Name: minimally invasive embryo transfer and embryo vitrification at the optimal embryo stage in rabbit model
Uploaded: 2019-05-16T12:30:00
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यह काम अर्थव्यवस्था और स्पेन की प्रतिस्पर्धा (AGL2017-85162-C2-1-R) और Generalitat Valenciana अनुसंधान कार्यक्रम (PrometeoII 2014/036) के मंत्रालय से धन द्वारा समर्थित किया गया था. अंग्रेजी पाठ N. Macowan अंग्रेजी भाषा सेवा द्वारा संशोधित संस्करण

सभी प्रयोगात्मक इस अध्ययन में इस्तेमाल किया प्रक्रियाओं के अनुसार किया गया था निर्देश 2010/63/यूरोपीय संघ EEC पशु प्रयोगों के लिए और समीक्षा की और विश्वविद्यालय के जानवरों के साथ प्रयोग के लिए नैतिक समिति द...

हस्तांतरित भ्रूण9से पहले प्रलेखित जीवित जंम के मामले के बाद से, इस तकनीक और खरगोश प्रजातियों प्रजनन अध्ययन में महत्वपूर्ण बन गए हैं । इसके अलावा, हेरफेर, उत्पादन, cryopreservation, आदि शामिल भ्रूण अनुसंध?...

