Name: minimally invasive embryo transfer and embryo vitrification at the optimal embryo stage in rabbit model
Uploaded: 2019-05-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Mittel des spanischen Ministeriums (AGL2017-85162-C2-1-R) und Generalitat Valenciana Research Programme (PrometeoII 2014/036) unterstützt. Englische Textversion, die von N. Macowan English Language Service überarbeitet wurde

Alle experimentellen Verfahren, die in dieser Studie angewendet werden, wurden gemäß der Richtlinie 2010/63/EU-EWG für Tierversuche durchgeführt und von der Ethikkommission für Experimente mit Tieren der Universität Politècnica de València überprüft und genehmigt, Spanien (Forschungscode: 2015/VSC/PEA/00170). XGD, FMJ, MPVC und JSV besitzen eine von der valencianischen Regierungsverwaltung ausgestellte Zulassungsbescheinigung, um an Tieren zu experimentieren. XGD ist ermächtigt, das Wohlergehen und die Pflege ...

Seit dem ersten dokumentierten Lebendgeburtsfallausübertragenen Embryonen 9 sind diese Technik und die Kaninchenarten in Fortpflanzungsstudien entscheidend geworden. Darüber hinaus erfordern Embryonenforschungsstudien zu Manipulation, Produktion, Kryokonservierung usw . als letzten Schritt die Bewertung der Embryonenkapazität, um gesunde Vollzeitergebnisse zu erzeugen. Daher ist die Embryotransfer-Technik13,28unverzichtbar. Im ...

