Name: minimally invasive embryo transfer and embryo vitrification at the optimal embryo stage in rabbit model
Uploaded: 2019-05-16T12:30:00
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この作業は、スペインの経済産業省 (AGL2017 ・ 85162) と Generalitat バレンシアナ研究プログラム (PrometeoII 2014/036) の資金によって支えられました。N. Macowan 英語サービスによる英語テキストバージョンの改訂

本研究で使用されたすべての実験手順は、動物実験のための指令 2010/63/EU EEC に従って行われ、ウニベルシタット Politècnica ・デ・バレンシアの動物との実験のための倫理的委員会によってレビューと承認を受けました。スペイン (研究コード: 2015/VSC/エンドウ/00170).XGD、FMJ、MPVC、JSV はバレンシア政府が発行した承認証明書を持って、動物実験を行います。XGD は実験の間に動物の福利および心?...

移入された胚9からの最初の文書化した生きた出生例以来、この技術およびウサギ種は生殖研究において決定的になっている。また、操作、生産、凍結保存などを含む胚研究の研究は、最後のステップとして、健康な完全期の子孫を生成する胚容量の評価を必要とします。従って、胚移植技術は13、28に不可欠である。長年に...

ヒトの不妊症を迂回すること、または遺伝価値の高い家畜の繁殖を改善し、動物の遺伝資源を保全することを目的として、superovulation のような補助生殖技術と総称される一連の技術体外受精、胚培養、または凍結保存、1、2を開発した。現在、卵巣を刺激し、多数の腹腔卵巣卵胞を生成するホルモン治療が与えられています1.これらの卵胞から採取した卵母細胞は、成熟し、受精し、そして、それらが凍結保存されるか、または代理母3に移されるまで、インビトロで発達させることができる。しかし、これらの治療の間、配偶子および zygotes は、これらの条件4、5で生き残るために胚の適応を必要とする可能性のある一連の非生理的プロセスに暴露される。この適応は、初期胚の可塑性によって可能であり、これは胚の遺伝子発現および発達的プログラミング6の変化を可能にする。しかし、これらの修飾は成人するまでの胚発生のその後の段階に影響を及ぼし、現在広く受け入れられている方法、タイミング、凍結保存手順または培養条件は、胚の運命7に異なる結果を示す,8.したがって、芸術の具体的な誘発効果を解明するためには、よく特徴付けられた動物モデルの使用は不可避である。
哺乳動物胚の移動によってもたらされる最初の記録された生年月日は 18909において起こった。今日、サロゲートメスへの胚移入 (ET) は、その後の胚発達段階10での着床前中の芸術誘発効果を研究する上で極めて重要なステップである。ET の技法は、各動物のサイズおよび解剖学的構造に依存する。大型動物モデルの場合、あおむけ非外科的 ET 法によって ET を行うことが可能であったが、より小型の種では子宮頸部のカテーテル法がより複雑であり、外科的な技術が頻繁に使用されている11.しかし、外科的 ET は、血液が子宮内腔に浸潤して、移植および胚発生を損なう可能性のある出血を引き起こし、胚死10を引き起こす可能性がある。あおむけ非外科的 ET の技術は、依然としてヒト、ヒヒ、ウシ、ブタおよびマウス12、13、14、15、16、17において適用されるが、外科ETs は依然としてヤギ、ヒツジ、またはウサギなどの追加の困難10、18、19、20、21を提示する他の動物などの種で使用されている (2独立 cervices) またはマウス (小サイズ)。それにもかかわらず、外科的伝達方法は、より少ない侵襲的方法で徐々に置き換えられている傾向がある。内視鏡は、例えばウサギ、ブタおよび小さな反芻動物18、19、20において胚を移送するために用いられた。これらの低侵襲性内視鏡検査法は、ウサギに不可欠であり、いくつかの種20で有益な効果を実証している infundibulum を介して合流に胚を移すために使用することができる。これは、卵管の初期胚段階における胚と母親の間の正しい対話の重要性に基づいている。前述したように、卵管を介した胚遊走の間にウサギで起こる胚リモデリングは、22,23を移植することができる胚を達成するために不可欠である。
ウシのような大型動物モデルは、生化学的および着床前の特徴がヒト種24のものと類似しているため興味深い。しかし、大規模な動物は予備試験で使用するには高価すぎる、とげっ歯類は、実験室の研究25のための理想的なモデル (76% モデル生物がげっ歯類である) と考えられています。それにもかかわらず、ウサギモデルは、ヒトによって示されるいくつかの生殖生物学的プロセスがマウスのものよりもウサギの方が類似しているので、生殖研究においてげっ歯類よりいくつかの利点を提供するヒトおよびウサギは、同様の経時的な胚ゲノム活性化、gastrulation および hemochorial 胎盤構造を提示する。加えて、ウサギを用いて、それらの誘発排卵25による受精および妊娠段階の正確なタイミングを知ることができる。ウサギのライフサイクルは短く、31日で妊娠を完了し、約4-5 ヶ月で思春期に達する。動物は、その従順で非攻撃的な行動のために扱いやすいです、そして、その維持は、より大きな動物の費用に比べて非常に経済的です。さらに、ウサギは2つの独立した cervixes11,25を有する二重子宮を有することを言及することが重要である。これにより、異なる実験群からの胚は同じ動物に、しかし別の子宮の角に移すことができるので、ウサギは優先的な位置に置かれる。これにより、両方の実験効果を比較し、母体因子を結果から減らすことができます。
今日では、非外科的 ET 法はウサギでは使用されていません。あおむけ ET 技術を用いて90年代後半に実施されたいくつかの研究は、外科的方法によって 5.5% 〜 20.0%11、26対 50-65% までの低い送達率をもたらしたが、それらの中でも記載の腹腔鏡検査手順Besenfelder と Brem18.ウサギにおけるこれらの非外科的 ET 法の低い成功率は、あおむけ ET で回避される卵管において必要な胚リモデリングの欠如と一致する。ここでは、モデル生物としてウサギを用いた効果的な低侵襲性腹腔鏡 ET 手順について述べる。この技術は、大型動物およびヒトにおけるさらなる生殖研究のためのモデルを提供する。
ウサギは胚移植のために特に狭い時間枠を有するので、この種での ET は、胚の発生段階とレシピエント27の生理的状態との間で高い程度の同期性を必要とする。場合によっては、胚の発育を遅らせ (体外培養など)、または子宮内膜の受容性を変化させる生殖治療 (superovulation 治療など) の後に、胚と母体子宮との間の同調性はない。このような状況は、結果に悪影響を及ぼします。これらの文脈で応答するために、我々は、実験を一時停止し、組織化し、再開することを可能にする効果的なウサギ桑実胚ガラス化プロトコルを説明する。このプロセスは生殖研究のためにロジスティックに望ましい、私達に胚の長期貯蔵のための容量を与え、輸送を許可する。腹腔鏡処置および凍結保存戦略は、より少ない動物での研究のより良い計画を可能にします.このように、我々の方法論は、衛生的で経済的な優位性を提供し、動物研究の 3R (置換、還元、精製) の概念に準拠し、実験動物の人間の治療を改善するという目標を掲げています。したがって、これらの方法を用いて、ウサギはインビボ生殖アッセイのための理想的なモデル生物を構成する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine hydrochloride</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>626</td>
			<td>To be ordered by a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buserelin Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B3303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorhexidine digluconate soap</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>0265DCCJ500B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorhexidine digluconate solution</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>0265DCCA500B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td>Air Liquide</td>
			<td>99921</td>
