Name: intravenous and intra-amniotic in utero transplantation in the murine model
Uploaded: 2018-10-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model at JoVE.com

Eksperimentell protokollene ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen på barnas sykehus i Philadelphia.
1. opprette injeksjon Pipetter
<ol><li>Bruker en loddrett brønnene avtrekker, trekke en 100 µL microcapillary pipette (figur 1A - 1 C). Kalibrere brønnene puller slik at konisk slutten > 1 cm lang. Merk: I utgangspunktet innstillingene for puller bør justeres for en optimal lengde. En høyere varme innstilling vil gj...

<ol>
	<li>Loukogeorgakis, S., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+stem+cell+and+gene+therapy:+current+status+and+future+perspectives.">In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives.</a> European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).</li><li>Vrecenak, J., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+hematopoietic+cell+transplantation:+recent+progress+and+the+potential+for+clinical+application.">In utero hematopoietic cell transplantation: recent progress and the potential for clinical application.</a> Cytotherapy. 15, 525-535 (2013).</li><li>Peranteau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+murine+hemoglobinopathies+by+prenatal+tolerance+induction+and+postnatal+nonmyeloablative+allogeneic+BM+transplants.">Correction of murine hemoglobinopathies by prenatal tolerance induction and postnatal nonmyeloablative allogeneic BM transplants.</a> Blood. 126 (10), 1245-1254 (2015).</li><li>Vrecenak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Long-Term+Mixed+Chimerism+Achieved+in+a+Canine+Model+of+Allogeneic+in+utero+Hematopoietic+Cell+Transplantation.">Stable Long-Term Mixed Chimerism Achieved in a Canine Model of Allogeneic in utero Hematopoietic Cell Transplantation.</a> Blood. 124 (12), 1987-1995 (2014).</li><li>Peranteau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD26+Inhibition+Enhances+Allogeneic+Donor-Cell+Homing+and+Engraftment+after+in+utero+Hematopoietic-Cell+Transplantation.">CD26 Inhibition Enhances Allogeneic Donor-Cell Homing and Engraftment after in utero Hematopoietic-Cell Transplantation.</a> Blood. 108 (13), 4268-4274 (2006).</li><li>Waddington, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+gene+transfer+of+human+factor+IX+to+fetal+mice+can+induce+postnatal+tolerance+of+the+exogenous+clotting+factor.">In utero gene transfer of human factor IX to fetal mice can induce postnatal tolerance of the exogenous clotting factor.</a> Blood. 101 (4), 1359-1366 (2003).</li><li>Stitelman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Stage+Determines+Efficiency+of+Gene+Transfer+to+Muscle+Satellite+Cells+by+in+utero+Delivery+of+Adeno-Associated+Virus+Vector+Serotype+2/9.">Developmental Stage Determines Efficiency of Gene Transfer to Muscle Satellite Cells by in utero Delivery of Adeno-Associated Virus Vector Serotype 2/9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 1, 14040 (2014).</li><li>Endo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Transfer+to+Ocular+Stem+Cells+by+Early+Gestational+Intraamniotic+Injection+of+Lentiviral+Vector.">Gene Transfer to Ocular Stem Cells by Early Gestational Intraamniotic Injection of Lentiviral Vector.</a> Molecular Therapy. 15 (3), 579-587 (2007).</li><li>Boelig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Intravenous+Route+of+Injection+Optimizes+Engraftment+and+Survival+in+the+Murine+Model+of+In+utero+Hematopoietic+Cell+Transplantation.">The Intravenous Route of Injection Optimizes Engraftment and Survival in the Murine Model of In utero Hematopoietic Cell Transplantation.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22 (6), 991-999 (2016).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-amniotic+Transient+Transduction+of+the+Periderm+with+a+Viral+Vector+Encoding+TGF&#946;3+Prevents+Cleft+Palate+in+Tgf&#946;3-/-.+Mouse+Embryos.">Intra-amniotic Transient Transduction of the Periderm with a Viral Vector Encoding TGF&#946;3 Prevents Cleft Palate in Tgf&#946;3-/-. Mouse Embryos.</a> Molecular Therapy. 1, 8-17 (2013).</li><li>Roybal, J., Endo, M., Radu, A., Zoltick, P., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+gestational+gene+transfer+of+IL-10+by+systemic+administration+of+lentiviral+vector+can+prevent+arthritis+in+a+murine+model.">Early gestational gene transfer of IL-10 by systemic administration of lentiviral vector can prevent arthritis in a murine model.</a> Gene Therapy. 18 (7), 719-726 (2011).</li><li>Reay, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-Length+Dystrophin+Gene+Transfer+to+the+Mdx+Mouse+in+utero.">Full-Length Dystrophin Gene Transfer to the Mdx Mouse in utero.</a> Gene Therapy. 15 (7), 531-536 (2008).</li><li>Ahmed, S., Waddington, S., Boza-Mor&#225;n, M., Y&#225;&#241;ez-Mu&#241;oz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+Transduction+of+Spinal+Cord+Motor+Neurons+by+Intrauterine+Delivery+of+Integration-Deficient+Lentiviral+Vectors.">High-Efficiency Transduction of Spinal Cord Motor Neurons by Intrauterine Delivery of Integration-Deficient Lentiviral Vectors.</a> Journal of Controlled Release. 273, 99-107 (2018).</li><li>Haddad, M., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+Brain-Directed+AAV+Gene+Therapy+Results+in+Rapid,+Robust,+and+Persistent+Transduction+of+Mouse+Choroid+Plexus+Epithelia.">Fetal Brain-Directed AAV Gene Therapy Results in Rapid, Robust, and Persistent Transduction of Mouse Choroid Plexus Epithelia.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2, 101 (2013).</li><li>Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., MacKenzie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+in+utero+transplantation.">A mouse model of in utero transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2303 (2011).</li><li>Davey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jaagsiekte+Sheep+Retrovirus+Pseudotyped+Lentiviral+Vector-Mediated+Gene+Transfer+to+Fetal+Ovine+Lung.">Jaagsiekte Sheep Retrovirus Pseudotyped Lentiviral Vector-Mediated Gene Transfer to Fetal Ovine Lung.</a> Gene Therapy. 19 (2), 201-209 (2011).</li></ol>