मानव बांझपन को दरकिनार या उच्च आनुवंशिक मूल्य के पशुधन के प्रसार में सुधार लाने और पशु आनुवंशिक संसाधनों के संरक्षण के उद्देश्य के साथ, तकनीकों का एक सेट सामूहिक रूप से सहायता प्रदान की प्रजनन प्रौद्योगिकियों, जैसे superovulation, में कहा विट्रो निषेचन, भ्रूण संस्कृति, या cryopreservation,1,2विकसित किए गए । वर्तमान में, हार्मोनल उपचार अंडाशय को उत्तेजित करने के लिए दिया जाता है और कोटरीय डिम्बग्रंथि के रोम की एक बड़ी संख्या का उत्पादन1। इन रोम से एकत्र oocytes परिपक्व हो सकता है, निषेचित, और विट्रो में विकसित जब तक वे या तो cryopreserved या सरोगेट माताओं3को हस्तांतरित कर रहे हैं । हालांकि, इन उपचारों के दौरान युग्मकों और युग्मज गैर-शरीरक्रियात्मक प्रक्रियाओं की एक शृंखला के संपर्क में आ जाते हैं जिससे इन स्थितियों में जीवित रहने के लिए भ्रूण अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है4,5. इस अनुकूलन जल्दी भ्रूण plasticity है, जो जीन अभिव्यक्ति और विकासात्मक प्रोग्रामिंग6में भ्रूण परिवर्तन की अनुमति देता है के कारण संभव है । हालांकि, इन संशोधनों वयस्कता जब तक भ्रूण के विकास के बाद के चरणों को प्रभावित कर सकते हैं, और अब यह व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते है कि तरीकों, समय, cryopreservation प्रक्रिया या संस्कृति की स्थिति भ्रूण7 भाग्य पर विभिंन परिणाम दिखाने , 8. इसलिए, कला के विशिष्ट प्रभाव को स्पष्ट करने के लिए, अच्छी तरह से विशेषता पशु मॉडल का उपयोग अपरिहार्य है ।
१८९०9में स्तनधारी भ्रूण के हस्तांतरण के परिणामस्वरूप पहले प्रलेखित जीवित जंम लिया । आज, एक किराए की महिला को भ्रूण हस्तांतरण (एट) के बाद भ्रूण विकास10चरणों पर preimplantation के दौरान कला प्रेरित प्रभाव का अध्ययन करने में एक महत्वपूर्ण कदम है । ET तकनीक प्रत्येक जानवर के आकार और संरचनात्मक संरचना पर निर्भर करते हैं । बड़े आकार के पशु मॉडलों के मामले में, यह ट्रांसर्विकल nonsurgical ET तकनीकों द्वारा एट प्रदर्शन करने के लिए संभव हो गया है, लेकिन छोटी-सी प्रजातियों में गर्भाशय ग्रीवा कैथेटेराइजेशन अधिक जटिल है और शल्य चिकित्सा तकनीकों अक्सर11इस्तेमाल कर रहे हैं । हालांकि, सर्जिकल एट खून बह रहा है कि प्रत्यारोपण और भ्रूण के विकास को ख़राब कर सकता है, के रूप में रक्त गर्भाशय लुमेन आक्रमण कर सकते हैं, भ्रूण मौत10के कारण कर सकते हैं । ट्रांसेविकल nonsurgical ET तकनीक अभी भी मनुष्यों में लागू कर रहे हैं, baboons, गोजातीय, सूअर और चूहों12,13,14,15,16,17, लेकिन सर्जिकल ईटीएस अभी भी बकरियों, भेड़ या अंय जानवरों के रूप में प्रजातियों में इस्तेमाल किया जा रहा है जो अतिरिक्त कठिनाइयों वर्तमान जैसे खरगोश के रूप में10,18,19,20,21, (दो स्वतंत्र सेवाओं) या चूहों (छोटे आकार) । फिर भी, शल्य चिकित्सा हस्तांतरण के तरीकों को धीरे से कम आक्रामक तरीकों से प्रतिस्थापित किया गया है करते हैं । एंडोस्कोपी भ्रूण हस्तांतरण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, उदाहरण के लिए, खरगोशों में, सूअर और छोटे जुगाली करने वाले18,19,20। इन ंयूनतम इनवेसिव एंडोस्कोपी तरीकों के लिए किया जा सकता है भ्रूण स्थानांतरण के माध्यम से तुंबिका में infundibulum, जो खरगोशों में आवश्यक है और कुछ प्रजातियों में लाभप्रद प्रभाव का प्रदर्शन20। यह अंडवाहिनी में आरंभिक भ्रूण की अवस्था के दौरान भ्रूण और माता के बीच सही संवाद के महत्व पर आधारित है । जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, भ्रूण remodeling है कि खरगोशों में अंडवाहिनी के माध्यम से भ्रूण प्रवास के दौरान जगह लेता है22,23प्रत्यारोपण करने में सक्षम भ्रूण को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है ।
ऐसे गोजातीय के रूप में बड़े आकार के पशु मॉडल, दिलचस्प है क्योंकि जैव रासायनिक और preimplantation सुविधाओं के मानव प्रजातियों में उन लोगों के समान है24। हालांकि, बड़े जानवर भी प्रारंभिक परीक्षणों में उपयोग करने के लिए महंगा कर रहे हैं, और कृंतकों एक आदर्श मॉडल माना जाता है (७६% मॉडल जीवों कृंतकों हैं) प्रयोगशाला अनुसंधान के लिए25. फिर भी, खरगोश मॉडल प्रजनन अध्ययन में कृंतकों पर कुछ लाभ प्रदान करता है, के रूप में कुछ प्रजनन जैविक मानव द्वारा प्रदर्शित प्रक्रियाओं चूहों में उन लोगों की तुलना में खरगोश में अधिक समान हैं । मानव और खरगोश एक समान कालानुक्रमिक भ्रूणीय जीनोम सक्रियण, कंदुकन और hemochorial अपरा संरचना प्रस्तुत करते हैं । इसके अलावा, खरगोशों का उपयोग करना यह उनके प्रेरित ovulation25के कारण निषेचन और गर्भावस्था के चरणों के सही समय पता करने के लिए संभव है । खरगोश जीवन चक्र कम कर रहे हैं, 31 दिनों में गर्भावधि को पूरा करने और के बारे में 4-5 महीने में यौवन तक पहुँचने; पशु अपने विनंर और गैर आक्रामक व्यवहार के कारण संभाल करने के लिए आसान है, और उसके रखरखाव बड़ा जानवरों की कीमत की तुलना में बहुत किफायती है । इसके अलावा, यह उल्लेख है कि खरगोशों दो स्वतंत्र cervixes11,25के साथ एक डुप्लेक्स गर्भाशय है महत्वपूर्ण है । यह एक तरजीही स्थिति में खरगोश स्थानों, विभिंन प्रयोगात्मक समूहों से भ्रूण के रूप में एक ही जानवर में स्थानांतरित किया जा सकता है, लेकिन एक अलग गर्भाशय सींग में । यह हमें दोनों प्रयोगात्मक प्रभाव की तुलना करने की अनुमति देता है, परिणाम से मातृ कारक को कम करने.
आज, nonsurgical ET तरीकों खरगोश में उपयोग में नहीं हैं । कुछ अध्ययनों से देर से 90 के दशक में बाहर किया एक ट्रांसेवियरल की तकनीक का उपयोग कर कम प्रसव ५.५% से २०.०%11,26 बनाम 50-65% के लिए शल्य चिकित्सा पद्धतियों द्वारा की दर के परिणामस्वरूप, उन के बीच में लेप्रोस्कोपी प्रक्रिया द्वारा वर्णित Besenfelder और Brem18। खरगोशों में इन nonsurgical ET तरीकों की कम सफलता दरों अंडवाहिनी में आवश्यक भ्रूण remodeling की कमी के साथ मेल खाती है, जो ट्रांसेविएट में बचा है । यहाँ, हम एक आदर्श जीव के रूप में खरगोशों का उपयोग कर एक प्रभावी ंयूनतम इनवेसिव लेप्रोस्कोपिक प्रक्रिया का वर्णन । इस तकनीक के बड़े जानवरों और मनुष्यों में आगे प्रजनन अनुसंधान के लिए एक मॉडल प्रदान करता है ।