			<td>CO2 N48.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>15385194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W387509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5773</td>
			<td>Without calcium chloride.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric razor</td>
			<td>Oster Golden A5</td>
			<td>078005-140-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoscope camera</td>
			<td>Optomic Spain S.A</td>
			<td>OP-714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoscope trocar with silicone leaflet valve</td>
			<td>Karl Storz Endoscopia Ib&#233;rica S.A.</td>
			<td>30114GK</td>
			<td>Lightweight trocar model.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>9993046</td>
			<td>To be ordered by a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epicraneal needle 23G</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>514056353</td>
			<td>Smaller needles can be also used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidural catheter</td>
			<td>Vygon corporate</td>
			<td>187.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidural needle</td>
			<td>Vygon corporate</td>
			<td>187.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>102466-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>5273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>184</td>
			<td>To be ordered by a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laparoscopy equipment</td>
			<td>Karl Storz Endoscopia Ib&#233;rica S.A.</td>
			<td>26003 AA</td>
			<td>Hopkins&#174; Laparoscope, 0&#186;-mm straight-viewing laparoscope, 30-cm length, 5-mm working channel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Optomic Spain S.A</td>
			<td>Fibrolux 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Air Liquide</td>
			<td>P1505XXX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical CO2 insufflator</td>
			<td>Karl Storz Endoscopia Ib&#233;rica S.A.</td>
			<td>Endoflator&#174;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>9993501</td>
			<td>To be ordered by a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 35-mm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS430165-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic dressing (Nobecutan)</td>
			<td>IBOR medica</td>
			<td>7140028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Straw 0.25 mL</td>
			<td>IMV - technologies</td>
			<td>6431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodide solution</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>02656DPYS500S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-5880</td>
			<td>Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tube for insufflator</td>
			<td>Karl Storz Endoscopia Ib&#233;rica S.A.</td>
			<td>20400040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16F</td>
			<td>There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gloves</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>087GL010075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gown</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>12261501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile mask</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>058B15924B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straw Plug</td>
			<td>IMV - technologies</td>
			<td>6431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1-mL</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>11750425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 5-mL</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>11773313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urinary catheter</td>
			<td>IMV - technologies</td>
			<td>17722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>RAYPA</td>
			<td>BAE-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Alvet Escart&#237;</td>
			<td>525225</td>
			<td>To be ordered by a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbits</td>
			<td>Universitat Polit&#232;cnica de Val&#232;ncia</td>
			<td>Line A</td>
			<td>Other maternal lines, such as Line V or Line HP can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

