lung disease severity.</a> Nucleic Acids Research. 45 (15), 8773-8784 (2017).</li><li>Meddens, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+chromatin+interactions+at+disease+associated+loci+links+novel+candidate+genes+to+inflammatory+bowel+disease.">Systematic analysis of chromatin interactions at disease associated loci links novel candidate genes to inflammatory bowel disease.</a> Genome Biology. 17 (1), 1-15 (2016).</li><li>Yeung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+activity+rhythms+and+tissue-specific+chromatin+interactions+explain+circadian+gene+expression+across+organs.">Transcription factor activity rhythms and tissue-specific chromatin interactions explain circadian gene expression across organs.</a> Genome research. , 207787 (2017).</li></ol>

4C resultados tienen el potencial para revelar las interacciones de la cromatina que pueden identificar elementos reguladores desconocidos o genes de la blanco que son importantes en un contexto biológico específico24,25,26. Sin embargo, obstáculos técnicos pueden limitar los datos obtenidos de estos experimentos. Sesgo PCR de amplificación excesiva de la plantilla en C 4 protocolos es probable. Este protocolo soluciona est...

La identificación de elementos reguladores de expresión génica se ha facilitado por el proyecto de la enciclopedia de elementos de ADN (ENCODE) que comprensivo había anotado actividad funcional para el 80% del genoma humano1,2. La identificación de los sitios en vivo Unión de factor de transcripción, hipersensibilidad al DNaseI, y epigenético histona modificaciones de metilación del ADN en tipos de células individuales allanó el camino para el análisis funcional del candidato regulatorio elementos para la expresión del gen objetivo. Armado con estos resultados, nos enfrentamos con el desafío de determinar la interconexión funcional entre elementos reguladores y genes. Específicamente, ¿cuál es la relación entre un gen dada y su enhancer(s)? El método de captura (3C) de conformación de la cromatina aborda directamente esta cuestión por la identificación físicas y probablemente funcionales, las interacciones entre una región de interés y candidato interactuando secuencias a través de eventos capturados en cromatina fija3 . Como nuestra comprensión de las interacciones de la cromatina ha aumentado, sin embargo, es claro que la investigación de los lugares geométricos del candidato preseleccionado es insuficiente para proporcionar una comprensión completa de las interacciones del gene enhancer. Por ejemplo, codificar utiliza el método de copia (C 5) conformación cromosómica de alto rendimiento captura para examinar una pequeña parte del genoma humano (1%, piloto de 44 loci) y reportó la compleja interconexión de los loci. Genes y potenciadores con interacciones identificadas un promedio de 2 – 4 socios interactúan diferentes, muchos de los cuales fueron cientos de kilobases lejos en el espacio lineal4. Además, Li et al. utilizado el análisis de interacción de cromatina por Paired-End etiqueta secuenciación (ChIA-PET) para analizar las interacciones promotor de todo el genoma y encontró que 65% de los sitios de Unión II de ARN polimerasa estuvieron implicado en las interacciones de la cromatina. Algunas de estas interacciones dio como resultado grandes, genes múltiples complejos que abarcan cientos de kilobases de distancia genómica y que contiene, en promedio, 8-9 genes cada5. Juntos, estos resultados destacan la necesidad de métodos imparciales de todo el genoma para interrogar a las interacciones de la cromatina. Algunos de estos métodos se revisan en Schmitt et al. 6.
Métodos más recientes para los estudios de captura de conformación de la cromatina junto con generación de secuenciación (Hi-C y C 4-seq) permiten el descubrimiento de secuencias desconocidas interactuando con una región de interés6. Específicamente, captura de conformación circular cromosoma con secuenciación de próxima generación (4C-seq) fue desarrollado para identificar loci interactuando con una secuencia de interés en una manera imparcial7 mediante la secuenciación de ADN de cromatina capturada proximal a la región de interés en el espacio 3D. Brevemente, la cromatina se fija para preservar sus interacciones proteína-ADN nativo, troceados con una enzima de la restricción y posteriormente ligarse en condiciones diluidas captura biológicamente relevantes "enredos" de loci interactuantes (figura 1). Los enlaces cruzados se invierten para quitar la proteína, quedando así el ADN disponible para escote adicional con una segunda enzima de restricción. Una ligadura final genera círculos más pequeños de loci interactuando. Cartillas para la secuencia de interés entonces se utilizan para generar una biblioteca amplificada de secuencias desconocidas de los fragmentos circular, seguidos por la secuencia de generación siguiente aguas abajo.
El protocolo presentado aquí, que se centra en la preparación de la muestra, hace dos alteraciones principales existentes 4C-seq métodos8,9,10,11,12. En primer lugar, utiliza un método basado en qPCR empíricamente determinar el número óptimo de amplificación ciclos para pasos de preparación de biblioteca C 4-seq y así mitiga el potencial sesgo de PCR de amplificación excesiva de las bibliotecas. En segundo lugar, utiliza un paso de recopilación de restricción adicionales en un esfuerzo para reducir la uniformidad de secuencias conocidas de "cebo" que impide precisa base llamada por el instrumento de la secuencia y, por lo tanto, maximiza la secuencia informativa, única en cada lectura. Otros protocolos de eluden esta cuestión poniendo en muchas bibliotecas de (12-15)8 4 C-seq con cebo diferentes secuencias o sitios de restricción, un volumen de experimentos que no sean alcanzables por otros laboratorios. Las modificaciones aquí presentadas permiten un pequeño número de experimentos, las muestras o repeticiones para ser indexadas y agrupados en un solo carril.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HindIII</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CviQI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0639S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotide primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>To be designed by the reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-443-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AVSS1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, methanol free</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15172-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4059-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED2SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% SDS solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>05030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A16046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking heat block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M Tris-HCl</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-048-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mg/mL glycogen</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-46-000-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR cycler</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4453536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR plates</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4309849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AVSST-FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Magnesium chloride</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-033-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreotol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expand Long Template PCR System</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11681834001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROX</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>172-5858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End-It DNA End-Repair Kit</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>ER0720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LigaFast Rapid DNA Ligation System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M8221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0267S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraSieve Agarose</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB70054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput identification of gene regulatory sequences using next-generation sequencing of circular chromosome conformation capture (4c-seq)

