Name: identification and isolation of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from mouse bone marrow
Uploaded: 2018-07-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow at JoVE.com

פרוטוקול זה פותחה באמצעות קרנות ממכון לוח של המושלים הרגנרציה לרפואה במרכז הרפואי Cedars-Sinai (כדי HSG), קריירות ב מלגת אימונולוגיה של האגודה האמריקאית של Immunologists (כדי AY HSG), ו פרס מלומד האגודה האמריקנית של המטולוגיה (כדי AY). אנו מודים הליבה Cytometry זרימה בבית Cedars-Sinai Medical Center על סיוע עם FACS מיון.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של Cedars-Sinai Medical Center.
1. בידוד של מח העצם העכבר והכנה של השעיה תא בודד
<ol><li>המתת חסד את העכבר בהתאם להנחיות מוסדיים.</li>
	<li>הנח את העכבר לאללה על גבו, תשפריץ עם 70% אתנול (EtOH). עושים חתך קטן (3-5 מ מ) בכל אי?...

<ol>
	<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRF8+acts+in+lineage-committed+rather+than+oligopotent+progenitors+to+control+neutrophil+vs+monocyte+production.">IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production.</a> Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).</li><li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX3CR1++CD115++CD135++common+macrophage/DC+precursors+and+the+role+of+CX3CR1+in+their+response+to+inflammation.">CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).</li><li>Fogg, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+bone+marrow+progenitor+specific+for+macrophages+and+dendritic+cells.">A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells.</a> Science. 311 (5757), 83-87 (2006).</li><li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clonogenic+common+Flt3+M-CSFR++plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow.">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).</li><li>Hettinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+monocytes+and+macrophages+in+a+committed+progenitor.">Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor.</a> Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte-monocyte+progenitors+and+monocyte-dendritic+cell+progenitors+independently+produce+functionally+distinct+monocytes.">Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes.</a> Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).</li><li>Olsson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+mixed-lineage+states+leading+to+a+binary+cell+fate+choice.">Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice.</a> Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).</li><li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation.">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+regulatory+factor+8+and+the+regulation+of+neutrophil,+monocyte,+and+dendritic+cell+production.">Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production.</a> Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).</li><li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors.">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).</li></ol>

ויסמן gating אסטרטגיה עבור זיהוי קדמון מיאלואידית העכבר1 כבר את תקן זהב עבור immunologists ו ההמטולוגים במשך כמעט 20 שנה, אבל עכשיו זה לכאורה כי השערים "CMP" ו- "GMP" הם מאוד הטרוגנית יותר מדויק אסטרטגיות המגביל נחוצים. בפרוטוקול כי שתיארנו כאן מאפשר הזיהוי של oligopotent ושל קבוצות משנה ביצע שושל?...