minimally invasive embryo transfer and embryo vitrification at the optimal embryo stage in rabbit model

胚培養または胚凍結保存などの補助生殖技術は、周産期および出生後の結果によって自然発症パターンに影響を及ぼす。アートアプリケーションの安全性を確実にするためには、動物モデルに関する研究が必要である。さらに、胚発生研究では、最後の段階として、健常な子孫を育てる能力を評価する必要があります。ここで、子宮への胚の移植は、あらゆる芸術関連実験を行うために不可欠である。
ウサギは、1世紀以上にわたって哺乳類の生殖を研究するモデル生物として使用されてきた。人間の種とその小さなサイズと低い維持費への系統の近接に加えて、誘発された排卵、ヒトに類似した初期の胚発生の年表、短い妊娠のような重要な生殖特性を有するそれは私たちが簡単に芸術のアプリケーションの結果を研究することができます。さらに、芸術 (細胞質内精子注入、胚培養、または凍結保存など) は、この種で適切な効率で適用される。
この記事で提示された腹腔鏡胚移植技術と凍結保存プロトコルを使用して、1) 簡単に、最小限に侵略的な技術を通して胚を移す方法および 2) ウサギの長期保存のための効果的なプロトコール時間の柔軟な物流能力とサンプルを輸送する能力を提供する胚。異なる発達段階でウサギの胚を移した後に得られた結果は、桑実胚がウサギの胚の回復および伝達にとって理想的な段階であることを示している。したがって、oviductal 胚移植が必要であり、外科的処置を正当化する。さらに、ウサギ morulae は、正常にガラス化および laparoscopically 転写され、記載した技術の有効性を証明する。

新鮮なまたはガラス化された胚の低侵襲的な腹腔鏡下移動は、生殖研究のための最高のモデル動物の中にウサギを配置します。表 1は、転移した胚の異なる発達段階 (図 4) における新鮮な ET の結果を示す。出生時の生存率 (pup に起因する胚の割合) は、この論文で説明されている腹腔鏡技術の有効性を証明した。より高い値は、ET が...

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Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

ウサギモデルにおける最適胚期における低侵襲胚移植と胚ガラス化

補助生殖技術 (ARTs) は、結果を改善し、関連するリスクを軽減するために継続的に評価されています。本稿では、ヒト生殖の理想的な動物モデルとしてのウサギの使用を可能にする効率的な凍結保存プロトコルを用いた低侵襲胚移植手順について述べる。