La identificación de elementos reglamentarios para un gen determinado objetivo plantea un desafío técnico significativo debido a la variabilidad en los tamaños de efecto y colocación de elementos reguladores para un gene de la blanco. Algunos progresos con la predicción de Bioinformática de la existencia y función de las modificaciones epigenéticas proximal asociada a genes activados usando sitios de unión del factor de transcripción conservado. Estudios de captura de conformación de la cromatina han revolucionado nuestra capacidad de descubrir contactos físicos cromatina entre secuencias e incluso dentro de un genoma entero. Captura de la conformación de cromatina circular juntada con la secuenciación de próxima generación (4C-seq), en particular, está diseñada para descubrir todas las posibles interacciones de cromatina física para una secuencia dada de interés (mirador), como un gene de la blanco o un regulador potenciador. Las 4C-seq estrategias directamente de la secuencia en el punto de vista pero requieren numerosos y diversos puntos de vista para ser secuenciado simultáneamente para evitar los desafíos técnicos de uniforme basan llamando a (imagen) con plataformas de secuenciación de nueva generación. Este volumen de experimentos puede no ser práctico para muchos laboratorios. Aquí, Divulgamos un acercamiento modificado para el protocolo C 4-seq que incorpora una digestión de la enzima de restricción adicional y pasos de amplificación basada en qPCR que están diseñados para facilitar una mayor captura de lecturas de diversa secuencia y mitigar el potencial de Polimerización en cadena diagonal, respectivamente. Nuestro método modificado de 4C es favorable para el laboratorio de biología molecular estándar para evaluar la arquitectura de la cromatina.

Queratinocitos humanos primarios fueron aislados de prepucio neonatal descartada 2 – 3, agrupados y culta en KSFM complementado con 30 μg/mL pituitaria bovina extracto, 0,26 ng/mL recombinante humana factor de crecimiento epidérmico y 0,09 mM cloruro de calcio (CaCl2 ) a 37 ° C, 5% dióxido de carbono. Las células se dividieron en dos frascos, y un matraz fue distinguido por la adición de CaCl2 a una concentración final de 1,2 mM para 72 h. 107 las...

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High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

La identificación de interacciones físicas entre los genes y elementos reguladores es un reto, pero ha sido facilitada por los métodos de captura de conformación de cromosoma. Esta modificación al Protocolo de 4C-seq mitiga sesgo PCR minimizando la amplificación excesiva de plantillas de PCR y maximiza el mappability de Lee mediante la incorporación de un paso de síntesis de enzima de la restricción además.