क्योंकि खरगोश भ्रूण रोपण के लिए एक विशेष रूप से संकीर्ण समय खिड़की है, इस प्रजाति में एट एट में भ्रूण के विकास के चरण और प्राप्तकर्ता27के शारीरिक स्थिति के बीच synchrony के एक उच्च डिग्री की आवश्यकता है । कुछ मामलों में, एक प्रजनन उपचार है कि भ्रूण के विकास को धीमा कर देती है (जैसे कि विट्रो संस्कृति में ) या एंडोमेट्रियल ग्रहणशीलता (जैसे superovulation उपचार के रूप में) बदल, भ्रूण और मातृ गर्भाशय के बीच कोई synchrony है । इन स्थितियों नकारात्मक परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं । इन संदर्भों में प्रतिक्रिया करने के लिए, हम एक प्रभावी खरगोश मोरेला काचन प्रोटोकॉल का वर्णन है कि हमें थामने के लिए, संगठित करने और प्रयोगों को फिर से शुरू करने की अनुमति देता है । इस प्रक्रिया को प्रजनन अध्ययन के लिए logistically वांछनीय है और हमें भ्रूण के दीर्घकालिक भंडारण के लिए क्षमता देता है, उनके परिवहन की अनुमति । लेप्रोस्कोपिक प्रक्रिया और cryopreservation रणनीतियों कम जानवरों के साथ अध्ययन की बेहतर योजना की अनुमति देते हैं । इस प्रकार, हमारी कार्यप्रणाली स्वास्थ्यकर और आर्थिक लाभ प्रदान करती है और प्रायोगिक पशुओं के मानव उपचार में सुधार के कथित लक्ष्य के साथ पशु अनुसंधान के 3Rs (प्रतिस्थापन, कमी और परिष्करण) की अवधारणा के अनुरूप है । इस प्रकार, इन तरीकों के साथ, खरगोश के लिए एक आदर्श मॉडल जीव का गठन vivo में प्रजनन assays हैं ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine hydrochloride</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>626</td>
			<td>To be ordered by a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buserelin Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B3303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorhexidine digluconate soap</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>0265DCCJ500B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorhexidine digluconate solution</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>0265DCCA500B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td>Air Liquide</td>
			<td>99921</td>
			<td>CO2 N48.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>15385194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W387509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5773</td>
			<td>Without calcium chloride.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric razor</td>
			<td>Oster Golden A5</td>
			<td>078005-140-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoscope camera</td>
			<td>Optomic Spain S.A</td>
			<td>OP-714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoscope trocar with silicone leaflet valve</td>
			<td>Karl Storz Endoscopia Ib&#233;rica S.A.</td>
			<td>30114GK</td>
			<td>Lightweight trocar model.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>9993046</td>
			<td>To be ordered by a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epicraneal needle 23G</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>514056353</td>
			<td>Smaller needles can be also used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidural catheter</td>
			<td>Vygon corporate</td>
			<td>187.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidural needle</td>
			<td>Vygon corporate</td>
			<td>187.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>102466-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>5273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>184</td>
			<td>To be ordered by a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laparoscopy equipment</td>
			<td>Karl Storz Endoscopia Ib&#233;rica S.A.</td>
			<td>26003 AA</td>
			<td>Hopkins&#174; Laparoscope, 0&#186;-mm straight-viewing laparoscope, 30-cm length, 5-mm working channel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Optomic Spain S.A</td>
			<td>Fibrolux 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Air Liquide</td>
			<td>P1505XXX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical CO2 insufflator</td>
			<td>Karl Storz Endoscopia Ib&#233;rica S.A.</td>
			<td>Endoflator&#174;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>9993501</td>
			<td>To be ordered by a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 35-mm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS430165-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic dressing (Nobecutan)</td>
			<td>IBOR medica</td>
			<td>7140028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Straw 0.25 mL</td>
			<td>IMV - technologies</td>
			<td>6431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodide solution</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>02656DPYS500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-5880</td>
			<td>Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tube for insufflator</td>
			<td>Karl Storz Endoscopia Ib&#233;rica S.A.</td>
			<td>20400040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16F</td>
			<td>There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gloves</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>087GL010075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gown</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>12261501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile mask</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>058B15924B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straw Plug</td>
			<td>IMV - technologies</td>
			<td>6431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1-mL</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>11750425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 5-mL</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>11773313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urinary catheter</td>
			<td>IMV - technologies</td>
			<td>17722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>RAYPA</td>
			<td>BAE-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>525225</td>
			<td>To be ordered by a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbits</td>
			<td>Universitat Polit&#232;cnica de Val&#232;ncia</td>
			<td>Line A</td>
			<td>Other maternal lines, such as Line V or Line HP can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

