Name: toluidine blue staining of resin-embedded sections for evaluation of peripheral nerve morphology
Uploaded: 2018-07-03T15:00:00
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Les auteurs désirent thankthe Jenkins Microscopy Facility à l’Université du Wyoming pour leur aide et les membres du laboratoire Bushman, Kelly Roballo, Hayden vrai, Wupu Osimanjiang et Philippe Dhunghana, pour l’assistance au soin des animaux. Cette publication a été rendue possible par une sentence de développement institutionnel (IDeA) de la National Institute of General Medical Sciences, de la National Institutes of Health sous Grant # 2P20GM103432.

Rats Sprague Dawley adultes ont été utilisées dans ce projet et toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de l’utilisation et le soin des animaux institutionnels Université du Wyoming.
1. chirurgie et dans la Fixation du nerf Vivo
Remarque : Les informations sur le fournisseur pour tous les matériaux et équipements utilisés dans le présent protocole sont répertoriés dans la Table des matières.
<p class="jov...

<ol>
	<li>Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarities+between+angiogenesis+and+neural+development:+What+small+animal+models+can+tell+us.">Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us.</a> Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).</li><li>Grinsell, D., Keating, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+reconstruction+after+injury:+A+review+of+clinical+and+experimental+therapies.">Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies.</a> BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).</li><li>Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+fillers+in+nerve+conduits+for+peripheral+nerve+repair.">Luminal fillers in nerve conduits for peripheral nerve repair.</a> Annals of Plastic Surgery. 57 (4), 462-471 (2006).</li><li>Scipio, F., Raimondo, S., Tos, P., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+protocol+for+paraffin-embedded+myelin+sheath+staining+with+osmium+tetroxide+for+light+microscope+observation.">A simple protocol for paraffin-embedded myelin sheath staining with osmium tetroxide for light microscope observation.</a> Microscopy Research and Technique. 71, 497-502 (2008).</li><li>Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5:+Methods+and+protocols+in+peripheral+nerve+regeneration+experimental+research:+part+II-morphological+techniques.">Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques.</a> International Review of Neurobioly. 87, 81-103 (2009).</li><li>Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Campos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+myelin+sheath+and+collagen+reorganization+pattern+in+a+model+of+peripheral+nerve+regeneration+using+an+integrated+histochemical+approach.">Evaluation of myelin sheath and collagen reorganization pattern in a model of peripheral nerve regeneration using an integrated histochemical approach.</a> Histochemistry and Cell Biology. , 709-717 (2011).</li><li>Sridharan, G., Shankar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toluidine+blue:+A+review+of+its+chemistry+and+clinical+utility.">Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16, 251-255 (2012).</li><li>Epstein, J. B., Scully, C., Spinelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toluidine+blue+and+Lugol's+iodine+application+in+the+assessment+of+oral+malignant+disease+and+lesions+at+risk+of+malignancy.">Toluidine blue and Lugol's iodine application in the assessment of oral malignant disease and lesions at risk of malignancy.</a> Journal of Oral Pathology &amp; Medicine. 21, 160-163 (1992).</li><li>Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+assessment+in+peripheral+nerve+tissue+engineering.">Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering.</a> Neural Regeneration Research. 9, 1657-1660 (2014).</li><li>Dykstra, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A manual of applied techniques for biological electron microscopy. , 257 (1993).</li><li>Vleggeert-Lankamp, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+evaluation+methods+in+the+assessment+of+peripheral+nerve+regeneration+through+synthetic+conduits:+A+systematic+review.">The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: A systematic review.