ומונוציטים, נויטרופילים, תאים דנדריטים (Dc) הם התאים מיאלואידית הנובעים מן אבות hematopoietic, בעיקר במח העצם, על ידי תהליך הנקרא myelopoiesis. אבות מיאלואידית משותף (CMPs) יש פוטנציאל לייצר התאים מיאלואידית, כמו גם megakaryocytes, אריתרוציטים, אבל בתאי הלימפה לא. גרנולוציט-מונוציט אבות (Gmp), אשר נגזרות CMPs, להפיק גרנולוציטים ומונוציטים, אך איבדו מגקריוציט של כדוריות דם אדומות פוטנציאליים. ומונוציטים הקלאסית plasmacytoid בקרי קבוצת מחשבים (cDCs/שיתפקדו) הם גם חשבו נובעים אבות נפוץ הידוע בשם אבות מונוציט-DC (MDPs), המיוצרים על ידי הדרגתי ההגבלה של פוטנציאל שושלת היוחסין בסופו של דבר התוצאה ביצע השושלת CMPs. אבות: אבות גרנולוציט מונוציט אבות, אבות תא דנדריטי (איור 1).
וייסמן ועמיתיו דיווחו כי CMPs נמצאים בערכה לין– c-+ Sca-1– (ביירד–) CD34+ FcγRהלאו שבר של העכבר מח העצם, ואילו Gmp הכלולים CD34 ביירד– + FcγR היי חלק1. עם זאת, אלו שברים "CMP" ו- "GMP" הם מאוד הטרוגנית. למשל, השבר "GMP" מכיל גם גרנולוציט ביצע לשושלת אבות מונוציט אבות1,2. MDPs דווחו בנפרד כדי להיות CX3CR1+ Flt3+ CD115+ אבות כי גם אקספרס CD34 ו FcγR3,-4. MDPs להצמיח cDC/pDC-הפקת נפוצות DC אבות (CDPs), אשר דווחו לבטא רמות נמוכות יותר של c-Kit (CD117), לא נכללות שבר ביירד– 5.
בעבר והונח ומונוציטים להיווצר באמצעות נתיב יחיד (CMP-GMP-MDP-מונוציט). בקנה אחד עם זה אבות מודל, ביצע מונוציט מתוצרת Gmp (על שם אבות מונוציט, MPs)2 ו- MDPs (על שם נפוץ מונוציט אבות, cMoPs)6 שנראה אותם התאים על בסיס משותף סמן משטח ביטוי . עם זאת, אנחנו לאחרונה הוכיח כי ומונוציטים מיוצרים באופן עצמאי על ידי Gmp ו MDPs, היו מסוגלים להבחין בין MPs cMoPs על ידי רצפי RNA בתא יחיד7.
אנחנו ששינה לאחרונה את ויסמן "CMP" ואסטרטגיה "GMP" חסימה כדי לזהות subfractions 6 של מח העצם של העכבר C57BL/6J המכילה oligopotent שונים, ביצע שושלת היוחסין קדמון מיאלואידית קבוצות משנה. קודם דיווחנו כי צביעת עבור Ly6C ו- CD115 מתירה את ניתוקה של oligopotent Gmp, וכן גרנולוציט אבות (GPs) של אבות מונוציט (MPs והן cMoPs, אשר כעת אין אפשרות להפריד) שבר "GMP"2 (ביירד - CD34+ FcγRהיי שער; איור 1). לאחר מכן להדגים MDPs מצויים בעיקר השבר "CMP" (CD34 ביירד– + FcγRהלאו שער), אשר מכיל גם Flt3+ CD115הלאו , Flt3– קבוצות משנה7 (איור 1 ). CMP-+ CD115הלאו שבר Flt3 התשואות Gmp והן MDPs בעת העברה המאמצת. המשנה CMP-Flt3– מכיל אבות כי נראה ביניים בין CMP-Flt3+ CD115הלאו תאים Gmp. בניגוד MDPs, CMP-Flt3+ CD115הלאו והן שברים CMP-Flt3– גם בעלי מגקריוציט כדוריות דם אדומות פוטנציאליים.
חשוב לציין, עם זאת, כי זה כרגע לא ברור אם השברים "CMP" מכילים אבות כי הם באמת oligopotent (למשל, תאים בודדים בתוך CMP-+ CD115הלאו שבר Flt3 שקיימים נויטרופילים, מונוציט, DC, מגקריוציט, פוטנציאל כדוריות דם אדומות), או לחלופין, מהווים תערובת של אבות עם פוטנציאל שושלת היוחסין מוגבל יותר. המושבה ויוצרים מבחני (methylcellulose תרבויות) חשפה תאים עם גרנולוציט (נויטרופילים), כדוריות דם אדומות, מונוציט מגקריוציט פוטנציאליים (תאי GEMM) ב- "CMP," CMP-Flt3+ CD115הלאו ושברים CMP-Flt3– 1 ,7, אך אינן מתירות את ההערכה של פוטנציאל DC. לעומת זאת, המושבה ויוצרים מבחני הוכיחה את קיומו של oligopotent Gmp (אבות נויטרופילים וגם מונוציט פוטנציאליים)1,שבר "GMP"2, זה נתמך על ידי תא בודד לאחרונה ניתוח transcriptomic8. לא כיום ידוע, עם זאת, בין אם אלה Gmp oligopotent גם לייצר אחרים גרנולוציטים (אאוזינופילים, בזופילים, ו תאי פיטום).
בהתבסס על מחקרים אלה, עכשיו נדגים איך פני השטח 7 סמנים (c-Kit, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C ו CD115) יכול לשמש לזיהוי ולבידוד אלה 6 קבוצות משנה של oligopotent, ביצע לשושלת אבות מיאלואידית. הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות מיושם עבור in vitro לקשרי תרבות מבחני (תרבויות methylcellulose או נוזל), ויוו העברה המאמצת ניסויים עכברים, אנליזה מולקולרית (רצפי RNA בתפזורת, תא בודד, סופג המערבי, וכו).
