Name: identification and isolation of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from mouse bone marrow
Uploaded: 2018-07-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow at JoVE.com

تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام أموال من مجلس المحافظين التجدد الطب معهد في مركز سيدرز-سيناء الطبي (إلى [هسغ])، المهن في زمالة علم المناعة من "الرابطة الأمريكية للمناعة" (بأي و [هسغ])، وجائزة الباحث من الجمعية الأمريكية لأمراض الدم (بأي). ونشكر الأساسية التدفق الخلوي في مركز سيدرز-سيناي الطبي للمساعدة في فرز نظام مراقبة الأصول الميدانية.

وافق جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من مركز سيدرز-سيناء الطبي.
1-عزل نخاع العظام الماوس وإعداد تعليق خلية مفردة
<ol><li>Euthanize الماوس وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.</li>
	<li>ضع الماوس يوثانيزيد على ظهرها والرش مع 70% إيثانول (EtOH). جعل شق...

<ol>
	<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRF8+acts+in+lineage-committed+rather+than+oligopotent+progenitors+to+control+neutrophil+vs+monocyte+production.">IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production.</a> Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).</li><li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX3CR1++CD115++CD135++common+macrophage/DC+precursors+and+the+role+of+CX3CR1+in+their+response+to+inflammation.">CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).</li><li>Fogg, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+bone+marrow+progenitor+specific+for+macrophages+and+dendritic+cells.">A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells.</a> Science. 311 (5757), 83-87 (2006).</li><li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clonogenic+common+Flt3+M-CSFR++plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow.">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).</li><li>Hettinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+monocytes+and+macrophages+in+a+committed+progenitor.">Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor.</a> Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte-monocyte+progenitors+and+monocyte-dendritic+cell+progenitors+independently+produce+functionally+distinct+monocytes.">Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes.</a> Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).</li><li>Olsson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+mixed-lineage+states+leading+to+a+binary+cell+fate+choice.">Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice.</a> Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).</li><li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation.">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+regulatory+factor+8+and+the+regulation+of+neutrophil,+monocyte,+and+dendritic+cell+production.">Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production.</a> Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).</li><li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors.">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).</li></ol>

وقد يسمان النابضة استراتيجية ل تحديد السلف النقوي الماوس1 المعيار الذهبي للمناعة وهيماتولوجيستس لما يقرب من 20 عاماً، ولكن من الواضح الآن أن البوابات "كيوتو" و "جي أم بي" متباينة للغاية وأكثر دقة هناك حاجة إلى استراتيجيات النابضة. يسمح البروتوكول التي وصفناها هنا تحديد أوليجوب...