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

この実験の主な目的は、ウサギにおける腹腔鏡下胚移植手順をモデルとして記述することです。この技術の主な利点は、これは簡単で低侵襲の技術を使用して胚を移すために働くということです。さらに、ここで説明する有効な胚凍結保存プロトコルは、ウサギの胚を長期保存するためにも働き、時間の柔軟性のある物流能力およびサンプルを輸送する能力を提供する。私たちが知っているように、生殖補助技術は、結果を改善し、関連するリスクを軽減するために継続的な評価を行っています。したがって、両方の技術を用いて、ウサギは、ヒト生殖の理想的な動物モデルとして、子孫に対するインビトロ胚操作の効果など、この分野の重要な質問に答えるために使用することができる。これらの問題の視覚的なデモンストレーションは、胚の移動ステップが学ぶのが難しいため、技術の成功を確実にするために非常に正確に行わなければならないので、重要です。胚性ガラス化の場合、胚を平衡溶液に2分間浸漬し、続いてガラス化溶液に1分間インキュベートする。インキュベーションの終わりに、胚を125マイクロリットルのプラスチックミニストローにロードし、ミニストローの閉じた端を適切な1ミリリットルのマイクロディスペンサーと組み合わせる。吸気塩基剤は、ストロー長の3分の1まで培地を吸引し、続いて小さな気泡を続ける。次に、40マイクロリットルのガラス化溶液で胚を吸引するために実体顕微鏡を使用し、続いて別の小さな気泡とミニストローの綿まで最初の液体分画を移動させるのに十分なベース媒体を使用する。次に、ストロープラグでミニストローの開いた端を閉じ、ミニストローを液体窒素に直接突っ込んでガラス化を達成し、ミニストローを液体窒素デュワーに保管します。移動のために胚を解凍するには、液体窒素蒸気から10センチメートルのミニストローを20〜30秒間水平に置きます。ミニストローの中で結晶化プロセスが始まったら、ミニストローを25°Cの水浴に10〜15秒間浸します。すぐにミニストローと綿のプラグを取り外し、結合したマイクロディスペンサーを使用して、0.33モルスクロース溶液を添加した25度の摂氏ベース培地を含むプレートにミニストローの内容物を排出し、胚は5分間保持する必要があります。その後、胚を新鮮なベース培地のプレートに移し、さらに5分間インキュベーションを行います。移される胚の年齢と同じくらい数日前に、利用可能な性的に成熟した4.5ヶ月の雌ウサギの外陰部の濁度と色を観察し、体重に関係なく1マイクログラムのブセレリン酢酸の単一の筋肉内注射で受容動物に排卵を誘発する。転写日に、新鮮なまたは解凍した胚を37°の塩基性培地で実体顕微鏡ですすい、適切に構成された17ゲージ硬膜外カテーテルを1ミリリットルのシリンジに取り付ける。1センチのベース培地をカテーテルに吸引し、続いて小さな気泡を吸引する。次いで、5~7個の胚と10マイクロリットルのベース培地を吸引し、続いて別の小さな気泡を、最後の1センチメートルのベース培地を吸引する。胚がロードされたら、麻酔を受けたウサギを温暖化段階のケージに入れ、動物の目に軟膏を塗布する。ペダル反射に対する応答の欠如を確認した後、腹側腹部から毛皮を剃り、クロルヘキシジングルコン酸石鹸で外科領域をきれいにし、残りの毛髪を取り除きます。外科領域のための穴で無菌のカーテンで領域をカバーし、腹腔に5センチメートル、zyphoidプロセスに2センチメートル尾を張って1つの内視鏡トロカールを挿入し、腹膜腔を膨らませるために機械的インスフレーターを調節する圧力を使用する。内視鏡カメラを内視鏡トロカールに挿入し、17ゲージ硬膜外針をインギナル領域(インファンディブラムから2〜3センチメートル)に挿入します。装填されたカテーテルを硬膜外の針を通して腹部に挿入し、円形の内隔を通して硬膜外カテーテルの1〜2センチメートルを挿入する。カテーテルプランジャーを軽く押し落とし、胚を卵管に放出する。両方の気泡はカテーテルから出なければなりません。胚が放出された直後にカテーテルを取り出し、残りの培地を吸引して放出して胚の不在を確認する。胚の転写が成功したことを確認した後、硬膜外針と内視鏡カメラを取り外し、内視鏡トロカールを通して腹部二酸化炭素を放出する。クロルヘキシジン溶液でトロカール切開部を洗浄し、ミクロニシズアルミニウムとプラスチックドレッシングで創傷を閉じます。次に、適切な抗生物質と鎮痛薬で動物を治療し、完全に回復するまで動物を監視します。低侵襲腹腔鏡下胚移植は、生殖研究のための最良の動物モデルの中にウサギを配置し、繁殖した新鮮な胚の割合が高く、子犬をもたらす。特に、早期またはコンパクトなmorulaeステージのいずれかで胚で新鮮な胚移植が行われると、より高い値が達成される。同様の結果は、早期および圧縮されたガラス化されたウサギのモルラ転移後、特にコンパクトなmorulaeで観察され、ウサギの新鮮なガラス化胚を移すこの技術の有効性および信頼性を確認する。この手順に従って、条件付き生殖生殖技術のような他の方法は、密度の添加が人生の後半に鎮痛効果を引き起こす可能性があるような追加の質問に答えるために行うことができます。最近の開発の後、この技術は、ウサギと人間の間の密接な系統的距離に基づいて、生殖分野の科学者がこの効果を探求する道を開きます。したがって、この技術は、他の哺乳動物種において同様にヒト臨床医学に容易に移すことができる結果を提供することができる。実験動物の人間の治療を改善するという目標を意図して、私たちの方法は、動物の福祉、交換、削減、改良の3つのRの概念に準拠するいくつかの衛生的および経済的利点を提供することを忘れないでください。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

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リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

ライブゼブラフィッシュ胚における有糸分裂とダイナミクスを観察します

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

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脊索動物における胚のマイクロインジェクションやエレクトロポレーション<em&gt;カタユウレイボヤ</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

フローサイトメトリーによるマウス胚における赤血球系前駆細胞およびその子孫の同定

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

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ゼブラフィッシュ胚の安定した、動的、および初期の微小管を分析する反応の利用

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

原子間力顕微鏡とゼブラフィッシュ胚の卵黄細胞のレオロジー

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Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

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Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...