Captura de alto rendimiento identificación de secuencias reguladoras de genes utilizando secuenciación de próxima generación de conformación Circular cromosoma (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Este método puede responder a preguntas clave en el campo de regulación transcripcional, como el papel de las interacciones de cromatina. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una captura relativamente imparcial de las interacciones para un lugar de interés. Aunque este método puede proporcionar información sobre las interacciones potenciadoras del promotor, también se puede aplicar para identificar otros tipos de interacciones de cromatina.Generalmente, los individuos nuevos en este método tendrán problemas porque toma varios días para el protocolo, y el diseño de imprimación requiere prueba y error y orientación de imprimación atípica. Para preservar las interacciones de cromatina en las células de elección, vincúlelas mediante la adición de 9,5 mililitros de formaldehído de grado de microscopía electrónica al 1%en PBS por cada 10 millones de células. Incubar las células mientras se balancea durante 10 minutos a temperatura ambiente.Transfiera los tubos de reacción al hielo para apagar la reacción de unión cruzada y añadir un hielo frío de una glicina molar a una concentración final de 0.125 molares y mezclar por inversión suave. Después de centrifugar y lavar las células de acuerdo con el protocolo de texto, vuelva a suspender el pellet en 125 microlitros de cinco EDTA milimotoras con 0.5%SDS y un X inhibidores de la proteasa. Incubar la suspensión celular sobre hielo durante 10 minutos.Para asegurarse de que la lese celular está completa, mezcle seis microlitros de las células con seis microlitros de color azul tripano en un portaobjetos y cúbralo con un resbalón de cubierta. Ver bajo un microscopio para ver el interior de las células de color azul, y las células no alicentes blancas. Para la primera digestión de restricción añadir 30 microlitros de 10 X tampón de enzima de restricción, y 27 microlitros de 20%Triton X-100 a la suspensión celular y ajustar el volumen total a 300 microlitros con agua.Retire una alícuota de 15 microlitios y guárdela a cuatro grados centígrados como control no digerido. A la mezcla de reacción restante añadir 200 unidades de enzima de restricción una. Incubar durante la noche a la temperatura adecuada para la enzima en un bloque de calentamiento de agitación con agitación de 900 RPM.Al día siguiente, añadir 200 unidades adicionales de la enzima y continuar esta incubación durante la noche. Retire una alícuota de 15 microlitrolidores y guárdelo a cuatro grados centígrados como control digerido. Para determinar la eficiencia de la digestión, añada 82,5 microlitros de 10 mililitros Tris-HCl, pH 7.5, a cada control no digerido y digerido.Añadir 2,5 microlitros de proteinasa K e incubar durante una hora a 65 grados Celsius para revertir la unión cruzada de formaldehído. Para aislar el ADN digerido, agregue 100 microlitros de cloroformo de fenol al tubo. Mezclar por varias inversiones rápidas para eliminar la contaminación residual de proteínas.Centrifugar a 16,100 G a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de la centrifugación, transfiera la fase acuosa a un tubo nuevo. Agregue acetato de sodio, glucógeno y 100% etanol al tubo y mezcle suavemente por inversión.Incubar a menos 80 grados centígrados durante una hora para precipitar el ADN. Centrifugar el tubo a 16, 100 G a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Retire el sobrenadante y luego agregue 500 microlitros de 70%etanol para lavar el pellet de ADN.Centrifugar a 16,100 G a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de retirar el aire sobrenadante, seque el pellet a temperatura ambiente durante dos minutos para eliminar el etanol residual. Re suspenda el pellet seco en 50 microlitros nucleasas el agua libre y proceda a determinar la eficiencia de la digestión por QPCR como se describe en el protocolo de texto.Para prepararse para la ligadura, caliente y active la enzima de restricción incubando el tubo durante 20 minutos a 65 grados centígrados. A continuación, transfiera el contenido del tubo a un tubo cónico de 50 mililitros, y agregue agua libre de nucleasa, 10 Tampón de ligasa X y ligasa de ADN T4. Mezclar suavemente arremolinando, e incubar durante la noche a 16 grados Centígrados y proceder como se describe en el protocolo de texto.Para la unión cruzada inversa añadir 15 microlitros de proteinasa K e incubar durante la noche a 65 grados Celsius. Al día siguiente agregue 30 microlitros de la RNase A, e incubar a 45 minutos a 37 grados centígrados. Para continuar con el aislamiento de cromatina, añadir siete mililitros de cloroformo de fenol y mezclar por varias inversiones rápidas.Centrifugar el tubo a 3.300 G a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de la centrifugación, transfiera la fase acuosa a un nuevo tubo de 50 mililitros, y agregue agua libre de nucleasa, tres molares de acetato de sodio, glucógeno y 100% etanol. Mezclar el contenido e incubar a 80 grados Celsius negativos durante una hora.Después de la incubación, centrifugar el tubo a 3.900 G a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Retire el sobrenadante y luego lave el pellet con 10 mililitros de hielo frío 70%etanol. Centrifugar a 3.300 G a cuatro grados centígrados durante 15 minutos.Retire el sobrenadante y seque brevemente el pellet a temperatura ambiente. Disolver el pellet en 150 microlitros de 10 mililitros de pH Tris-HCl 7,5 a 37 grados centígrados. Almacenar a 20 grados Celsius negativos o continuar con la segunda restricción de digestión, ligadura y purificación de ADN como se describe en el protocolo de texto.Después de la purificación del ADN, realice QPCR utilizando imprimaciones DE PCR inversas y tintes cibernéticos y ROX para determinar el número de ciclos de amplificación para la amplificación inversa de PCR de secuencias de interacción desconocidas como se describe en el texto. Para preparar el ADN para la secuenciación, recorte las secuencias de cebo con la tercera digestión de restricción digiriendo un microgramo de producto purificado de PCR inverso, así como monitor de enzimas de restricción. Ejecute la enzima de restricción digerida, o monitor RE, en un gel de agarosa de una concentración adecuada para los fragmentos esperados.Una vez que la eficiencia de la digestión ha sido determinada por la electroforesis de gel, continúe con la purificación inversa del producto PCR y la preparación de la biblioteca de secuenciación, como se describe en el protocolo de texto. La tercera restricción de la digestión es importante en este protocolo para la secuenciación de próxima generación de la captura de confirmación de cromosomas circulares. Esta digestión recorta las secuencias de cebo que pueden facilitar la identificación de atracciones de cromatina.La electroforesis de gel de agarosa del monitor RE digerido indicaba una digestión suficiente del producto de PCR inverso digerido en paralelo. Después de terminar, cuatro lecturas de secuenciación C fueron recortadas y asignadas al genoma de referencia humana hg38, utilizando el paquete de software BWA. La mayoría de las lecturas se alinean en los sitios de restricción HindiIII o CviQ1I sitios adyacentes a los sitios HindiIII como se esperaba.Al intentar este procedimiento es importante asegurarse de que las células estén a dos de la manera suficiente y que la cromatina esté suficientemente digerida. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmuno precipitación de cromatina o CHIP, con el fin de responder a preguntas adicionales como la identificación de factores de transcripción implicados en las interacciones de cromatina. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la cromatina exploraran las redes reguladoras físicas.