Mit dem Ziel, die menschliche Unfruchtbarkeit zu umgehen oder die Verbreitung von Nutztieren mit hohem genetischen Wert zu verbessern und die genetischen Ressourcen der Tiere zu erhalten, wird eine Reihe von Techniken, die gemeinhin als assistierte Fortpflanzungstechnologien bezeichnet werden, wie zum Beispiel Superovulation, in Die vitro-Fertilisation , die Embryonenkultur oder die Kryokonservierung wurden1,2entwickelt. Derzeit werden hormonelle Behandlungen gegeben, um die Eierstöcke zu stimulieren und eine große Anzahl von antralen Eierstöcken follikeln1. Oozyten, die aus diesen Follikeln gesammelt werden, können gereift, gedüngt und in vitro entwickelt werden, bis sie entweder kryokonserviert oder an Leihmütter übertragen werden3. Während dieser Behandlungen sind Gameten und Zygoten jedoch einer Reihe nicht-physiologischer Prozesse ausgesetzt, die eine Embryonenanpassung erfordern könnten, um unter diesen Bedingungen4,5zu überleben. Diese Anpassung ist aufgrund der frühen Embryoplastizität möglich, die Embryonenveränderungen in der Genexpression und Entwicklungsprogrammierung6ermöglicht. Diese Änderungen können jedoch die nachfolgenden Stadien der Embryonenentwicklung bis ins Erwachsenenalter beeinflussen, und es ist inzwischen allgemein anerkannt, dass Methoden, Timing, Kryokonservierungsverfahren oder Kulturbedingungen unterschiedliche Ergebnisse über das EmbryonenSchicksal zeigen. , 8. Um die spezifischen induzierten Wirkungen von ARTs zu erklären, ist daher der Einsatz gut charakteristischer Tiermodelle unvermeidlich.
Die erste dokumentierte Lebengeburt, die durch die Übertragung von Säugetierembryonen resultierte, fand 1890statt. Heute ist der Embryotransfer (ET) zu einem Leihmautat ein entscheidender Schritt bei der Untersuchung der ART-induzierten Effekte während der Preimenplantation auf den nachfolgenden Embryonalentwicklungsstufen 10. Die ET-Techniken hängen von der Größe und der anatomischen Struktur jedes Tieres ab. Bei großen Tiermodellen ist es möglich gewesen, ET durch transzervikale nichtchirurgische ET-Techniken durchzuführen, aber bei kleineren Arten ist Katheterisierung des Gebärmutterhalses komplexer und chirurgische Techniken werden häufig verwendet 11. Allerdings kann chirurgisches ET zu Blutungen führen, die die Implantation und die Embryonenentwicklung beeinträchtigen könnten, da Blut in das Gebärmutterlumen eindringen kann, was den Embryonentod 10 verursacht. Transcervical-nichtchirurgische ET-Techniken werden immer noch bei Menschen, Pavianen, Rindern, Schweinenund Mäuse 12, 13, 14, 15,16,17 angewendet,aberchirurgisch ETS wird immer noch in Arten wie Ziegen, Schafe oder andere Tiere, die zusätzliche Schwierigkeiten 10,18, 19, 20,21,wieKaninchen (zwei Unabhängige cervices) oder Mäuse (kleine Größe). Dennoch sind chirurgische Übertragungsmethoden in der Regel nach und nach durch weniger invasive Methoden ersetzt worden. Die Endoskopie wurde zur Übertragung von Embryonen eingesetzt, zum Beispiel bei Kaninchen, Schweinen und kleinenWiederkäuern 18,19,20. Diese minimal-invasiven Endoskopie-Methoden können verwendet werden, um Embryonen über das Infundibulum in die Ampulla zu übertragen, das bei Kaninchen unverzichtbar ist und bei einigenArten 20 positive Wirkungen gezeigt hat. Dies beruht auf der Bedeutung des richtigen Dialogs zwischen Embryo und Mutter während der frühen Embryonenphase im oviduct. Wie bereits erwähnt, ist der Embryonenumzug, der bei Kaninchen während der Embryonenwanderung durch den oviductstattfindet, unerlässlich, um Embryonen zu erreichen, die in der Lage sind, 22,23zu implantieren.
Größere Tiermodelle, wie Rinder, sind interessant, weil die Biochemie-und Präimplantationsmerkmale denen der menschlichen Spezies 24ähneln. Große Tiere sind jedoch zu teuer, um sie in Vorversuchen einzusetzen, und Nagetiere gelten als ideales Modell (76% Modellorganismen sind Nagetiere) für Laborforschung 25. Dennoch bietet das Kaninchenmodell einige Vorteile gegenüber Nagetieren in Fortpflanzungsstudien, da einige reproduktive biologische Prozesse, die von Menschen gezeigt werden, bei Kaninchen ähnlicher sind als bei Mäusen. Mensch und Kaninchen weisen eine ähnliche chronologische embryonale Genomaktivierung, Gastrulation und hemochronische Plazenta-Struktur auf. Darüber hinaus ist es möglich, mit Kaninchen den genauen Zeitpunkt der BefruchtungundSchwangerschaftsstadien aufgrund ihres induzierten Eisprungs 25 zu kennen. Kaninchenlebenszyklen sind kurz, vollenden die Schwangerschaft in 31 Tagen und erreichen die Pubertät bei etwa 4-5 Monaten; Das Tier ist aufgrund seines gefügigen und nicht aggressiven Verhaltens leicht zu handhaben, und sein Unterhalt ist im Vergleich zu den Kosten größerer Tiere sehr sparsam. Darüber hinaus ist es wichtig zu erwähnen, dass Kaninchen eine Duplex-Gebärmutter mit zweiunabhängigenGebärmutterhalskrebs11,25haben. Dadurch wird das Kaninchen bevorzugt, da Embryonen aus den verschiedenen Versuchsgruppen in das gleiche Tier, aber in ein anderes Gebärmutterhorn übertragen werden können. So können wir beide experimentellen Effekte vergleichen und so den mütterlichen Faktor aus den Ergebnissen reduzieren.
Heute werden nicht-chirurgische ET-Methoden nicht mehr im Kaninchen eingesetzt. Einige Studien, die in den späten 90er Jahren mit einer Transcervical-ET-Technik durchgeführt wurden, führten zu niedrigenLieferraten von 5,5% bis 20,0%11,26gegenüber 50-65% durch chirurgische Methoden, darunter die Laparoskopie-Verfahren, die von beschrieben wurden. Besenfelder und Brem18. Die geringen Erfolgsraten dieser nicht-chirurgischen ET-Methoden bei Kaninchen decken sich mit dem Fehlen der notwendigen Embryonenumgestaltung im oviduct, die in transscervical ET vermieden wird. Hier beschreiben wir ein effektives minimal-invasives laparoskopisches ET-Verfahren, bei dem Kaninchen als Modellorganismus eingesetzt werden. Diese Technik ist ein Modell für die weitere Fortpflanzungsforschung bei großen Tieren und Menschen.