In utero transplantasjon er en potensiell terapi for mange medfødt lidelser som kan diagnostiseres tidlig i svangerskapet. Murine modell for IUT tillater forskere å utforske fosterets miljøet eller eksperimentere med forskjellige terapi. Avhengig av hva er blitt injisert, og hva er målrettet, gir intravenøs eller intra-amniotic i utero transplantasjon en pålitelig levering av en injectant i den ønskede plassen.
Når målretting bestemte organer, er det viktig å velge ...

Nylige fremskritt innen prenatal screening og diagnose har avdekket at behandling av fosteret for en rekke medfødte sykdommer som ikke har tilstrekkelig postnatal behandlingstilbud og resultere i betydelig sykelighet og dødelighet. Spesielt har i utero blodkreft stilk cellen transplantasjon (IUHCT) og gene terapi/genomet redigering potensial til å dra nytte av normal utviklingsmessige egenskaper av fosteret å behandle medfødt hematologic, immun og genetisk lidelser mer effektivt enn postnatal HSC transplantasjon og gene terapi/genomet redigering kan gjøre1,2. Spesielt på grunn av den lille størrelsen på fosteret, kan giveren cellen eller viral vector-dose maksimeres per vekten av mottakeren. I tillegg lar immunologic umodenhet av fosteret donor HSCs skal injiseres uten myeloablative og suppressive condition som kreves i postnatal transplantasjon protokoller. Tilsvarende kan viral vektorer bærer en terapeutisk transgene eller genomet redigering teknologi injiseres uten en begrensende immunrespons transgene produktet eller viral vektoren. Til slutt, tilgjengelighet og proliferativ natur fosterets stammen/stamfar celler råd mulighet for en mer effektiv Albin på målet stamfar celler, samt visse former for genomet redigering (homologi-rettet reparasjon) som krever sykling celler oppstår effektivt. Murine modellen fungerer som en innsiktsfull og rimelig måte å ta opp viktige spørsmål i stem cell biology og immunologi før eksperimentere i pre-klinisk store dyr modeller og, som sådan, har fungert som den primære modellen IUHCT og i utero gene terapi har vært utforsket1,2,3.
Selv om mange variabler spiller en viktig rolle i suksessen til IUHCT og i utero gene terapi/genomet redigering i murine og store dyr modeller, er en viktig variabel metoden for levering av HSCs eller viral vektor. Levering av store doser av donor HSCs med første-pass effekt oppstår i fosterets leveren, blodkreft orgel ved IUHCT, har vist seg å være medvirkende i å oppnå macrochimeric nivåer med engraftment i mus og store dyr modeller4 ,5. Dette var oppnådd via en injeksjon av donor cellene via eggeplomme venen i musemodell og via en intra cardiac injeksjon i hjørnetann modellen. Ruten injeksjon også spiller en grunnleggende rolle i utvelgingen progenitor celler av ulike organer under utvikling. For eksempel en intravenøs injeksjon via eggeplomme åre har vist seg å effektivt transduce cardiomyocytes og hepatocytter etter en sen svangerskapet injeksjon6,7. Alternativt kan en intra-amniotic injeksjon av viral vektorer målretting av organer som fysisk vises basert på embryonale folding/utvikling av injeksjon8. Dette er best eksemplifisert ved målretting av respiratoriske epitel via en intra-amniotic injeksjon sent i svangerskapet for å dra nytte av normal fosterets "puste" bevegelser, som viser luftveiene til viral vektor i den amniotic flytende9. Disse to modusene for IUT, intravenøs via eggeplomme venen og intra-amniotic, har vært grunnlaget for flere pågående og tidligere eksperimenter i vårt laboratorium. I denne protokollen beskrive vi i detalj metodene for å utføre intravenøs og intra-amniotic IUT i murine modellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="826">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Gloves</td>
			<td style="width:168px;">Cardinal Health</td>
			<td style="width:147px;">2D73DP65</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Adson Forceps w/ teeth</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Adson Forceps w/o teeth</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Curved scissors</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">14075-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Heavy Scissors</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">14002-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Needle Driver</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">12005-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Vicryl 2.0</td>
			<td style="width:168px;">Ethicon</td>
			<td style="width:147px;">JB945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Transfer Pipette</td>
			<td style="width:168px;">Medline</td>
			<td style="width:147px;">GSI135010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Cotton Tipped Applicators</td>
			<td style="width:168px;">Medline</td>
			<td style="width:147px;">MDS202000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">50 mL Conical tube</td>
			<td style="width:168px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:147px;">14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Tape</td>
			<td style="width:168px;">3M</td>
			<td style="width:147px;">1527-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Eye lubricant</td>
			<td style="width:168px;">Major LubriFresh</td>
			<td style="width:147px;">0904-6488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Heating Pad</td>
			<td style="width:168px;">K&#38;H</td>
			<td style="width:147px;">3060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:168px;">Leica</td>
			<td style="width:147px;">MZ16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Injector</td>
			<td style="width:168px;">Narishige</td>
			<td style="width:147px;">HI01PK01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Glass Capillary tubes</td>
			<td style="width:168px;">Kimble</td>
			<td style="width:147px;">71900-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Vertical Micropipette Puller</td>
			<td style="width:168px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:147px;">P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Microelectrode Beveler</td>
			<td style="width:168px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:147px;">BV-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">IM-300 Pneumatic Microinjector</td>
			<td style="width:168px;">Narishige</td>
			<td style="width:147px;">IM-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Insulin Syringe&#160;</td>
			<td style="width:168px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:147px;">305935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Filter</td>
			<td style="width:168px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:147px;">25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Compac5 Anesthesia Machine</td>
			<td style="width:168px;">VetEquip Compac5</td>
			<td style="width:147px;">901812&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:168px;">Piramal Critical Care</td>
			<td style="width:147px;">NDC 66794-017-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">N2 gas</td>
			<td style="width:168px;">Airgas</td>
			<td style="width:147px;">NI 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">O2 gas</td>
			<td style="width:168px;">Airgas</td>
			<td style="width:147px;">OX 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Ad-GFP viral vector</td>
			<td style="width:168px;">Penn Vector Core</td>
			<td style="width:147px;">H5&#39;.040.CMV.eGFP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravenous and intra-amniotic in utero transplantation in the murine model