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).</li><li>Williams, P., Wendell-Smith, C. P., Finch, A., Stevens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+uses+and+methods+of+processing+of+fresh+frozen+sections+of+peripheral+nerve.">Further uses and methods of processing of fresh frozen sections of peripheral nerve.</a> Journal of Cell Science. 3 (69), 99-105 (1964).</li><li>Castro, J., Negredo, P., Avenda&#241;o, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+composition+of+the+rat+sciatic+nerve+and+its+modification+during+regeneration+through+a+sieve+electrode.">Fiber composition of the rat sciatic nerve and its modification during regeneration through a sieve electrode.</a> Brain research. , 65-77 (2008).</li><li>Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+protocols+in+peripheral+nerve+regeneration+experimental+research:+Part+II-morphological+techniques.">Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: Part II-morphological techniques.</a> International review of neurobiology. 87, 81-103 (2009).</li><li>Bozkurt, A., Lassner, F., O'Dey, D., Deumens, R., B&#246;cker, A., Schwendt, T., Janzen, C., Suschek, C. V., Tolba, R., Kobayashi, E., Sellhaus, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microstructured+and+interconnected+pore+channels+in+a+collagen-based+nerve+guide+on+axonal+regeneration+in+peripheral+nerves.">The role of microstructured and interconnected pore channels in a collagen-based nerve guide on axonal regeneration in peripheral nerves.</a> Biomaterials. 33 (5), 1363-1375 (2012).</li><li>Weis, J., Brandner, S., Lammens, M., Sommer, C., Vallat, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+nerve+biopsies:+A+practical+guide+for+neuropathologists.">Processing of nerve biopsies: A practical guide for neuropathologists.</a> Clinical Neuropathology. 31 (1), 7-23 (2012).</li><li>Battiston, B., Tos, P., Geuna, S., Giacobini-Robecchi, M. G., Guglielmone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+repair+by+means+of+vein+filled+with+muscle+grafts.+II.+Morphological+analysis+of+regeneration.">Nerve repair by means of vein filled with muscle grafts. II. Morphological analysis of regeneration.</a> Microsurgery. 20 (1), 37-41 (2000).</li><li>Bhattacharyya, T. K., Thomas, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+staining+methods+for+resin-embedded+peripheral+nerve.">Comparison of staining methods for resin-embedded peripheral nerve.</a> Journal of Histotechnology. 27, 161-164 (2004).</li><li>Zbaeren, J., Zbaeren-Colbourn, D., Haeberli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+immunohistochemistry+on+improved+glycol+methacrylate-resin+sections.">High-resolution immunohistochemistry on improved glycol methacrylate-resin sections.</a> Journal of Histotechnology. 30 (1), 27-33 (2007).</li><li>Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+stains:+A+literature+review+and+case+study.">Histological stains: A literature review and case study.</a> Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2016).</li><li>Ezra, M., Bushman, J., Shreiber, D., Schachner, M., Kohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+and+nonporous+nerve+conduits:+the+effects+of+a+hydrogel+luminal+filler+with+and+without+a+neurite-promoting+moiety.">Porous and nonporous nerve conduits: the effects of a hydrogel luminal filler with and without a neurite-promoting moiety.</a> Tissue Engineering Part A. (9-10), 818-826 (2016).</li><li>Bhatnagar, D., Bushman, J. S., Murthy, N. S., Merolli, A., Kaplan, H. M., Kohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+glue+as+a+stabilization+strategy+in+peripheral+nerve+repair+when+using+porous+nerve+guidance+conduits.">Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28 (5), 79 (2017).</li></ol>

Examens des structures morphologiques des lésions du nerf périphérique et la régénération sont fréquents sujets d’étude13. Dans ce protocole, nous décrivons les étapes pour obtenir des images de haute qualité pour les analyses quantitatives de données histologiques à l’aide de tissu de nerf sciatique du rat incorporés dans des blocs de résine et colorées au bleu de toluidine. Cette technique fournit une image de la morphologie de nerf dans laquelle la régénération nerveuse p...