Da Kaninchen ein besonders schmales Zeitfenster für die Embryonenimplantation haben, erfordert ET in dieser Art ein hohes Maß an Synchronisation zwischen dem Entwicklungsstadium des Embryos bei ET und dem physiologischen Statusdes Empfängers 27. In einigen Fällen gibt es nach einer reproduktiven Behandlung, die die Embryonenentwicklung verlangsamt (wie in der In-vitro-Kultur) oder die Endometriumempfänglichkeit (wie Superovulationsbehandlungen), keine Synchronisation zwischen dem Embryo und der mütterlichen Gebärmutter. Diese Situationen können sich negativ auf das Ergebnis auswirken. Um in diesen Zusammenhängen zu reagieren, beschreiben wir ein effektives Kaninchenmorula-Vervitungsprotokoll, das es uns ermöglicht, die Experimente zu unterbrechen, zu organisieren und wieder aufzunehmen. Dieser Prozess ist logistisch wünschenswert für Fortpflanzungsstudien und gibt uns die Möglichkeit, Embryonen langfristig zu lagern, so dass sie transportiert werden können. Die laparoskopischen Verfahren und Kryokonservierungsstrategien ermöglichen eine bessere Planung von Studien mit weniger Tieren. So bietet unsere Methodik hygienische und wirtschaftliche Vorteile und entspricht dem Konzept der 3R (Ersatz, Reduktion und Verfeinerung) der Tierforschung mit dem erklärten Ziel, die menschliche Behandlung von Versuchstieren zu verbessern. So stellen Kaninchen mit diesen Methoden einen idealen Modellorganismus für in vivo reproduktiven Assays dar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine hydrochloride</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>626</td>
			<td>To be ordered by a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buserelin Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B3303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorhexidine digluconate soap</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>0265DCCJ500B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorhexidine digluconate solution</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>0265DCCA500B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td>Air Liquide</td>
			<td>99921</td>
			<td>CO2 N48.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>15385194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W387509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5773</td>
			<td>Without calcium chloride.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric razor</td>
			<td>Oster Golden A5</td>
			<td>078005-140-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoscope camera</td>
			<td>Optomic Spain S.A</td>
			<td>OP-714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoscope trocar with silicone leaflet valve</td>
			<td>Karl Storz Endoscopia Ib&#233;rica S.A.</td>
			<td>30114GK</td>
			<td>Lightweight trocar model.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>9993046</td>
			<td>To be ordered by a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epicraneal needle 23G</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>514056353</td>
			<td>Smaller needles can be also used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidural catheter</td>
			<td>Vygon corporate</td>
			<td>187.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidural needle</td>
			<td>Vygon corporate</td>
			<td>187.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>102466-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>5273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>184</td>
			<td>To be ordered by a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laparoscopy equipment</td>
			<td>Karl Storz Endoscopia Ib&#233;rica S.A.</td>
			<td>26003 AA</td>
			<td>Hopkins&#174; Laparoscope, 0&#186;-mm straight-viewing laparoscope, 30-cm length, 5-mm working channel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Optomic Spain S.A</td>
			<td>Fibrolux 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Air Liquide</td>
			<td>P1505XXX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical CO2 insufflator</td>
			<td>Karl Storz Endoscopia Ib&#233;rica S.A.</td>
			<td>Endoflator&#174;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>9993501</td>
			<td>To be ordered by a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 35-mm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS430165-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic dressing (Nobecutan)</td>
			<td>IBOR medica</td>
			<td>7140028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Straw 0.25 mL</td>
			<td>IMV - technologies</td>
			<td>6431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodide solution</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>02656DPYS500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-5880</td>
			<td>Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tube for insufflator</td>
			<td>Karl Storz Endoscopia Ib&#233;rica S.A.</td>
			<td>20400040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16F</td>
			<td>There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gloves</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>087GL010075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gown</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>12261501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile mask</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>058B15924B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straw Plug</td>
			<td>IMV - technologies</td>
			<td>6431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1-mL</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>11750425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 5-mL</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>11773313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urinary catheter</td>
			<td>IMV - technologies</td>
			<td>17722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>RAYPA</td>
			<td>BAE-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>525225</td>
			<td>To be ordered by a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbits</td>
			<td>Universitat Polit&#232;cnica de Val&#232;ncia</td>
			<td>Line A</td>
			<td>Other maternal lines, such as Line V or Line HP can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