وحيدات، العَدلات، والخلايا الجذعية (DCs) هي النقوي الخلايا التي تنشأ من فروعه المكونة للدم في نخاع العظام، أساسا بعملية تسمى ميلوبويسيس. موروث النقوي المشتركة (CMPs) لديها القدرة على إنتاج خلايا النقوي، فضلا عن ميجاكاريوسيتيس والكريات الحمراء، ولكن الخلايا اللمفاوية لا. موروث المحببات الوحيدات (غمبس)، التي هي مستمدة من CMPs، تنتج المحببة ووحيدات، ولكن قد فقدت ميجاكاريوسيتي وكرات الدم الحمراء المحتملة. وحيدات والكلاسيكية وأيضا بلاسماسيتويد DCs (المؤلفان/pDCs) ويعتقد أن تنشأ من فروعه المشتركة المعروفة باسم المتكفل الوحيدات-DC (مدبس)، التي يتم إنتاجها بواسطة CMPs. تدريجيا في نهاية المطاف يؤدي تقييد إمكانات النسب النسب التي ارتكبت فروعه: المتكفل المحببات والوحيدات المتكفل والخلايا الجذعية موروث (الشكل 1).
ويسمان والزملاء أفادت أن CMPs موجودة في لين– ج-كيت+ هيئة الأوراق المالية-1– CD34 (LKS–)+ FcγRلو جزء بسيط من الماوس نخاع العظام، بينما ترد غمبس في CD34 LKS– + FcγR مرحبا جزء1. ومع ذلك، هذه الكسور "كيوتو" و "جي أم بي" متباينة للغاية. على سبيل المثال، كسر "GMP" يحتوي أيضا على موروث النسب التي ارتكبت المحببات والوحيدات موروث1،2. مدبس أفيد كل على حدة بأن CX3CR1+ Flt3+ CD115+ فروعه أيضا تعبر عن CD34 و FcγR3،4. مدبس تثير cDC/الحزب الديمقراطي المسيحي-إنتاج مشترك DC موروث (توضع)، التي أبلغت للتعبير عن مستويات أدنى من ج-كيت (CD117) ولم يتم تضمينها في جزء LKS– 5.
وكان يفترض مسبقاً أن وحيدات تنشأ عن طريق مسار واحد (CMP-GMP-الديمقراطي-الوحيدات). يتفق مع هذا موروث النموذج، وارتكبت الوحيدات التي تنتجها غمبس (المسمى المتكفل الوحيدات، أعضاء البرلمان)2 ومدبس (المسمى شيوعاً الوحيدات موروث، كموبس)6 يبدو أن نفس الخلايا على أساس التعبير علامة السطحية المشتركة . ومع ذلك، نحن مؤخرا أظهرت أن وحيدات تصدر بشكل مستقل عن غمبس ومدبس، وكانت قادرة على التمييز بين أعضاء البرلمان، وكموبس ب تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة7.
مؤخرا قمنا بتعديل استراتيجية "GMP" النابضة ويسمان "كيوتو" لتحديد اﻷفخاذ 6 C57BL/6J الماوس نخاع العظام التي تحتوي على أوليجوبوتينت مختلفة ومجموعات فرعية السلف النقوي النسب التي ارتكبت. نحن ذكرت أولاً أن تلطيخ ل Ly6C و CD115 يسمح بعزل غمبس أوليجوبوتينت، فضلا عن فروعه المحببات (GPs) وفروعه الوحيدات (MPs وكموبس، ونحن حاليا غير قادر على فصل) من "جي أم بي" جزء2 (LKS - CD34+ FcγRمرحبا البوابة؛ الشكل 1). أظهرنا في وقت لاحق أن مدبس هي في الأغلب في جزء "كيوتو" (CD34 LKS– + FcγRلو البوابة)، الذي يحتوي أيضا على Flt3+ CD115لو و Flt3– المجموعات الفرعية7 (الرقم 1 ). + CD115لو كسر CMP-Flt3 غلة غمبس ومدبس عند نقل التبني. مجموعة فرعية CMP-Flt3– يحتوي على فروعه التي تظهر أن تكون وسيطة بين غمبس ولو خلايا CMP-Flt3+ CD115. على عكس مدبس، تمتلك CMP-Flt3+ CD115لو والكسور CMP-Flt3– أيضا ميجاكاريوسيتي وكرات الدم الحمراء المحتملة.
من المهم أن نلاحظ، مع ذلك، أنه من غير الواضح حاليا ما إذا كان يتضمن كسور "كيوتو" فروعه التي هي حقاً أوليجوبوتينت (مثل الخلايا الفردية داخل CMP-Flt3+ CD115لو كسر التي تمتلك العَدلات، الوحيدات، العاصمة، ميجاكاريوسيتي، وكرات الدم الحمراء المحتملة)، أو بدلاً من ذلك، تضم خليطا فروعه مع إمكانات النسب أكثر تقييداً. وكشفت مستعمرة تشكيل فحوصات (الثقافات methylcellulose) الخلايا مع المحببات (العَدلات) وكرات الدم الحمراء والوحيدات و megakaryocyte المحتملة (جيم الخلايا) في "كيوتو"، CMP-Flt3+ CD115لو والكسور CMP-Flt3– 1 ،7، ولكن لا تسمح بتقييم إمكانات DC. وفي المقابل، مستعمرة تشكيل فحوصات أثبتت وجود أوليجوبوتينت غمبس (فروعه مع العَدلات والوحيدات المحتملة) في جزء "GMP"1،2، وهذا معتمد من قبل الأخيرة وحيدة الخلية تحليل ترانسكريبتوميك8. لا حاليا المعروف، ومع ذلك، ما إذا كانت هذه غمبس أوليجوبوتينت أيضا إنتاج المحببة الأخرى (الحمضات، الاسسه، وخلايا mast).
