Name: toluidine blue staining of resin-embedded sections for evaluation of peripheral nerve morphology
Uploaded: 2018-07-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology at JoVE.com

الكتاب أود أن ثانكثي "جنكينز مرفق الفحص المجهري" في جامعة وايومنغ لمساعدتهم، وأعضاء المختبر البوشمان، روبالو كيلي وصحيح هايدن، أوسيمانجيانج وبو وسوباش دونغانا، للمساعدة في رعاية الحيوان. هذا المنشور تسنى "جائزة التنمية المؤسسية" (فكرة) من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة "معاهد الصحة الوطنية في" إطار منحة # 2P20GM103432.

واستخدمت الفئران "سبراغ داولي" الكبار في هذا المشروع ووافق جميع الإجراءات بجامعة وايومنغ مؤسسات الرعاية الحيوانية واستخدام اللجنة.
1-الجراحة وفي تثبيت العصب فيفو
ملاحظة: يتم سرد معلومات المورد لجميع المواد والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول في ال?...

<ol>
	<li>Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarities+between+angiogenesis+and+neural+development:+What+small+animal+models+can+tell+us.">Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us.</a> Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).</li><li>Grinsell, D., Keating, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+reconstruction+after+injury:+A+review+of+clinical+and+experimental+therapies.">Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies.</a> BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).</li><li>Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+fillers+in+nerve+conduits+for+peripheral+nerve+repair.">Luminal fillers in nerve conduits for peripheral nerve repair.</a> Annals of Plastic Surgery. 57 (4), 462-471 (2006).</li><li>Scipio, F., Raimondo, S., Tos, P., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+protocol+for+paraffin-embedded+myelin+sheath+staining+with+osmium+tetroxide+for+light+microscope+observation.">A simple protocol for paraffin-embedded myelin sheath staining with osmium tetroxide for light microscope observation.</a> Microscopy Research and Technique. 71, 497-502 (2008).</li><li>Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5:+Methods+and+protocols+in+peripheral+nerve+regeneration+experimental+research:+part+II-morphological+techniques.">Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques.</a> International Review of Neurobioly. 87, 81-103 (2009).</li><li>Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Campos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+myelin+sheath+and+collagen+reorganization+pattern+in+a+model+of+peripheral+nerve+regeneration+using+an+integrated+histochemical+approach.">Evaluation of myelin sheath and collagen reorganization pattern in a model of peripheral nerve regeneration using an integrated histochemical approach.</a> Histochemistry and Cell Biology. , 709-717 (2011).</li><li>Sridharan, G., Shankar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toluidine+blue:+A+review+of+its+chemistry+and+clinical+utility.">Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16, 251-255 (2012).</li><li>Epstein, J. B., Scully, C., Spinelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toluidine+blue+and+Lugol's+iodine+application+in+the+assessment+of+oral+malignant+disease+and+lesions+at+risk+of+malignancy.">Toluidine blue and Lugol's iodine application in the assessment of oral malignant disease and lesions at risk of malignancy.</a> Journal of Oral Pathology &amp; Medicine. 21, 160-163 (1992).</li><li>Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+assessment+in+peripheral+nerve+tissue+engineering.">Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering.</a> Neural Regeneration Research. 9, 1657-1660 (2014).</li><li>Dykstra, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A manual of applied techniques for biological electron microscopy. , 257 (1993).</li><li>Vleggeert-Lankamp, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+evaluation+methods+in+the+assessment+of+peripheral+nerve+regeneration+through+synthetic+conduits:+A+systematic+review.">The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: A systematic review.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).</li><li>Williams, P., Wendell-Smith, C. P., Finch, A., Stevens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+uses+and+methods+of+processing+of+fresh+frozen+sections+of+peripheral+nerve.">Further uses and methods of processing of fresh frozen sections of peripheral nerve.</a> Journal of Cell Science. 3 (69), 99-105 (1964).</li><li>Castro, J., Negredo, P., Avenda&#241;o, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+composition+of+the+rat+sciatic+nerve+and+its+modification+during+regeneration+through+a+sieve+electrode.">Fiber composition of the rat sciatic nerve and its modification during regeneration through a sieve electrode.</a> Brain research. , 65-77 (2008).</li><li>Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+protocols+in+peripheral+nerve+regeneration+experimental+research:+Part+II-morphological+techniques.">Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: Part II-morphological techniques.</a> International review of neurobiology. 87, 81-103 (2009).</li><li>Bozkurt, A., Lassner, F., O'Dey, D., Deumens, R., B&#246;cker, A., Schwendt, T., Janzen, C., Suschek, C. V., Tolba, R., Kobayashi, E., Sellhaus, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microstructured+and+interconnected+pore+channels+in+a+collagen-based+nerve+guide+on+axonal+regeneration+in+peripheral+nerves.">The role of microstructured and interconnected pore channels in a collagen-based nerve guide on axonal regeneration in peripheral nerves.</a> Biomaterials. 33 (5), 1363-1375 (2012).</li><li>Weis, J., Brandner, S., Lammens, M., Sommer, C., Vallat, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+nerve+biopsies:+A+practical+guide+for+neuropathologists.">Processing of nerve biopsies: A practical guide for neuropathologists.</a> Clinical Neuropathology. 31 (1), 7-23 (2012).</li><li>Battiston, B., Tos, P., Geuna, S., Giacobini-Robecchi, M. G., Guglielmone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+repair+by+means+of+vein+filled+with+muscle+grafts.+II.+Morphological+analysis+of+regeneration.">Nerve repair by means of vein filled with muscle grafts. II. Morphological analysis of regeneration.</a> Microsurgery. 20 (1), 37-41 (2000).</li><li>Bhattacharyya, T. K., Thomas, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+staining+methods+for+resin-embedded+peripheral+nerve.">Comparison of staining methods for resin-embedded peripheral nerve.</a> Journal of Histotechnology. 27, 161-164 (2004).</li><li>Zbaeren, J., Zbaeren-Colbourn, D., Haeberli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+immunohistochemistry+on+improved+glycol+methacrylate-resin+sections.">High-resolution immunohistochemistry on improved glycol methacrylate-resin sections.</a> Journal of Histotechnology. 30 (1), 27-33 (2007).</li><li>Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+stains:+A+literature+review+and+case+study.">Histological stains: A literature review and case study.</a> Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2016).</li><li>Ezra, M., Bushman, J., Shreiber, D., Schachner, M., Kohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+and+nonporous+nerve+conduits:+the+effects+of+a+hydrogel+luminal+filler+with+and+without+a+neurite-promoting+moiety.">Porous and nonporous nerve conduits: the effects of a hydrogel luminal filler with and without a neurite-promoting moiety.</a> Tissue Engineering Part A. (9-10), 818-826 (2016).</li><li>Bhatnagar, D., Bushman, J. S., Murthy, N. S., Merolli, A., Kaplan, H. M., Kohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+glue+as+a+stabilization+strategy+in+peripheral+nerve+repair+when+using+porous+nerve+guidance+conduits.">Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28 (5), 79 (2017).</li></ol>