minimally invasive embryo transfer and embryo vitrification at the optimal embryo stage in rabbit model

Assistierte Reproduktionstechniken (ARTs), wie in der vitro-Embryonenkultur oder Embryonen-Kryokonservierung, beeinflussen natürliche Entwicklungsmuster mit perinatalen und postnatalen Folgen. Um die Unschuld von ART-Anwendungen zu gewährleisten, sind Studien in Tiermodellen notwendig. Darüber hinaus erfordern die Studien zur Embryonenentwicklung als letzten Schritt eine Bewertung ihrer Fähigkeit, einen vollzeitlichen gesunden Nachwuchs zu entwickeln. Hier ist der Embryotransfer in die Gebärmutter unverzichtbar, um alle ARTs-bezogenen Experimente durchzuführen.
Das Kaninchen wird seit mehr als einem Jahrhundert als Modellorganismus verwendet, um die Säugetierreproduktion zu untersuchen. Neben seiner phylogenetischen Nähe zur menschlichen Spezies und ihrer geringen Größe und geringen Wartungskosten hat sie wichtige reproduktive Eigenschaften wie induzierter Eisprung, eine Chronologie der frühen embryonalen Entwicklung, die dem Menschen ähnelt, und eine kurze Schwangerschaft. Damit können wir die Folgen der ART-Anwendung leicht untersuchen. Darüber hinaus werden bei dieser Art ARTs (wie intrazytoplasmatische Spermieninjektion, Embryonenkultur oder Kryokonservierung) mit entsprechender Effizienz angewendet.
Mit Hilfe der laparoskopischen Embryotransfer-Technik und des in diesem Artikel vorgestellten Kryokonservierungsprotokolls beschreiben wir 1) wie Embryonen durch eine einfache, minimal-invasive Technik übertragen werden können und 2) ein wirksames Protokoll für die langfristige Lagerung von Kaninchen Embryonen, die zeit-flexible Logistikkapazitäten und die Transportfähigkeit der Probe bieten. Die Ergebnisse, die nach der Übertragung von Kaninchenembryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien erzielt wurden, deuten darauf hin, dass Morula die ideale Stufe für die Wiederherstellung und Übertragung von Kaninchenembryonen ist. Daher ist ein oviductaler Embryotransfer erforderlich, der den chirurgischen Eingriff rechtfertigt. Darüber hinaus werden Kaninchenmorulae erfolgreich verglast und laparoskopisch übertragen, was die Wirksamkeit der beschriebenen Techniken beweist.

Minimal invasive laparoskopische Übertragung von frischen oder verglasten Embryonen zählt das Kaninchen zu den besten Modelltieren für Fortpflanzungsstudien. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse von frischem ET in verschiedenen Entwicklungsstadien (Abbildung 4) übertragender Embryonen. Die Überlebensrate bei der Geburt (Prozentsatz der Embryonen, die zu einem Aufschlag führen) bewies die Wirksamkeit der laparoskopischen Technik, die in diesem...

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Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Minimal invasiven Embryotransfer und Embryo-Vitrifizierung auf der Optimal-Botn-Bühne im Kaninchenmodell

Die assistierten Reproduktionstechniken (ARTs) werden kontinuierlich bewertet, um die Ergebnisse zu verbessern und die damit verbundenen Risiken zu reduzieren. Dieses Manuskript beschreibt ein minimal-invasives Embryotransfer-Verfahren mit einem effizienten Kryokonservierungsprotokoll, das die Verwendung von Kaninchen als ideales Tiermodell der menschlichen Fortpflanzung ermöglicht.