استناداً إلى هذه الدراسات، تبين لنا الآن كيف السطح 7 علامات (ج-كيت، هيئة الأوراق المالية-1، CD34، FcγR، Flt3، Ly6C و CD115) يمكن استخدامها لتحديد وعزل هذه المجموعات الفرعية 6 أوليجوبوتينت وفروعه النقوي النسب التي ارتكبت. يمكن تطبيق البروتوكول الموصوفة هنا في المختبر فحوصات الثقافة (الثقافات methylcellulose أو السائل)، في فيفو تجارب نقل التبني في الفئران، والتحليل الجزيئي (تسلسل الحمض النووي الريبي السائبة وخلية واحدة، النشاف الغربية، إلخ).
البروتوكول ويتكون من 3 مراحل: 1) إعداد تعليق خلية مفردة لنخاع العظم خلايا، 2) إثراء ل 3) تحديد، فروعه المكونة للدم (الفرز المغناطيسي تنشيط الخلية)، وعزله إذا رغبت، من مجموعات فرعية السلف بالتدفق الخلوي (باستخدام محلل أو من أرز، حسب الاقتضاء). الخطوة الأولى هو عزل خلايا نخاع العظام من قصبة وتيبياس من الفئران euthanized ومشابه للأخرى بروتوكولات تم وصفه مسبقاً9. بعد ذلك، أثري العينة للخلايا الجذعية والسلف باستخدام خليط من الأجسام المضادة ضد علامات خلية سطح الكريات الحمراء، العَدلات، وحيدات، الخلايا الليمفاوية، إلخ، إلى استنزاف الخلايا المتمايزة. وهذا ليس إلزامياً، ولكن الموصى به بشدة لتحسين الكشف عن المجموعات السلف، وتقليل كمية الأجسام المضادة اللازمة لتحديد السلف والوقت المطلوب للتدفق الخلوي. بروتوكول نضوب النسب أدناه توضح استخدام الماوس النسب خلية استنفاد عدة فرز الخلايا ماجنيتيكاكتيفاتيد (ماك) (الذي يحتوي على أضداد بيوتينيلاتيد CD5، CD45R (B220)، CD11b وغرام-1 (Ly6G/C)، 7-4، ومكررا ثانيا-119، بالإضافة إلى مكافحة البيوتين ميكروبيدس) وفاصل مغناطيسي الآلي. والخطوة الأخيرة هي تحديد (والفرز، وإذا رغبت في ذلك) من المجموعات السلف بالتدفق الخلوي. الفريق الضد المبينة أدناه (انظر أيضا الجدول 1) قد صممت لاستخدامها في تدفق سيتوميتير (محلل أو أرز) مع الليزر 4 (405 نانومتر، 488 نانومتر، 561 نانومتر، 640 nm).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58061/58061fig1.jpg"> رقم 1: المتكفل العَدلات والوحيدات والعاصمة ومسارات التمايز. ويوضح النموذج المنقح مؤخرا من ميلوبويسيس7 ، مع بوابات وايزمن عن "CMPs" (أزرق) و "غمبس" (أخضر)1 مضافين. لقد تم تعديل هذا الرقم من يانيز et al. عام 20177. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58061/58061fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="945">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2)</td>
			<td style="width:177px;">The Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:172px;">Cat#JAX:000664</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:172px;">Cat#130-090-858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">Cat#553733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse CD16/CD32 (Fc&#947;R; clone 93) APC-Cy7</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#101327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#108114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#105820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#128012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#135506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">Cat#560718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td style="width:177px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:172px;">Cat#C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">AutoMACS Separator</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>Use the &#34;deplete&#34; program</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">BD LSRFortessa</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>5 lasers, 15 colors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">BD FACS Aria III cell sorter</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>5 lasers, 13 colors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">FlowJo</td>
			<td style="width:177px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:172px;">https://www.flowjo.com</td>
			<td>For further analysis of the .fcs files</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification and isolation of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from mouse bone marrow