امتحانات هياكل المورفولوجية لإصابة الأعصاب المحيطية والتجديد مواضيع متكررة من دراسة13. في هذا البروتوكول، يصف لنا الخطوات للحصول على صور ذات جودة عالية للبيانات النسيجي كوانتيفيكيشنز استخدام أنسجة العصب الوركي الفئران جزءا لا يتجزأ من كتل الراتنج والملون باللون الأزرق تول?...

الأعصاب المحيطية تمتد في جميع أنحاء الجسم، إينيرفاتينج الأنسجة المستهدفة مع محاور عصبية الحركية أو الحسية1. العيوب الأعصاب المحيطية الناجمة عن الاضطرابات الطبية والصدمة تمثل شاغلا رئيسيا لصحة العامة والآثار الاقتصادية الكبيرة2،3. وعلى الرغم من التقدم الذي تحقق في تقييم نتائج إصابات الأعصاب المحيطية وفهم العصب التجدد، الأساليب التقليدية مثل الأنسجة العصبية وتلطيخ تقنيات أداتين أساسيتين كمياً ونوعيا تقييم صحة العصب كقياس نتائج المحطة طرفية في نماذج حيوانية أو قصت الأنسجة البشرية. هذا هو غالباً ما يقترن القياسات الكهربية لوظيفة الأعصاب الطرفية، حيث يمكن أن تكشف عن مورفوميتري لماذا تجدد الأعصاب وظيفية أو لم يحدث.
أزرق تولويدين تلطيخ راتنج المضمنة أقسام شبه رقيقة الأعصاب الطرفية هو أسلوب متخصصة للتصوير myelinated الألياف العصبية، توفير جودة عالية وواضحة صور مفصلة للعصب هياكل4،5،6 . أزرق تولويدين وصمة عار ميتاتشروماتيك acidophilic، اكتشف ويليام هنري بيركن في7من 1856، وقد تم استخدامه في العديد من التطبيقات الطبية8. تولويدين الأعصاب الطرفية ملطخة باللون الأزرق المقاطع التي تم الحصول عليها من شرائح جزءا لا يتجزأ من الراتنج العصب يسمح لتصور واضح لهياكل العصب. ويمكن تعزيز التصور هيكل غمد المايلين باستخدام أكسيد الاوزميوم بعد انتهاء التثبيت4،9. أكسيد الازميوم هو سامة الأكسدة والدهون مثبت عامل يتفاعل مع سندات مزدوجة في الدهون، أسفر عن10من اﻷغماد المايلين الغنية بالدهون محددة بشكل صارخ. بيد أكسيد الاوزميوم السامة، ومكلفة وتتطلب من حضانة أطول من شرائح العصب، ولا يستخدم دائماً.
وقد وضعت أساليب بديلة لمعالجة وتلطيخ للتصور مورفولوجيا الأعصاب المحيطية؛ البارافين وتمزيقها المبردة، وتقطيع العصب جزءا لا يتجزأ من راتنج الإيبوكسي تليها تلطيخ مع أزرق تولويدين أو حل فينيلينيدياميني قد استخدمت لقياس التغيرات المورفولوجية للأعصاب المحيطية التجديد 11،12 . كل هذه الأساليب لديها مزايا والغلة البيانات الأساسية في العدد من محاور عصبية وسمك المايلين وقطر إكسون وقطر إكسون للألياف ميليناتيد القطر (ز-نسبة) 11،،من1314،15 .
الفرق الأساسي من الراتنج التضمين في هذا البروتوكول أنه يسهل الحصول على 1-2 ميكرومتر سمك المقاطع العرضية بسبب صلابة الراتنج مع الحفاظ على الصفات النسيجي للعصب. توفر هذه المقاطع رقيقة، بدلاً من 4-5 ميكرومترات سمك المقاطع التي تم الحصول عليها من البارافين التضمين، أقسام الأعصاب الطرفية مع دقة أعلى، مما يسمح لتحديد كمي myelination إكسون، مثل نسبة ز، التي لا يمكن أن تكون أكثر دقة التي تم الحصول عليها من أثخن الأبواب16. بينما تمزيقها المبردة التي يمكن استخدامها للحصول على الأجزاء 1-2 ميكرومتر، فقد خبرتنا أن من الأصعب الحصول على المقاطع دون تصدعات كبيرة عديدة. يمكن أن يسبب مثل هذه المقاطع متصدع عد غير دقيق لعدد محاور عصبية وجوانب مييلينيشن.
بالإضافة إلى أزرق تولويدين تلطيخ17، يمكن أيضا استخدام فضية تلطيخ الأسلوب18 و Masson's trichrome المصبوغة4 لإظهار العصب محاور عصبية. ومع ذلك، استخدام الراتنج تضمين المقاطع العصب الوسيط الفئران الملون مع أما الهيماتوكسيلين ويوزين أو ماسون في اﻷغماد المايلين خافت أظهرت trichrome وهياكل غير المعترف بها، بينما تلطيخ تولويدين الأزرق وأظهرت صورة واضحة المايلين غمد ويمكن بسهولة تكون الكمية4. وعلى الرغم من بعض القيود، الأعصاب تولويدين الأزرق تلطيخ راتنج المضمنة الطرفية هو تقنية قيمة يمكن استخدامها عندما تكون الصور عالية الدقة للعصب مورفولوجيا مطلوباً.
العيب الرئيسي لتضمين الراتنج هو أنها تستغرق وقتاً طويلاً ولا تسمح إيمونوستينينج النسيج نفسه نظراً لصعوبة استرجاع مستضد بالمقارنة مع البارافين وتقنيات الأقسام المضمنة المجمدة. وهكذا، من غير الممكن عموما الاستفادة من الأنسجة نفسها إيمونوستينينج التي يتم معالجتها عن طريق تضمين الراتنج لتلطيخ تولويدين الأزرق. على الرغم من عدم المستخدمة هنا، إذا كان المطلوب هو إيمونوهيستوتشيميستري في الراتنج يسمح المضمنة أقسام، استخدام ميثاكريلات غليكول التضمين راتنجات immunohistochemistry المراد تنفيذها على أقسام الأنسجة، إلا أنها باهظة الثمن نسبيا19. هذا يمكن التخفيف إلى حد ما بقطع الأعصاب الطرفية إلى أجزاء منفصلة، وبعض لتضمين الراتنج وآخرون ل immunostaining مباشرة بعد التثبيت.