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Das Hauptziel dieses Experiments ist es, ein laparoskopisches Embryotransferverfahren bei Kaninchen als Modell zu beschreiben. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass diese arbeitet, um Embryonen mit einer einfachen, minimal-invasiven Technik zu übertragen. Darüber hinaus funktioniert das hier beschriebene effektive Embryo-Kryokonservierungsprotokoll auch für die langfristige Lagerung der Kaninchenembryonen und bietet zeitflexible logistische Kapazitäten und die Fähigkeit, die Probe zu transportieren.Wie wir wissen, werden unterstützte Reproduktionstechnologien kontinuierlich bewertet, um die Ergebnisse zu verbessern und die damit verbundenen Risiken zu verringern. Daher kann Kaninchen mit beiden Techniken als ideales Tiermodell der menschlichen Fortpflanzung verwendet werden, um wichtige Fragen in diesem Bereich zu beantworten, wie die Auswirkungen der In-vitro-Embryomanipulation auf Nachkommen. Die visuelle Demonstration dieser Dinge ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte des Embryotransfers schwer zu erlernen sind, da sie mit großer Präzision durchgeführt werden müssen, um den Erfolg der Technik sicherzustellen.Für die embryonale Vitrifikation tauchen Sie die Embryonen zwei Minuten lang in eine Gleichgewichtslösung ein, gefolgt von einer einminütigen Inkubation in der Verglasungslösung. Am Ende der Inkubation die Embryonen in einen 125 Mikroliter-Mikroliter-Ministrohwagen aus Kunststoff laden und das geschlossene Ende des Ministrohs mit einem entsprechenden Milliliter-Mikrospender koppeln. Aspirieren Basismedium bis zu einem Drittel der Strohlänge, gefolgt von einer kleinen Luftblase.Als nächstes verwenden Sie ein Stereomikroskop, um die Embryonen in 40 Mikroliter Glasverglasungslösung zu saugen, gefolgt von einer weiteren kleinen Luftblase und genügend Basismedium, um die erste flüssige Fraktion bis zur Baumwolle des Mini-Strohs zu bewegen. Dann schließen Sie das geöffnete Ende des Mini-Strohs mit einem Strohstopfen, tauchen Sie den Mini-Stroh direkt in flüssigen Stickstoff, um die Verglasung zu erreichen, und lagern Sie den Mini-Strohhalm in einem flüssigen Stickstoff-Dewar. Um die Embryonen für einen Transfer aufzutauen, legen Sie den Mini-Strohhalm horizontal 10 Zentimeter aus dem flüssigen Stickstoffdampf für 20 bis 30 Sekunden.Wenn der Kristallisationsprozess im Mini-Stroh beginnt, tauchen Sie den Mini-Strohhalm 10 bis 15 Sekunden lang in das 25 Grad Celsius Wasserbad ein. Entfernen Sie sofort die Mini-Stroh- und Baumwollstecker und verwenden Sie einen gekoppelten Mikrospender, um den Mini-Strohinhalt in eine Platte mit 25 Grad Celsius Basismedium zu vertreiben, ergänzt mit 0,33 Molaren-Saccharoselösung, in der Embryonen fünf Minuten bleiben müssen. Dann übertragen Sie die Embryonen auf eine Platte mit frischem Basismedium für weitere fünf Minuten Inkubation.Beobachten Sie schon viele Tage zuvor wie das Alter der zu übertragenden Embryonen die Turgidität und Farbe der Vulvas der verfügbaren geschlechtsreifen 4,5 Monate alten weiblichen Kaninchen und induzieren Sie den Eisprung bei den empfänglichen Tieren mit einer einzigen intramuskulären Injektion eines Mikrogramms Buserelinacetat unabhängig vom Körpergewicht. Am Tag der Übertragung die frischen oder aufgetauten Embryonen in einem 37 Grad Celsius Basismedium unter einem Stereomikroskop abspülen und einen entsprechend konfigurierten 17-Spur-Epiduralkatheter an einer Ein-Milliliter-Spritze befestigen. Einen Zentimeter Basismedium in den Katheter aspirieren, gefolgt von einer kleinen Luftblase.Dann aspirieren fünf bis sieben Embryonen und 10 Mikroliter Basismedium, gefolgt von einer weiteren kleinen Luftblase und einem letzten Zentimeter Basismedium. Sobald die Embryonen geladen sind, legen Sie das anästhesierte Empfängerkaninchen in einen Käfig auf einer wärmenden Stufe und tragen Salbe auf die Augen des Tieres auf. Nach der Bestätigung einer mangelnden Reaktion auf Pedalreflex, rasieren Sie das Fell aus dem ventralen Bauch, reinigen Sie den chirurgischen Bereich mit Chlorhexidin Gluconat Seife, und entfernen Sie alle verbleibenden Haare.Bedecken Sie den Bereich mit einem sterilen Vorhang mit einem Loch für den chirurgischen Bereich, und legen Sie einen endoskopischen Trokar fünf Zentimeter in die Bauchhöhle, zwei Zentimeter kaudal zum zyphoiden Prozess, und