In utero transplantasjon (IUT) er en unik og allsidig modus av å innføre stamceller, viral vektorer eller noen andre stoffer tidlig i av svangerskapet. Begrunnelsen bak IUT for terapeutiske formål er basert på den lille størrelsen på fosteret, fosterets immunologic umodenhet, tilgjengelighet og proliferativ natur fosterets stammen eller stamfar celler og potensial til å behandle en sykdom eller utbruddet av symptomene før fødselen. Utnytter normal utviklingsmessige egenskapene av fosteret, levering av blodkreft stamceller (HSC) via en IUT har potensial til å behandle medfødt hematologic sykdommer som sigdcelleanemi, uten de nødvendige myeloablative eller suppressive condition kreves for postnatal HSC transplants. Tilsvarende gir tilgjengelighet av progenitor celler i flere organer under utvikling potensielt en mer effektiv målretting av stammen/stamfar celler etter en IUT viral vektorer for genterapi eller genomet redigering. I tillegg kan IUT bli brukt til å studere normal utviklingsprosesser inkludert, men ikke begrenset til, utviklingen av immunologiske toleranse. Murine modellen gir en verdifull og rimelig måte å forstå muligheter og begrensninger på IUT før pre-klinisk store dyrestudier og en eventuell klinisk anvendelse. Her beskriver vi en protokoll for å utføre en IUT i murine fosteret gjennom intravenøs og intra-amniotic. Denne protokollen er brukt med hell å belyse de nødvendige betingelsene og mekanismene bak i utero blodkreft stilk cellen transplantasjon, toleranse induksjon og i utero genterapi.

Overlevelse og engraftment er viktige mål for suksess for IUHCT eksperimenter. Avhengig av spesifikke endepunktene på et eksperiment, kan fostre mottok en IUHCT analyseres prenatally ved en c-delen eller fødselen. Gjennomsnittlig varierer overlevelse etter intravenøs injeksjoner fra 75-100%. Overlevelse etter intra-amniotic injeksjoner pleier å virkelig bedre enn intravenøs injeksjoner, på rundt 85-100%.
I vårt laborator...

Watch this Scientific Journal Video about Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model at JoVE.com

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenøs og Intra-amniotic In Utero transplantasjon i Murine modellen

Vi beskriver en protokoll for å utføre en i utero transplantasjon (IUT) gjennom intravenøs og intra-amniotic ruter av injeksjon i murine modellen. Denne protokollen kan brukes å innføre celler, viral vektorer og andre stoffer i unike immun-tolerant fosterets miljøet.