عملية تولويدين الأزرق تلطيخ راتنج مضمن الأعصاب المحيطية، كما مع تحليل آخر نسيجية، يمكن تقسيم إلى خمس مراحل، بما في ذلك التثبيت، الجفاف، والتضمين، وتمزيقها، وتلطيخ20. ونحن نهدف هنا إلى توفير بروتوكول ومبادئ توجيهية عملية لاستخدام الراتنج الملون فروع العصب الوركي الفئران المضمنة مع تولويدين الأزرق للحصول على صور ذات جودة عالية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1092">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline</td>
			<td style="width:216px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">14200-075</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Glutaraldehyde Solution</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G6257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Toluidine Blue O</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Sodium Tetraborate Decahydrate</td>
			<td style="width:216px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:137px;">205950010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:216px;">Piramal</td>
			<td style="width:137px;">NDC 66794-013-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Epoxy Embedding Medium Kit</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">45359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Sodium Hydroxide Solution</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">72068</td>
			<td>To adjust Trump&#39;s fixative pH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Acetone</td>
			<td style="width:216px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:137px;">170942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Osmium Tetroxide Solution</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">75632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">VWR Micro Slides, Superfrost Plus</td>
			<td style="width:216px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Microscope Cover Glass</td>
			<td style="width:216px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12545102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Pelco Embedding Cast</td>
			<td style="width:216px;">Fisher Scientific</td>
			<td>NC9671811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Glass Knife Maker</td>
			<td style="width:216px;">RMC Products</td>
			<td style="width:137px;">GKM-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Ultramicrotome</td>
			<td style="width:216px;">RMC Products</td>
			<td style="width:137px;">MT-XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">15 mL Conical Tube</td>
			<td style="width:216px;">Falcon</td>
			<td>ISO 9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">4 mL Glass Vial</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>854190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:355px;">Razor Blades</td>
			<td style="width:216px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">55411-050</td>
			<td>For trimming resin block</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:355px;">Perfect Loop</td>
			<td style="width:216px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:137px;">70944</td>
			<td>For picking up thin resin sections</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm</td>
			<td style="width:216px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:137px;">71012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">100 Watt Oven</td>
			<td style="width:216px;">Millipore&#160;</td>
			<td style="width:137px;">6350115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Whatman Filter Paper</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">3 mL plastic pipette</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">Z331740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Micro-surgical Kit</td>
			<td style="width:216px;">World precision instruments</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Olympus fluorescence microscope</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toluidine blue staining of resin-embedded sections for evaluation of peripheral nerve morphology