يمكن تحديدها في فروعه النقوي التي تسفر عن العَدلات ووحيدات الخلايا الجذعية (DCs) والمعزولة من نخاع العظام من الفئران للتحاليل الدموية والمناعية. على سبيل المثال، دراسات عن الخصائص الخلوية والجزيئية للسكان السلف النقوي يمكن أن تكشف عن الآليات الكامنة وراء التحول ليوكيميك، أو تبين كيفية استجابة النظام المناعي للتعرض للعوامل الممرضة. سبق وصف التدفق الخلوي استراتيجيات لتحديد السلف النقوي مكنت إنجازات هامة في العديد من المجالات، ولكن الكسور وهي تحدد متباينة للغاية. تعريف استراتيجيات النابضة الأكثر استخداماً الكسور نخاع العظام هي إثراء للسكان المطلوب، ولكنها تحتوي أيضا على عدد كبير من فروعه "تلويث". لدينا الدراسات الأخيرة قد حل جزء كبير من هذا التباين، والبروتوكول ونحن الحاضرين هنا تصاريح عزل الفئات السكانية الفرعية 6 من أوليجوبوتينت والنسب التي ارتكبت النقوي موروث من 2 الموصوفة سابقا الكسور نخاع العظام. ويصف البروتوكول 3 مراحل: 1) عزل نخاع العظم خلايا، 2) إثراء لفروعه المكونة للدم بالفرز المغناطيسي تنشيط الخلية (استنفاد النسب من أجهزة ماكينتوش)، 3) تحديد مجموعات فرعية النقوي السلف بالتدفق الخلوي (بما في ذلك الأسفار تنشيط الخلية الفرز، نظام مراقبة الأصول الميدانية، إذا رغبت في ذلك). هذا النهج يسمح بتقدير السلف والعزلة لمجموعة متنوعة من التطبيقات في المختبر و في فيفو ، وأسفرت بالفعل رواية ثاقبة مسارات وآليات العَدلات والوحيدات، وتمايز DC.