Nerfs périphériques s’étendent dans tout le corps, qui innervent les tissus cibles avec des axones moteurs ou sensoriels1. Nerfs périphériques congénitales causées par des troubles médicaux et les traumatismes représentent un problème majeur de santé publique et ont de grandes incidences économiques2,3. Malgré les progrès dans l’évaluation des résultats des lésions des nerfs périphériques et comprendre la régénération nerveuse, les méthodes traditionnelles comme l’histologie nerveuse et des techniques de coloration sont des outils indispensables pour évaluer qualitativement et quantitativement la santé nerveuse comme une mesure de résultat terminal dans des modèles animaux ou des tissus humains excisés. Ceci est souvent associé à des mesures électrophysiologiques de la fonction de nerf périphérique, où la morphométrie peut révéler pourquoi la régénération nerveuse fonctionnelle n’a ou n’a pas eu lieu.
Le bleu de toluidine souillant des sections de nerfs périphériques semi mince résine intégrée est une méthode spécialisée pour l’imagerie des fibres nerveuses myélinisées, de haute qualité et effacer des images détaillées de nerf structures4,5,6 . Le bleu de toluidine est un colorant métachromatique acidophile, découvert par Perkin, en 1856,7et a été utilisé dans plusieurs applications médicales8. Sections de nerfs périphériques teinté bleu de toluidine provenant de segments de nerfs enrobées dans la résine permet une visualisation claire des structures nerveuses. Visualisation de la structure de la gaine de myéline peut être améliorée par l’utilisation de tétroxyde d’osmium après fixation4,9. Le tétroxyde d’osmium est un oxydant et lipides fixateur agent toxique qui interagit avec des doubles liaisons dans les lipides, résultant dans la gaine de myéline des riches en lipides nettement défini10. Toutefois, le tétroxyde d’osmium est toxique et cher, nécessite une période d’incubation plus longue des segments du nerf et n’est pas toujours utilisée.
Méthodes alternatives de traitement et de coloration ont été développés pour la visualisation de la morphologie du nerf périphérique ; Paraffine, sectionnement cryogéniques et sectionnement de nerfs enrobées dans la résine époxy suivie par coloration au bleu de toluidine ou phénylènediamine solution a été utilisée pour quantifier les changements morphologiques des nerfs périphériques régénération 11,12 . Ces méthodes ont leurs avantages et le rendement des données essentielles sur le nombre d’axones, l’épaisseur de la myéline, diamètre de l’axone et diamètre de l’axone à fibres myélinisées diamètre (g-ratio) 11,13,14,15 .
La principale distinction le plongement de résine dans le présent protocole est qu’il facilite l’obtention de 1 à 2 μm de sections transversales épaisseur en raison de la dureté de la résine tout en conservant les qualités histologiques du nerf. Ces coupes minces, plutôt que les sections d’épaisseur 4-5 μm provenant de paraffine déguisant, fournissent des sections de nerfs périphériques avec une résolution plus élevée, ce qui permet une quantification plus précise de la myélinisation des axones, tels que le g-rapport, qui ne peut pas être obtenu à partir de sections plus épais16. Sectionnement cryogéniques peut être utilisés pour obtenir des Articles de 1 à 2 µm, il a été notre expérience qu’il est plus difficile d’obtenir des sections sans grandes de nombreuses fissures. Ces sections fissurées peuvent causer comptage inexactes des aspects de la myélinisation et le nombre d’axones.
En plus de bleu de toluidine17, une médaille d’argent de coloration méthode18 et coloration trichrome de Masson4 permet également de montrer les axones. Toutefois, à l’aide de résine enrobage des sections de nerf médian rat teinté avec l’hématoxyline et éosine ou de Masson trichrome gaines de myéline ont montré faibles et structures non reconnus, alors que le bleu de toluidine coloration a montré clairement la myéline gaine image et peut facilement être quantifiés4. Malgré quelques limitations, nerfs de coloration de résine intégrée périphérique bleu de toluidine est une technique qui peut être utilisée lorsque des images de haute résolution de morphologie de nerf sont requises.
L’inconvénient principal pour l’incorporation de la résine est qu’il prend du temps et ne permet pas d’immunomarquage du même tissu en raison de la difficulté de recherche d’antigène par rapport à la paraffine et des techniques de coupes congelées d’incorporé. Ainsi, il n’est pas généralement possible d’utiliser le même tissu pour immunostaining qui est traitée par enrobage résine pour coloration bleu de toluidine. Bien que pas utilisé ici, si vous souhaitez l’immunohistochimie en résine sections embarquées, l’utilisation de l’incorporation des résines de méthacrylate de glycol permet l’immunohistochimie sur coupes de tissus, mais c’est relativement cher19. Cela peut être quelque peu atténué en coupant les nerfs périphériques en segments distincts, certains pour enrobage résine e.a. pour immunostaining directement après fixation.
Le processus de formation de bleu de toluidine taches de résine intégrée des nerfs périphériques, comme l’analyse histopathologique plus, peut être divisé en cinq étapes, y compris la fixation, déshydratation, enrobage, sectionnement et20de coloration. Notre objectif ici est de fournir un protocole et des lignes directrices pratiques pour l’utilisation de résine teintées de sections de nerf sciatique de rat embarqués avec des images de haute qualité toluidine bleu d’acquérir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1092">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline</td>
			<td style="width:216px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">14200-075</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Glutaraldehyde Solution</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G6257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Toluidine Blue O</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Sodium Tetraborate Decahydrate</td>
			<td style="width:216px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:137px;">205950010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:216px;">Piramal</td>
			<td style="width:137px;">NDC 66794-013-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Epoxy Embedding Medium Kit</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">45359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Sodium Hydroxide Solution</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">72068</td>
			<td>To adjust Trump&#39;s fixative pH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Acetone</td>
			<td style="width:216px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:137px;">170942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Osmium Tetroxide Solution</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">75632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">VWR Micro Slides, Superfrost Plus</td>
			<td style="width:216px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Microscope Cover Glass</td>
			<td style="width:216px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12545102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Pelco Embedding Cast</td>
			<td style="width:216px;">Fisher Scientific</td>
			<td>NC9671811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Glass Knife Maker</td>
			<td style="width:216px;">RMC Products</td>
			<td style="width:137px;">GKM-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Ultramicrotome</td>
			<td style="width:216px;">RMC Products</td>
			<td style="width:137px;">MT-XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">15 mL Conical Tube</td>
			<td style="width:216px;">Falcon</td>
			<td>ISO 9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">4 mL Glass Vial</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>854190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:355px;">Razor Blades</td>
			<td style="width:216px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">55411-050</td>
			<td>For trimming resin block</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:355px;">Perfect Loop</td>
			<td style="width:216px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:137px;">70944</td>
			<td>For picking up thin resin sections</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm</td>
			<td style="width:216px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:137px;">71012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">100 Watt Oven</td>
			<td style="width:216px;">Millipore&#160;</td>
			<td style="width:137px;">6350115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Whatman Filter Paper</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">3 mL plastic pipette</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">Z331740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Micro-surgical Kit</td>
			<td style="width:216px;">World precision instruments</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Olympus fluorescence microscope</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toluidine blue staining of resin-embedded sections for evaluation of peripheral nerve morphology