الأعصاب المحيطية تمتد في جميع أنحاء الجسم، إينيرفاتينج الأنسجة المستهدفة مع محاور عصبية الحركية أو الحسية. نظراً للتوزيع على نطاق واسع، وكثيراً ما تلف الأعصاب الطرفية بسبب الصدمة أو المرض. كما وضعت أساليب واستراتيجيات لتقييم إصابات الأعصاب المحيطية في نماذج حيوانية، الدالة والتجدد، تحليل مورفوميتري للأعصاب الطرفية أصبح قياس نتائج محطة أساسية. تولويدين الأزرق تلطيخ العصب عبر المقاطع التي تم الحصول عليها من فروع العصب راتنج مضمن أسلوب استنساخه لعمليات التقييم النوعي والكمي للأعصاب المحيطية، وتمكين التصور مورفولوجيا عدد محاور عصبية ودرجة مييلينيشن. هذا الأسلوب، كما هو الحال مع العديد من أساليب نسيجية أخرى، يكون من الصعب تعلم وإتقان استخدام البروتوكولات المكتوبة القياسية. والغرض من هذا المنشور ذلك لإبراز البروتوكولات المكتوبة تولويدين الأزرق تلطيخ للأعصاب الطرفية مع بالفيديو للأسلوب، استخدام الأعصاب الوركي حصادها من الفئران. في هذا البروتوكول، يصف لنا في فيفو التثبيت بالاعصاب الطرفية ومجموعة من الأنسجة، وبعد انتهاء التثبيت مع 2% أكسيد الاوزميوم، تضمين للأعصاب في راتنج الإيبوكسي، وتقطيع أولتراميكروتومي للأعصاب بسمك 1-2μm. أقسام الأعصاب ثم نقلها إلى شريحة زجاجية والملون بالأزرق تولويدين، بعدها يتم كمياً ونوعيا قيموا. وترد أمثلة للمشاكل الأكثر شيوعاً، فضلا عن الخطوات اللازمة للتخفيف من هذه المسائل.