minimally invasive embryo transfer and embryo vitrification at the optimal embryo stage in rabbit model

असिस्टेड प्रजनन तकनीक (आर्ट्स), जैसे कि इन विट्रो भ्रूण संस्कृति या भ्रूण cryopreservation, प्रसवकालीन और प्रसवोत्तर परिणामों के साथ प्राकृतिक विकास पैटर्न को प्रभावित करती है । कला अनुप्रयोगों के अहानिकर सुनिश्चित करने के लिए, पशु मॉडल में अध्ययन आवश्यक हैं । इसके अलावा, एक अंतिम कदम के रूप में, भ्रूण विकास अध्ययन उनकी क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए पूर्ण अवधि के स्वस्थ वंश का विकास करने की आवश्यकता है । यहां किसी भी कला संबंधी प्रयोग को करने के लिए गर्भाशय में भ्रूण का स्थानांतरण अपरिहार्य है ।
खरगोश एक सदी से अधिक के लिए स्तनधारी प्रजनन अध्ययन करने के लिए एक मॉडल जीव के रूप में इस्तेमाल किया गया है । मानव प्रजातियों और इसके छोटे आकार और कम रखरखाव लागत के लिए अपने जातिवृत् तीय निकटता के अलावा, यह प्रेरित ovulation के रूप में महत्वपूर्ण प्रजनन विशेषताओं, प्रारंभिक भ्रूण के विकास के एक कालक्रम मनुष्यों के समान है और एक छोटी गर्भावधि है कि हमें कला आवेदन के परिणामों को आसानी से अध्ययन करने की अनुमति देते हैं । इसके अलावा, कला (जैसे कम शुक्राणु इंजेक्शन, भ्रूण संस्कृति, या cryopreservation) के रूप में इस प्रजाति में उपयुक्त दक्षता के साथ लागू कर रहे हैं ।
इस अनुच्छेद में प्रस्तुत लेप्रोस्कोपिक भ्रूण स्थानांतरण तकनीक और cryopreservation प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम वर्णन 1) कैसे एक आसान, ंयूनतम इनवेसिव तकनीक के माध्यम से भ्रूण हस्तांतरण करने के लिए और 2) एक प्रभावी दीर्घकालिक भंडारण के लिए प्रोटोकॉल खरगोश की भ्रूण को समय लचीला साजो क्षमताओं और नमूना परिवहन करने की क्षमता प्रदान करने के लिए । विभिंन विकासात्मक चरणों में खरगोश के भ्रूण के स्थानांतरण के बाद प्राप्त परिणामों से पता चलता है कि मोरूला खरगोश भ्रूण वसूली और हस्तांतरण के लिए आदर्श चरण है । इस प्रकार, एक अंडवाहिनी भ्रूण हस्तांतरण की आवश्यकता है, शल्य चिकित्सा प्रक्रिया को उचित ठहराते । इसके अलावा, खरगोश morulae सफलतापूर्वक काचित और laparoscopically स्थानांतरित कर रहे हैं, वर्णित तकनीकों की प्रभावशीलता साबित ।

ताजा या विट्रिफाइड भ्रूण की ंयूनतम इनवेसिव लेप्रोस्कोपिक स्थानांतरण प्रजनन अध्ययन के लिए सबसे अच्छा मॉडल जानवरों के बीच खरगोश स्थानों । सारणी 1 में विभिन्न विकासात्मक अवस्थाओं मे...