Research

JoVE Journal

Genetics

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Optimización y Análisis Comparativo de Métodos de Enriquecimiento de ADN de Organelos Vegetales Adecuados para Secuenciación de Próxima Generación

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Investigación

Genética

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generación de inmunoprecipitación de la cromatina nativa secuenciación bibliotecas para el análisis de densidad de nucleosoma

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Alto rendimiento identificación de combinaciones de fármacos sinérgicos por el método de superposición2

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Dirigida tubería de Bioinformática y secuenciación de próxima generación para evaluar determinantes genéticos de la enfermedad constitucional

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Amplificación de cerca integrales provirus VIH-1 para secuenciación de próxima generación

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Identificación de ARN circulares mediante secuenciación de ARN

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing ChIP-seq

Descubrimiento de objetivos reguladores de CsgD en biofilm de Salmonella utilizando inmunoprecipitación de cromatina y secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Identificación de contactos potenciadores-promotores en cuerpos embrionarios por captura cuantitativa de conformación cromosómica (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter

Uso de la secuenciación de próxima generación para identificar mutaciones asociadas con la reparación de una rotura de doble cadena inducida por CAS9 cerca del promotor CD4

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication ...

Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform

Pruebas genéticas preimplantacionales para aneuploidías en una plataforma de secuenciación de próxima generación basada en semiconductores

Next-generation sequencing has gained increasing importance in the clinical application in the determination of genetic variants. In the pre-implantation ...