راتنج مضمن الأعصاب الطرفية المقاطع ملطخة تولويدين الأزرق تسمح لبيانات نسيجية دقيقة كوانتيفيكيشنز. لمحة عامة عن الإجراء الذي يظهر في (الشكل 2). أقسام الأعصاب الوركي جزءا لا يتجزأ من الراتنج المتوسطة وملطخة بالصور أزرق تولويدين أظهرت واضح مع الدقة المثلى (<...

Watch this Scientific Journal Video about Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology at JoVE.com

Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

نقدم هنا بروتوكولا لتصور الهياكل الدقيقة للأعصاب المحيطية بالحصول على وتلوين الأجزاء 1-2 ميكرومتر مع تولويدين الأزرق

أزرق تولويدين تلطيخ أبواب جزءا لا يتجزأ من الراتنج للتقييم مورفولوجيا الأعصاب الطرفية

Peripheral nerves extend throughout the body, innervating target tissues with motor or sensory axons. Due to widespread distribution, peripheral nerves ...

This method could help answer key questions in the fields of peripheral nerve injury and regeneration such as what is the morphometry of a peripheral nerve, how many axons are present, what is the state of myelination, and is there fibrotic tissue present? The main advantage of this technique is that it allows for high-resolution visualization of nerve features. Begin by placing an anesthetized rat in the prone position on the top of a dissection mat.Place a nose cone to maintain anesthesia with 1-2%isoflurane. To ensure adequate depth of anesthesia test the animals for pedal withdrawal and palpebral reflexes of the hind feet. Once an appropriate depth of anesthesia is achieved, shave the hair of the hind limbs and sterilize the shaved areas with 70%ethanol.Palpate the femur to identify the proper location for the incision. The femur is located just proximal to the most accessible segment of the sciatic nerve. After making a two to three centimeter incision in the skin along the hind limb from the knee up to the greater trochanter locate the plane between the biceps femoris muscle and the gluteus maximus muscle.Then use microdissection scissors to separate the underlying fascia and expose two to three centimeters of the underlying sciatic nerve. Use a retractor to widen the gap between the two muscles. With fine forceps and iris scissors carefully separate the nerve from the surrounding connective tissue, taking great care not to compress or cut the nerve.Next, cover the exposed nerve with Trump's Fixative and let sit for 10 minutes. If necessary, place gauze under the hind leg to improve the angle so that more fixative can be added into the cavity. Remove the fixative after 10 minutes and repeat this step two more times.Under the dissecting microscope cut the sciatic nerve from both sides using fine dissection scissors, making sure not to stretch or pinch the nerve. Immediately put the nerve sections in 15 mL tubes containing Trump's Fixative and fix at four degrees Celsius for one week, changing the fixative every 48 hours. Post-fixation, carefully remove any remaining fat and connective tissues from the nerve, and use a sharp scalpel to cut the nerve into segments approximately five millimeters in length.Nerve segments can be separated into different labeled tubes. Immerse nerve segments in freshly prepared 2%osmium tetroxide for two hours. Using an epoxy embedding kit, prepare the final embedding mixture.Mix the epoxy embedding medium with DDSA solution and mix the epoxy embedding medium with NMA solution. Mix both solutions for at least 20 minutes with a magnetic stirrer. Immediately before use, combine the accelerator DPM to solution B and then combine this with solution A such that the accelerator's final proportion is between one point five and 2%of the total volume.Transfer the nerve segments to one point five milliliter tubes and after washing with PBS, start the dehydration process by the replacing the PBS with increasing concentrations of acetone and distilled water for 10 minutes each then in 100%acetone three times for 10 minutes each. One critical step is the tissue dehydration. Water and resin will not interact, so any water remaining in the tissue will not be infiltrated by the resin leaving holes in the section devoid of histological qualities.For resin infiltration, first place the nerve segments in a one-to-one mix of embedding mixture and 100%acetone for 30 minutes. After 30 minutes, transfer the segments to a two-to-one mix of embedding mixture and 100%acetone for 30 minutes. Place the nerve segements in silicone rubber embedding molds and gently add the resin on top of nerves, making sure to cover the whole nerve segment while avoiding air bubbles.Leave the resin to polymerize at 60 degrees