استخدام البروتوكول، المذكورة أعلاه، من الممكن الحصول على 100 مليون من الخلايا (بما في ذلك خلايا الدم الحمراء، أو خلايا عرطله 50 مليون) من قصبة و tibias (2 الساقين) واحدة بالماوس C57BL/6J (6-8 أسابيع القديمة، ذكرا كان أو أنثى) على حد سواء. يمكن أن تكون الخلايا لين– 1-2 مليون معزولة ...

Watch this Scientific Journal Video about Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow at JoVE.com

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

ونحن لشرح كيفية تحديد وعزل 6 مجموعات فرعية من فروعه النقوي من مورين نخاع العظام باستخدام مزيج من المغناطيسية والأسفار الفرز (أجهزة ماكينتوش ونظام مراقبة الأصول الميدانية). يمكن استخدام هذا البروتوكول في المختبر فحوصات الثقافة (الثقافات methylcellulose أو السائل) و في فيفو المتبنيين نقل التجارب وتحاليل الحمض النووي الريبي/البروتين.

تحديد وعزل أوليجوبوتينت والنسب التي ارتكبت النقوي موروث من نخاع العظام الماوس

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

This method could be helpful for hematologists and immunologists studying the production and function of myeloid cells, including neutrophils, monocytes, and dendritic cells. The main advantage of this technique is that it enables more precise identification of myeloid progenitor subsets than previous strategies. To enrich bone marrow cells for progenitors by magnetic-activated cell sorting, or MACS, pellet the cells by centrifugation and resuspend the pellet in 40 microliters of MACS staining buffer per one times 10 to the seven bone marrow cells.To deplete differentiated lineage positive cells, add 10 microliters of biotin antibody cocktail per one times 10 to the seven cells and to mix by pipetting for a 10 minute incubation at four degrees Celsius. At the end of the incubation, add 30 microliters of staining buffer per one times 10 to the seven cells with mixing, followed by 20 microliters of anti-biotin microbeads per one times 10 to the seven cells. After 15 minutes at four degrees Celsius, wash the cells with one milliliter of staining buffer per one times 10 to the seven cells and resuspend the pellet in 500 microliters of fresh staining buffer for up to one times 10 to the eight cells.Next, set up the automated magnetic separator according to the manufacturer's instructions and place the tube of labeled cells into the separator. Begin the negative selection program to collect the negative fraction which contains the progenitor enriched lineage negative cells. Pellet the lineage negative cells by centrifugation and resuspend the pellet, which is now white, in two milliliters of staining buffer per mouse for counting.To isolate the myeloid progenitor cells by FACS, add one times 10 to the fifth lineage negative cells to each of eight control microcentrifuge tubes for voltage selection and color compensation and add the rest of the cell sample to a ninth microcentrifuge tube for staining with all seven of the surface marker antibodies of interest for progenitor identification and sorting. Pellet the cells by centrifugation and resuspend the control pellets in 100 microliters of FACS staining buffer and the experimental sample pellet in 100 microliters of staining buffer per five times 10 to the six cells. Next, add anti-CD16/CD32 antibody to the Fc gamma receptor single stain tube and the sample tube.Vortex gently and incubate the samples for 10 minutes at four degrees Celsius. At the end of the incubation, add the other antibodies to the appropriate corresponding single stain tubes and to the sample tube and after gentle vortexing, incubate the samples for 15 minutes at four degrees Celsius. At the end of the incubation, add 900 microliters of staining buffer to the control tubes and one milliliter of staining buffer per one times 10 to the seven cells to the sample tube for centrifugation.Resuspend the control pellets in 200 microliters of fresh staining buffer per tube and the experimental pellet in 500 microliters per 2.5 times 10 to the seven cells and transfer the labeled cells to individual corresponding five milliliter FACS tubes. Then set up the flow cytometer according to standard protocols and use the unstained and single stained controls to set the voltages and the color compensations. To identify and isolate the myeloid progenitor cells, load the experimental cell sample onto the cytometer and create a forward scatter area versus side scatter area plot, gating to exclude the debris and dead cells.Create a forward scatter height versus forward scatter width plot of the live cells and gate to exclude the doublets. Repeat this process with a side scatter height versus side scatter width plot of the forward scatter singlets and gate to exclude the doublets. Create a Sca-1 versus c-Kit plot and gate to select the c-Kit positive Sca-1 negative progenitors.Then create a CD-34 versus FC gamma receptor plot and gate to select the mixed common myeloid progenitor and mixed granulocyte monocyte progenitor populations. It's important to gate the mixed common myeloid progenitor and mixed granulocyte monocyte progenitor populations as precisely as possible. It can be helpful to use a pseudo-color density plot or a contour plot for more accurate gating.Use the cells in the mixed common myeloid progenitor gate to create a CD115 versus Flt3 plot and gate to select the common myeloid progenitor Flt3 positive CD115 low cells, the common myeloid progenitor Flt3 negative CD115 low cells, and the Flt3 positive CD115 high monocyte dendritic cell progenitors. Use the cells in the mixed granulocyte monocyte progenitor gate to create a Ly6C versus FC Gamma receptor plot and gate to select the Ly6C negative cells and the Ly6C positive cells. Then create a CD115 versus Flt3 plot for each gated mixed granulocyte monocyte progenitor cell subpopulation and gate the Ly6C negative Flt3 negative CD115 low granulocyte monocyte progenitors, the Ly6C positive Flt3 negative CD115 low granulocyte progenitors, and the Ly6C positive Flt3 negative CD115 high monocyte progenitors.Max lineage depletion is efficient at depleting differentiated cells and for enriching for the c-Kit positive progenitor cells. The lineage negative fraction does still contain some c-Kit negative cells, but these cells will be eliminated in subsequent flow cytometry gating steps. Progenitor yields after FACS sorting can vary depending on the sorter settings used, but it should be possible to obtain between one to four times 10 to the fourth cells per fraction from each mouse with a post-sort purity of greater than 95%for each fraction.Good staining is critical for clean separation of the populations. You may need to titrate the antibodies or choose different fluorophores to ensure optimal separation. This protocol can be used to identify progenitor cells to assess differences in bone marrow composition between samples, to isolate progenitors for molecular analysis or to assess their ability to produce myeloid cells.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

العزلة وتنقية وصفها من العظام بالنسبة للفئران العدلات نخاع للدراسات الفنية والتجارب نقل بالتبني

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

عزل الخلايا الجذعية متعلق بالنخاع الشوكي والخلايا الظهارية من الغدة الصعترية الإنسان

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

نخاع العظام المستمدة من بلعم الإنتاج

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

عزل وحقن في الوريد من الفئران نخاع العظام المستمدة حيدات

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

تتبع الماوس نخاع العظم وحيدات<em&gt; في فيفو</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

النخاعي عزل الخلايا من الجلد ماوس وتصريف العقدة الليمفاوية بعد الأدمة التحصين مع لايف الموهن<em&gt; المتصورة</em&gt; Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

الفئران هند الاطراف طويل العظام تشريح ونخاع العظم عزل

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

جيل وتحديد GM-CSF المشتقة مثل السنخية الضامة والخلايا الجذعية من الفأر نخاع العظم

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

مضان تنشيط الفرز الخليوي لتنقية الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل من الفأر نخاع العظم

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

توليد عدد كبير من فروعه النقوي وسلائف الخلايا الجذعية من نخاع العظام مورين باستخدام خلية رواية فرز استراتيجية

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...