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i embryologi, genterapi og stamcelletransplantasjon. En fordel med denne teknikken er at den muliggjør analyse av effekten av ulike eksperimentelle terapier på Murine fostre. Demonstrere denne prosedyren vil være leger Nicholas Ahn, og Barbara Coons, leger og stipendiater i vårt laboratorium.Før du begynner prosedyren, slipp fem til 10 mikroliter sterile PBS inn og ut av den kirurgiske nålespissen, to til tre ganger for å fjerne det av mulig rusk. Deretter fyller du nålen med reagensen av interesse ved riktig eksperimentelt volum og konsentrasjon. Og trykk på modusknappen tre ganger på mikroinjektoren for å gå videre til injeksjonskalibreringsskjermen.Legg til intervaller på 10 eller 100 millisekunder for å justere injeksjonstiden, og trykk på modusknappen to ganger til. Trykk på balanseknappen og trykk én gang på fotpedalen. Trykk deretter på pedalen igjen og vurder hvilket volum av løsningen som tømmes ut av nålen per trykk.Når mikroinjektoren kalibrerer til riktig eksperimentelt volum, fyll nålen til riktig nivå for injeksjonen. Når alle nålene er rengjort, bekrefter du mangel på respons på tåklemme av den gravide to til seks måneder gamle kvinnelige musen. Barber magen, ta vare på å ikke skade brystvortene, og overfør dyret til en varmepute i liggende stilling.Påfør salve på dyrets øyne og fest lemmer til varmeputen med tape. Og desinfiser den eksponerte huden. Injiser deretter lokalbedøvelse som 100 mikroliter på 0,25% Bupivacaine subkutant.Deretter gjør en en til to centimeter hud snitt slik at den nedre grensen er ikke nærmere enn en centimeter til introitus, og identifisere midtlinjen av fascia, ta vare på ikke å skade de omkringliggende epigastriske fartøyene. Bruk Adson-tang, klyp fasciaen uten å gripe noen av de underliggende organene eller fostrene, og åpne vevet med saks. Når det er trygt i bukhulen, utvide fascial snittet til lengden av huden snitt, og bruke bomull tips applikatorer for å flytte tarmene inn i den øvre delen av magen for å utsette gravid livmor.Trekk ut livmoren gjennom snittet som nøye identifiserer høyre og venstre eggstokkene for å sikre at alle fostrene telles. Plasser venstre livmor tilbake i magen slik at bare høyre livmor blir utsatt, for å holde de ikke-injiserte fostrene varme. Og forsiktig gripe på den mest laterale fostervannssekken mellom tommelen og pekefingrene til den ikke-dominerende hånden.Plasser disseksjonsmikroskopet over dyret og juster fokus og belysning for en bedre visualisering av fosteret etter behov. For en intravenøs injeksjon rotere livmoren slik at vitellin forgjeves, som skal injiseres er parallelt med nålespissen. Og legg nålen på livmoren i en fem graders vinkel for å pierce livmorveggen.Med spissen mellom livmorveggen og fostervannssekken, plasser spissen rett på toppen av vitellin forgjeves og i en nesten tangentiell vinkel, gli nålen over forgjeves til skråkanten går inn i fartøyet. Det er viktig at vinkelen holder seg lav slik at nålen ikke trenger inn i fartøyets bakvegg. Når det observeres et blodflekk på nålespissen, for å trykke på fotpedalen for å injisere hele volumet av materialet av interesse inn i fartøyet.For en intra fostervannsinjeksjon, roter fostervannssekken til et sted blottet for fartøy er funnet. Pek nålen vinkelrett på livmorveggen og pierce nålen gjennom livmor eggeplomme sac, og fostervannssec