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Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

न्यूनतम इनवेसिव भ्रूण हस्तांतरण और खरगोश मॉडल में इष्टतम भ्रूण के चरण में भ्रूण काचन

सहायक प्रजनन तकनीकों (आर्ट्स) परिणामों में सुधार और संबद्ध जोखिमों को कम करने के लिए लगातार मूल्यांकन में हैं । इस पांडुलिपि एक ंयूनतम इनवेसिव भ्रूण स्थानांतरण प्रक्रिया एक कुशल cryopreservation प्रोटोकॉल है कि मानव प्रजनन के एक आदर्श पशु मॉडल के रूप में खरगोशों के उपयोग की अनुमति देता है के साथ वर्णन करता है ।

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

इस प्रयोग का मुख्य लक्ष्य खरगोश में एक लेप्रोस्कोपिक भ्रूण हस्तांतरण प्रक्रिया को एक मॉडल के रूप में वर्णन करना है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह एक आसान, न्यूनतम आक्रामक तकनीक का उपयोग करके भ्रूण को स्थानांतरित करने का काम करता है। इसके अलावा, प्रभावी भ्रूण क्रायोप्रिजर्वेशन प्रोटोकॉल यहां भी खरगोश भ्रूण दीर्घकालिक भंडारण के लिए काम करता है, समय लचीला सैंय क्षमताओं और नमूना परिवहन करने की क्षमता प्रदान करते हैं ।जैसा कि हम जानते हैं, सहायता प्राप्त प्रजनन प्रौद्योगिकियों के परिणामों में सुधार और संबंधित जोखिमों को कम करने के लिए निरंतर मूल्यांकन में हैं । इसलिए, दोनों तकनीकों का उपयोग करके, खरगोश का उपयोग इस क्षेत्र में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने के लिए मानव प्रजनन के एक आदर्श पशु मॉडल के रूप में किया जा सकता है, जैसे कि संतानों पर इन विट्रो भ्रूण हेरफेर के प्रभाव। इन मामलों के दृश्य प्रदर्शन महत्वपूर्ण है के रूप में भ्रूण हस्तांतरण कदम सीखना मुश्किल है, क्योंकि यह बड़ी परिशुद्धता के साथ किया जाना चाहिए तकनीक की सफलता सुनिश्चित करने के लिए ।भ्रूण विट्रीफिकेशन के लिए, भ्रूण को दो मिनट के लिए समतुल्य समाधान में विसर्जित करें, इसके बाद विट्रीफिकेशन समाधान में एक मिनट इनक्यूबेशन। इनक्यूबेशन के अंत में, भ्रूण को 125 माइक्रोलीटर प्लास्टिक मिनी-स्ट्रॉ में लोड करें, और एक उपयुक्त एक मिलीलीटर माइक्रोडिस्पनर के साथ मिनी-स्ट्रॉ के बंद अंत को जोड़ा जाए। स्ट्रॉ लंबाई के एक तिहाई तक बेस मीडियम, इसके बाद एक छोटा सा हवा का बुलबुला होता है।इसके बाद, विट्रीफिकेशन समाधान के 40 माइक्रोलीटर में भ्रूण को एस्पिरेट करने के लिए एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करें, जिसके बाद एक और छोटे हवा बुलबुले और पर्याप्त आधार माध्यम के बाद पहले तरल अंश को मिनी-स्ट्रॉ के कपास तक ले जाया जा सके। फिर एक भूसे प्लग के साथ मिनी-स्ट्रॉ के खुले अंत को बंद करें, मिनी-स्ट्रॉ को सीधे तरल नाइट्रोजन में डुबकी लगाने के लिए विट्रीफिकेशन प्राप्त करें, और एक तरल नाइट्रोजन देवर में मिनी-स्ट्रॉ स्टोर करें। एक हस्तांतरण के लिए भ्रूण गल करने के लिए, 20 से 30 सेकंड के लिए तरल नाइट्रोजन वाष्प से मिनी भूसे क्षैतिज 10 सेंटीमीटर जगह है ।जब क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया मिनी-स्ट्रॉ के अंदर शुरू होती है, तो मिनी-स्ट्रॉ को 10 से 15 सेकंड के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में विसर्जित कर दें। तुरंत मिनी-स्ट्रॉ और कॉटन प्लग को हटा दें और मिनी-स्ट्रॉ सामग्री को 0.33 मोलर सुक्रोज समाधान के साथ पूरक 25 डिग्री सेल्सियस बेस मीडियम वाली प्लेट में निष्कासित करने के लिए एक युग्मित माइक्रोडिस्पेंसर का उपयोग करें, जिसमें भ्रूण पांच मिनट के दौरान रहना चाहिए। फिर भ्रूण को एक और पांच मिनट के लिए ताजा आधार माध्यम की एक थाली में स्थानांतरित इनक्यूबेशन ।