Nerfs périphériques s’étendent dans tout le corps, qui innervent les tissus cibles avec les axones moteurs ou sensoriels. En raison de la généralisation, les nerfs périphériques sont souvent endommagés en raison d’un traumatisme ou d’une maladie. Méthodes et stratégies ont été développées pour évaluer les lésions des nerfs périphériques dans des modèles animaux, fonction et régénération, analysant la morphométrie des nerfs périphériques est devenue une mesure essentielle issue terminale. Points de coloration du nerf croix bleu de toluidine obtenues des sections nerveuses résine intégrée est une méthode reproductible pour les évaluations qualitatives et quantitatives des nerfs périphériques, permettant la visualisation de morphologie nombre d’axones et le degré de myélinisation. Cette technique, comme pour beaucoup d’autres méthodes histologiques, peut être difficile à apprendre et à maîtriser à l’aide de protocoles standard de l’écrits. Cette publication vise donc à accentuer des protocoles écrits pour la coloration des nerfs périphériques à la vidéographie de la méthode, à l’aide de nerfs sciatiques récoltés des rats bleu de toluidine. Dans ce protocole, nous décrivons la fixation in vivo des nerfs périphériques et collection du tissu et après fixation avec 2 % le tétroxyde d’osmium, incorporant des nerfs dans la résine époxyde et ultramicrotome sectionnement des nerfs à 2μm-1 épaisseur. Les sections nerveuses puis transféré à une lame de verre et colorées au bleu de toluidine, après quoi ils sont quantitativement et qualitativement évalués. Exemples de problèmes les plus courants sont indiqués, ainsi que des mesures pour atténuer ces problèmes.