tar vare ikke trenge inn i fostervev. Deretter injiserer du riktig volum av ønsket materiale.Etter en av injeksjonstypene trekkes kanylen ut av injeksjonsstedet når ønsket volum er levert. Og fortsett til neste foster til alle fostrene i høyre livmorhorn er injisert. Deretter returnerer du høyre livmorhorn inn i magen.Og fjern venstre livmorhorn ut av magen. Når alle fostrene i venstre horn har blitt injisert returnere hele livmoren til magen, ta vare på å unngå en livmor eller tarm volvulus. Bruk en engangsoverføringspipette til å dispensere omtrent to milliliter steril PBS i magen, for å erstatte eventuelle uunnværlige tap.Og bruk 4-0 polyglactin 910 suturer for å lukke fascia og magen i ett sammenhengende lag. Deretter overfører du musen til et rent bur under en varmelampe med overvåking til full recumbency. I dette treningseksperimentet viste leverene til fostrene som fikk in-utero transplantasjon av en trainee lavere fluorescerende nivåer 24 timer etter injeksjon, på grunn av en lavere engraftment av de transplanterte GFP-cellene, enn gjorde lever injisert av en erfaren instruktør.Flow cytometrisk analyse for GFP positive donorceller korrelert også med det nedre nivået av fluorescerende som observeres under fluorescerende mikroskopi. Evnen til virale vektorer levert via intra-fostervannsveien for å transdusere celler i kontakt med fostervannet. Eksemplifiseres ved transduksjon av epitelceller 48 timer etter in utero injeksjon av Adeno virus som bærer GFP transgene i svangerskapsdagen 12,5 fostre.Når mestret denne teknikken kan fullføres i 15-25 minutter per gravid mus. Etter å ha sett denne videoen bør du ha en god forståelse av hvordan du trygt og effektivt kan levere forskjellige terapier til musefoss.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse av Sebrafisk Larver Skeletal Muscle Integrity med Evans blå Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Romlig og tidsmessig analyse av Active ERK i<em&gt; C. elegans</em&gt; kimcellelinje

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Culture of Murine embryonale metatarsals: en fysiologisk modell av endochondral Forbening

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

En ny mammarfettpute-transplantasjonsteknikk for å visualisere fartøygenerering av vaskulære endotelceller

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disseksjon og Immunofluorescent flekker av sopp kropp og Photoreceptor Neurons i voksen Drosophila melanogaster hjernen

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Bruk av RNAi og varme-sjokk-indusert transkripsjon faktor uttrykk å omprogrammere bakterie celler til nerveceller i C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediert tap av funksjon analyse i lillehjernen Granule celler ved hjelp av In Utero Electroporation-baserte genoverføring

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal Plate i Gastrulating Mouse embryoer skanning elektronmikroskop og hele Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

Vurdering av Ultrastructural Neuroplasticity parametere etter i Utero signaltransduksjon utvikle musen hjernen og ryggmarg

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Kontrollert kortikale Impact modell av mus hjerneskade med terapeutisk transplantasjon av Human indusert pluripotent Stem Cell-avledet nevrale celler

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...