भ्रूण की उम्र के रूप में कई दिनों पहले स्थानांतरित करने के लिए, उपलब्ध यौन परिपक्व 4.5 महीने पुरानी मादा खरगोशों के वल्वास की टर्गिडिटी और रंग का निरीक्षण करें, और शरीर के वजन की परवाह किए बिना एक माइक्रोग्राम के एक इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के साथ ग्रहणशील जानवरों में ओव्यूलेशन को प्रेरित करें। स्थानांतरण के दिन, एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत ३७ डिग्री सेल्सियस बेस माध्यम में ताजा या गल भ्रूण कुल्ला, और एक मिलीलीटर सिरिंज के लिए एक उचित रूप से विन्यास 17 गेज एपीड्यूरल कैथेटर देते हैं । कैथेटर में आधार माध्यम के एक सेंटीमीटर aspirate, एक छोटे से हवा बुलबुला के बाद ।फिर पांच से सात भ्रूण और आधार माध्यम के 10 माइक्रोलीटर, एक और छोटे हवा बुलबुला के बाद, और आधार माध्यम के एक अंतिम एक सेंटीमीटर आकांक्षी । एक बार भ्रूण लोड किया गया है, एक वार्मिंग चरण पर एक पिंजरे में एनेस्थेटाइज्ड प्राप्तकर्ता खरगोश जगह है, और जानवर की आंखों के लिए मरहम लागू होते हैं । पेडल पलटा के लिए प्रतिक्रिया की कमी की पुष्टि करने के बाद, वेंट्रल पेट से फर दाढ़ी, क्लोरहेक्सीडीन ग्लूकोनेट साबुन के साथ सर्जिकल क्षेत्र को साफ करें, और किसी भी शेष बालों को हटा दें।सर्जिकल क्षेत्र के लिए एक छेद के साथ एक बाँझ कपड़ा के साथ क्षेत्र को कवर करें, और पेट की गुहा में एक एंडोस्कोपिक ट्रोनिक पांच सेंटीमीटर डालें, जाइफोइड प्रक्रिया में दो सेंटीमीटर कौडल, और पेरिटोनियल गुहा को फुलाने के लिए यांत्रिक इंफ्लेटर को विनियमित करने वाले दबाव का उपयोग करें। एंडोस्कोपिक ट्रोमाकार के माध्यम से एंडोस्कोप कैमरा डालें, और इंफंडीबुलम से दो से तीन सेंटीमीटर, इंगिनल क्षेत्र में 17 गेज एपिड्यूरल सुई डालें। पेट में एपिड्यूरल सुई के माध्यम से लोडेड कैथेटर डालें, और एम्पुला में इनफंडिबुलम के माध्यम से एपिड्यूरल कैथेटर के एक से दो सेंटीमीटर डालें।भ्रूण को अंडाशय में छोड़ने के लिए कैथेटर प्लंजर को धीरे से दबाना। दोनों हवा बुलबुले कैथेटर से बाहर निकलना चाहिए। भ्रूण जारी किए जाने के ठीक बाद कैथेटर निकालें, और भ्रूण की अनुपस्थिति की पुष्टि करने के लिए शेष माध्यम को एस्पिरेट करें और जारी करें।भ्रूण के सफल हस्तांतरण की पुष्टि करने के बाद, एपीड्यूरल सुई और एंडोस्कोप कैमरे को हटा दें, और एंडोस्कोपिक ट्रोनिक के माध्यम से पेट कार्बन डाइऑक्साइड को छोड़ दें। क्लोरहेक्सीडीन समाधान के साथ ट्रोनिक चीरा साफ करें, और एक माइक्रोनाइज्ड एल्यूमीनियम और एक प्लास्टिक ड्रेसिंग के साथ घाव को बंद करें। फिर उचित एंटीबायोटिक दवाओं और एनाल्जेसिक के साथ जानवर का इलाज करें, और पूर्ण वसूली तक जानवर की निगरानी करें।न्यूनतम आक्रामक लेप्रोस्कोपिक भ्रूण हस्तांतरण प्रजनन अध्ययन के लिए सबसे अच्छा पशु मॉडल के बीच खरगोश स्थानों, स्थानांतरित ताजा भ्रूण के एक उच्च प्रतिशत के साथ एक पिल्ला में जिसके परिणामस्वरूप । विशेष रूप से, उच्च मूल्यों को प्राप्त किया जाता है जब ताजा भ्रूण हस्तांतरण या तो जल्दी या कॉम्पैक्ट morulae चरण में भ्रूण के साथ किया जाता है । इसी तरह के परिणाम खरगोशों में ताजा इन-विट्रीफाइड भ्रूण को स्थानांतरित करने के लिए इस तकनीक की प्रभावकारिता और विश्वसनीयता की पुष्टि करते हुए, विशेष रूप से कॉम्पैक्ट मोरुले के साथ, शुरुआती और कॉम्पैक्ट विट्रीफाइड खरगोश मोरुला हस्तांतरण के बाद देखे जाते हैं।इस प्रक्रिया के बाद, सशर्त सहायक प्रजनन प्रौद्योगिकियों जैसे अन्य तरीकों को अतिरिक्त प्रश्नों का उत्तर देने के लिए किया जा सकता है जैसे कि जीवन में बाद में घनत्व के अलावा एनाल्जेसिक प्रभाव में कैसे हो सकता है। हाल के विकास के बाद, यह तकनीक प्रजनन के क्षेत्र में वैज्ञानिकों के लिए खरगोश और मनुष्यों के बीच करीबी फिलोजेनेटिक दूरी के आधार पर मनुष्यों में इस प्रभाव का पता लगाने का मार्ग प्रशस्त करती है। इस प्रकार, यह तकनीक मानव नैदानिक चिकित्सा के साथ-साथ अन्य स्तनपायी प्रजातियों में आसानी से स्थानांतरित परिणाम प्रदान कर सकती है।यह न भूलें कि हमारी विधि प्रायोगिक जानवरों के मानव उपचार में सुधार के लक्ष्य का इरादा करके पशु कल्याण, प्रतिस्थापन, कमी और शोधन के तीन आर की अवधारणा के अनुरूप कुछ स्वच्छ और आर्थिक लाभ प्रदान करती है।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Zebrafish भ्रूण में Microbead आरोपण