Celsius overnight. Place a resin block with embedded nerve into the ultramicrotome holder with the trapezoidal side facing up. While viewing through the ultramicrotome scope, use a single-edged blade to trim excess resin surrounding the nerve tissue.Do not penetrate the longitudinal surface of the nerve segment which is recognizable by its dark staining by osmium tetroxide. With a plain glass knife on the ultramicrotome make multiple cross sections to expose a uniform cross-section surface of the nerve. Once this is done, switch to a glass knife with the boat filled with distilled water at room temperature and adjust the ultramicrotome to one to two microns to cut thin sections.Use a metal loop to transfer floating thin sections from the glass knife boat to a drop of deionized water on a glass slide. Another critical step is during the transfer of thin section from the glass knife to slide. These thin sections are very fragile and can break or fold.After sectioning, dry the sections on the slides by passing a slide over a flame several times, making sure not to overheat the sections. Slides can be stored at room temperature for several days if not immediately staining with toluidine blue. To stain the nerve sections, use a plastic pipette or micropipetter to add a drop of toluidine blue solution on the top of the nerve sections.After 20 to 30 seconds, rinse off all toluidine blue solution excess by gently dipping the slides into a jar of deionized water, repeating three to four times until sections are clear. Dry the slides for at least 15 minutes at 60 degrees Celsius or overnight at room temperature. After drying, add regular mounting medium and cover the sections with a coverslip.Finally, examine the mounted sections under a light microscope. A 100X oil immersion lens is recommended for detailed images to calculate g-ratios. Sciatic nerve sections embedded in resin medium and stained with toluidine blue showed clear images with optimal resolution at increasing magnification from 10X to 20X, 40X, and 60X.This method preserves nerve structure and allows for high-resolution, high-magnification imaging which facilitates the measurement of several parameters such as the g-ratio, which is the ratio of axon diameter, indicated by the arrow labeled B, to the total fiber diameter, labeled A.A variety of factors can lead to less than optimal peripheral nerve sections, including the presence of cracks in the section due to improper handling of the nerve. Holes can also occur in the section due to insufficient dehydration. Another possible error in the procedure is folding of the sections, which can be remedied by using inoculating loops for section transfer onto the glass slide.Following this procedure other methods like axon quantification can be performed to answer additional questions like what's the degree of regeneration in a regenerative nerve? After watching this video you should have a good understanding of how to obtain one to two micron peripheral nerve sections to assess nerve morphometry.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

عضوي النمط من الثقافة شريحة GFP - معربا عن أجنة الفئران لريال مدريد في الوقت ثمرة تصوير الأعصاب الطرفية

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

تحليل المناعى في الجهاز العصبي المركزي والمحيطي الجرذ العقدة الليمفاوية أقسام الأنسجة

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

زرع الخلايا الشمية مغمد لتقييم الانتعاش وظيفية بعد إصابة العصب المحيطي

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

تصور الآثار المترتبة على تجربة إيجابية في وقت مبكر، اللمس تحفيز، على مورفولوجيا شجيري ومتشابك الربط مع جولجي كوكس تلطيخ

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

تحفيز Optogenetic من العصب السمعي

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

وغير المباشرة العصبية نجمية Coculture الفحص: هناك<em&gt; في المختبر</em&gt; مجموعة المتابعة للتحقيق مفصل من التفاعلات العصبية، الدبقية

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

تحليل الجذعية الصرف في الأعمدة والطبقات

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

استهداف المجاميع ألفا سينوكلين في ألياف الأعصاب الطرفية الجلدية عن طريق اختبار المناعة العائمة الحرة

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D تحليل الحركية للتقييم الوظيفي في نموذج الفئران من عرق النسا الأعصاب سحق الإصابة

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Preparation of Peripheral Nerve Stimulation Electrodes for Chronic Implantation in Rats

إعداد أقطاب تحفيز الأعصاب الطرفية للزرع المزمن في الفئران

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. ...