verwenden Sie einen druckregulierenden mechanischen Insufflator, um die Peritonealhöhle aufzublasen. Setzen Sie die Endoskopkamera durch den endoskopischen Trokar ein, und setzen Sie die 17-Spur-Epiduralnadel in den Leistenbereich ein, zwei bis drei Zentimeter vom Infundibulum entfernt. Setzen Sie den geladenen Katheter durch die Epiduralnadel in den Bauch ein und legen Sie ein bis zwei Zentimeter des Epiduralkatheters durch das Infundibulum in die Ampulla ein.Drücken Sie den Katheterkolben vorsichtig, um die Embryonen in das Eileiterzusettier freizusetzen. Beide Luftblasen müssen aus dem Katheter austreten. Entfernen Sie den Katheter kurz nach der Freisetzung der Embryonen, und aspirieren und lassen Sie das verbleibende Medium, um das Fehlen der Embryonen zu bestätigen.Nach Bestätigung einer erfolgreichen Übertragung der Embryonen entfernen Sie die Epiduralnadel und die Endoskopkamera und geben Sie das abdominale Kohlendioxid durch den endoskopischen Trokar frei. Reinigen Sie den Tromonschnitt mit Chlorhexidinlösung und schließen Sie die Wunde mit einem mikronisierten Aluminium und einem Kunststoffverband. Behandeln Sie das Tier dann mit den entsprechenden Antibiotika und Schmerzmitteln und überwachen Sie das Tier bis zur vollständigen Genesung.Minimalinvasive laparoskopische Embryoübertragung enden das Kaninchen zu den besten Tiermodellen für Reproduktionsstudien, mit einem hohen Prozentsatz an übertragenen frischen Embryonen, was zu einem Welpen führt. Insbesondere werden höhere Werte erreicht, wenn der Frischembryontransfer mit Embryonen im frühen oder kompakten Morulaestadium durchgeführt wird. Ähnliche Ergebnisse werden nach dem frühen und verdichteten verglasten Kaninchenmorulatransfer beobachtet, insbesondere bei kompakten Morulan, die die Wirksamkeit und Zuverlässigkeit dieser Technik für die Übertragung frischer verglaster Embryonen bei Kaninchen bestätigen.Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie bedingte Assistive Reproductive Technologies durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie die Zugabe von Dichten später im Leben eine schmerzstillende Wirkung haben kann. Nach der jüngsten Entwicklung ebnet diese Technik wissenschaftlern auf dem Gebiet der Fortpflanzung den Weg, diesen Effekt beim Menschen auf der Grundlage der engen phylogenetischen Distanz zwischen Kaninchen und Menschen zu erforschen. So kann diese Technik Ergebnisse liefern, die leicht auf die klinische Medizin des Menschen übertragen werden können, sowie auf andere Säugetierarten.Vergessen Sie nicht, dass unsere Methode einige hygienische und wirtschaftliche Vorteile bietet, die dem Konzept von drei R von Tierschutz, Ersatz, Reduktion und Verfeinerung entsprechen, indem sie das Ziel verfolgt, die menschliche Behandlung von Versuchstieren zu verbessern.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microbead Implantation im Zebrafischembryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Beobachten Mitose und Dynamik in einer Live Zebrafischembryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Embryo Mikroinjektions und Elektroporation in der bei Chor<em&gt; Schlauchseescheide</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identifizierung von Erythromyeloid Progenitoren und deren Nachkommen in der Maus Embryo Durch Durchflusszytometrie

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Verwendung von Immunolabeling, stabilen, dynamischen und im Entstehen begriffene Mikrotubuli in Zebrafish Embryos zu analysieren

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM und Microrheology in den Zebrafish Embryos Eigelb Zelle

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout (Oncorhynchus Mykiss) and Brown Trout (Salmo Trutta Morpha fario)

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout Oncorhynchus Mykiss and Brown Trout Salmo Trutta Morpha fario

Wirksamkeit der Luft Stripping in zwei Lachsfische Fisch Regenbogenforelle (Oncorhynchus Mykiss) und Bachforelle (Salmo Trutta Morpha Fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Folgenden endokardialen Gewebe Bewegungen über Zelle Ladungszustand des Zebrafish Embryos

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

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Prüfende Zelle Mechanik mit Wulst-freie optische Pinzetten in Drosophila Embryos

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...