Résine intégrée des nerfs périphériques sections colorées au toluidine bleues permettent des analyses quantitatives précises données histologiques. Un aperçu de la procédure apparaît (Figure 2). Sections de nerfs sciatiques incorporé dans le milieu de la résine et colorées au bleu de toluidine a montré clairement des images avec une résolution optimale (3 chiffres). Lésions nerveuses peuvent causer beaucoup de changements dan...

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Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

Nous présentons ici un protocole afin de visualiser les structures fines des nerfs périphériques en obtenant et en coloration de 1 à 2 µm sections avec toluidine bleu

Toluidine bleu coloration des Sections enrobées dans la résine pour l’évaluation de la morphologie des nerfs périphériques

Peripheral nerves extend throughout the body, innervating target tissues with motor or sensory axons. Due to widespread distribution, peripheral nerves ...

This method could help answer key questions in the fields of peripheral nerve injury and regeneration such as what is the morphometry of a peripheral nerve, how many axons are present, what is the state of myelination, and is there fibrotic tissue present? The main advantage of this technique is that it allows for high-resolution visualization of nerve features. Begin by placing an anesthetized rat in the prone position on the top of a dissection mat.Place a nose cone to maintain anesthesia with 1-2%isoflurane. To ensure adequate depth of anesthesia test the animals for pedal withdrawal and palpebral reflexes of the hind feet. Once an appropriate depth of anesthesia is achieved, shave the hair of the hind limbs and sterilize the shaved areas with 70%ethanol.Palpate the femur to identify the proper location for the incision. The femur is located just proximal to the most accessible segment of the sciatic nerve. After making a two to three centimeter incision in the skin along the hind limb from the knee up to the greater trochanter locate the plane between the biceps femoris muscle and the gluteus maximus muscle.Then use microdissection scissors to separate the underlying fascia and expose two to three centimeters of the underlying sciatic nerve. Use a retractor to widen the gap between the two muscles. With fine forceps and iris scissors carefully separate the nerve from the surrounding connective tissue, taking great care not to compress or cut the nerve.Next, cover the exposed nerve with Trump's Fixative and let sit for 10 minutes. If necessary, place gauze under the hind leg to improve the angle so that more fixative can be added into the cavity. Remove the fixative after 10 minutes and repeat this step two more times.Under the dissecting microscope cut the sciatic nerve from both sides using fine dissection scissors, making sure not to stretch or pinch the nerve. Immediately put the nerve sections in 15 mL tubes containing Trump's Fixative and fix at four degrees Celsius for one week, changing the fixative every 48 hours. Post-fixation, carefully remove any remaining fat and connective tissues from the nerve, and use a sharp scalpel to cut the nerve into segments approximately five millimeters in length.Nerve segments can be separated into different labeled tubes. Immerse nerve segments in freshly prepared 2%osmium tetroxide for two hours. Using an epoxy embedding kit, prepare the final embedding mixture.Mix the epoxy embedding medium with DDSA solution and mix the epoxy embedding medium with NMA solution. Mix both solutions for at least 20 minutes with a magnetic stirrer. Immediately before use, combine the accelerator DPM to solution B and then combine this with solution A such that the accelerator's final proportion is between one point five and 2%of the total volume.Transfer the nerve segments to one point five milliliter tubes and after washing with PBS, start the dehydration process by the replacing the PBS with increasing concentrations of acetone and distilled water for 10 minutes each then in 100%acetone three times for 10 minutes each. One critical step is the tissue dehydration. Water and resin will not interact, so any water remaining in the tissue will not be infiltrated by the resin leaving holes in the section devoid of histological qualities.For resin infiltration, first place the nerve segments in a one-to-one mix of embedding mixture and 100%acetone for 30 minutes. After 30 minutes, transfer the segments to a two-to-one mix of embedding mixture and 100%acetone for 30 minutes. Place the nerve segements in silicone rubber embedding molds and gently add the resin on top of nerves, making sure to cover the whole nerve segment while avoiding air bubbles.Leave the resin to polymerize at 60 degrees Celsius overnight. Place