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

लिविंग zebrafish भ्रूण में subcellular संरचनाओं इमेजिंग

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

एक लाइव zebrafish भ्रूण में mitotic डिवीजन और गतिशीलता अवलोकन

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

भ्रूण Microinjection और electroporation कोरडेट में<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

ईरीथ्रोमाइलॉयड प्रजनकों की पहचान और उनकी गर्भ में फ्लो साइटोमैट्री द्वारा माउस भ्रूण

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Zebrafish भ्रूण में स्थिर, गतिशील और नवजात Microtubules का विश्लेषण करने के लिए Immunolabeling का उपयोग

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Zebrafish भ्रूण जर्दी सेल में AFM और Microrheology

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout (Oncorhynchus Mykiss) and Brown Trout (Salmo Trutta Morpha fario)

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout Oncorhynchus Mykiss and Brown Trout Salmo Trutta Morpha fario

दो Salmonid मछली, इंद्रधनुष ट्राउट (Oncorhynchus Mykiss) और ब्राउन ट्राउट (Salmo Trutta Morpha fario) में अलग करना हवा की प्रभावशीलता

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Zebrafish भ्रूण में सेल Photoconversion के द्वारा निंनलिखित Endocardial ऊतक आंदोलनों

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Microinjection-आधारित प्रणाली के लिए Vivo में भ्रूण Cardiomyocytes के प्रत्यारोपण में एवियन भ्रूण

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...