a resin block with embedded nerve into the ultramicrotome holder with the trapezoidal side facing up. While viewing through the ultramicrotome scope, use a single-edged blade to trim excess resin surrounding the nerve tissue.Do not penetrate the longitudinal surface of the nerve segment which is recognizable by its dark staining by osmium tetroxide. With a plain glass knife on the ultramicrotome make multiple cross sections to expose a uniform cross-section surface of the nerve. Once this is done, switch to a glass knife with the boat filled with distilled water at room temperature and adjust the ultramicrotome to one to two microns to cut thin sections.Use a metal loop to transfer floating thin sections from the glass knife boat to a drop of deionized water on a glass slide. Another critical step is during the transfer of thin section from the glass knife to slide. These thin sections are very fragile and can break or fold.After sectioning, dry the sections on the slides by passing a slide over a flame several times, making sure not to overheat the sections. Slides can be stored at room temperature for several days if not immediately staining with toluidine blue. To stain the nerve sections, use a plastic pipette or micropipetter to add a drop of toluidine blue solution on the top of the nerve sections.After 20 to 30 seconds, rinse off all toluidine blue solution excess by gently dipping the slides into a jar of deionized water, repeating three to four times until sections are clear. Dry the slides for at least 15 minutes at 60 degrees Celsius or overnight at room temperature. After drying, add regular mounting medium and cover the sections with a coverslip.Finally, examine the mounted sections under a light microscope. A 100X oil immersion lens is recommended for detailed images to calculate g-ratios. Sciatic nerve sections embedded in resin medium and stained with toluidine blue showed clear images with optimal resolution at increasing magnification from 10X to 20X, 40X, and 60X.This method preserves nerve structure and allows for high-resolution, high-magnification imaging which facilitates the measurement of several parameters such as the g-ratio, which is the ratio of axon diameter, indicated by the arrow labeled B, to the total fiber diameter, labeled A.A variety of factors can lead to less than optimal peripheral nerve sections, including the presence of cracks in the section due to improper handling of the nerve. Holes can also occur in the section due to insufficient dehydration. Another possible error in the procedure is folding of the sections, which can be remedied by using inoculating loops for section transfer onto the glass slide.Following this procedure other methods like axon quantification can be performed to answer additional questions like what's the degree of regeneration in a regenerative nerve? After watching this video you should have a good understanding of how to obtain one to two micron peripheral nerve sections to assess nerve morphometry.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

Culture organotypique d&#39;exprimant la GFP embryons de souris pour les images en temps réel d&#39;excroissance des nerfs périphériques

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Recherche

Neurosciences

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Analyse immunohistochimique dans le système nerveux central et périphérique Rat ganglionnaire sections de tissu

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

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Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

Visualiser les effets d&#39;une expérience précoce positive, tactile stimulation, sur dendritiques Morphologie et Synaptic connectivité avec Golgi-Cox coloration

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Stimulation optogenetic du nerf auditif

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

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Le Neuron-astrocyte indirecte coculture Assay: Un<em&gt; In vitro</em&gt; Mise en place pour l&#39;investigation détaillée des interactions Neuron-glie

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analyse dendritique Morphologie dans les colonnes et les couches

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

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To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

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Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Preparation of Peripheral Nerve Stimulation Electrodes for Chronic Implantation in Rats

Préparation d’électrodes de stimulation nerveuse périphérique pour l’implantation chronique chez les rats

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. ...