הפרוטוקול מורכב 3 שלבים: 1) הכנת השעיה תא בודד של מח העצם תאים, 2) העשרה עבור אבות hematopoietic (מגנטי תא לפעיל על-מיון), ו- 3) זיהוי ובידוד במידת הצורך, של קבוצות משנה קדמון על ידי זרימת cytometry (באמצעות מנתח או סדרן, לפי הצורך). הצעד הראשון הוא בידודו של תאים במח העצם עצמות הירך ואת tibias של עכברים לאללה, והוא דומה לזה שתואר לעיל פרוטוקולים אחרים9. בשלב הבא, המדגם הוא מועשר עבור תאי גזע וקדמון באמצעות קוקטייל של נוגדנים נגד סמני פני שטח התא של אריתרוציטים, נויטרופילים ומונוציטים, לימפוציטים, וכו ', כדי לרוקן את התאים הבדיל. זו אינה חובה, אבל מומלץ בחום כדי למטב את הזיהוי של ערכות המשנה קדמון, וכדי להפחית את כמות נוגדנים לצורך זיהוי קדמון ולא את הזמן הנדרש עבור cytometry זרימה. פרוטוקול דלדול שושלת היוחסין להלן מתאר מיון תא Magnetic-Activated (מקינטוש) באמצעות ערכת דלדול העכבר תא השושלת (אשר מכיל biotinylated נוגדנים נגד CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/ג), 7-4, וטר-119, בנוסף אנטי ביוטין . גרגרי) ומפריד ממוכנת מגנטי. השלב האחרון הוא הזיהוי (ומיון, במידת הצורך) של ערכות המשנה קדמון על ידי cytometry זרימה. לוח נוגדן המתוארים להלן (ראה גם לוח 1) תוכנן כדי לשמש cytometer זרימה (מנתח או סדרן) עם לייזרים 4 (405 ננומטר, 488 ננומטר, 561 nm, 640 ננומטר).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58061/58061fig1.jpg"> איור 1: אבות נויטרופילים, מונוציט, DC מסלולים בידול. המודל לאחרונה המתוקן של myelopoiesis7 מודגם, עם השערים וייסמן "CMPs" (כחול) ו- "Gmp" (ירוק)1 בשכבות. איור זה השתנה. ואח 2017 Yáñez7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58061/58061fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="945">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2)</td>
			<td style="width:177px;">The Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:172px;">Cat#JAX:000664</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:172px;">Cat#130-090-858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">Cat#553733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse CD16/CD32 (Fc&#947;R; clone 93) APC-Cy7</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#101327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#108114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#105820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#128012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#135506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">Cat#560718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td style="width:177px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:172px;">Cat#C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">AutoMACS Separator</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>Use the &#34;deplete&#34; program</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">BD LSRFortessa</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>5 lasers, 15 colors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">BD FACS Aria III cell sorter</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>5 lasers, 13 colors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">FlowJo</td>
			<td style="width:177px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:172px;">https://www.flowjo.com</td>
			<td>For further analysis of the .fcs files</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification and isolation of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from mouse bone marrow

אבות מיאלואידית כי תשואות נויטרופילים ומונוציטים, תאים דנדריטים (Dc) יכול להיות מזוהה ב והיא מבודדת ממח העצם של עכברים עבור ניתוחים hematological ו. לדוגמה, מחקרים של המאפיינים תאית ומולקולרית של אוכלוסיות קדמון מיאלואידית ניתן לחשוף את המנגנונים שבבסיס הטרנספורמציה לוקמיה או להדגים כיצד המערכת החיסונית מגיבה לחשיפה הפתוגן. בעבר אסטרטגיות cytometry זרימה שתואר עבור זיהוי קדמון מיאלואידית אפשרו התקדמות משמעותית בתחומים רבים, אך שברים שהם מזהים הטרוגנית מאוד. אסטרטגיות המגביל הנפוצות ביותר מגדירים מח העצם שברים מועשר עבור האוכלוסיות הרצוי, אך גם להכיל מספרים גדולים של אבות "מזהם". מחקרים אחרונים שלנו פתרו את רוב זה הטרוגניות, פרוטוקול שאנו מציגים כאן מתירה את ניתוקה של 6 subpopulations של oligopotent, ביצע לשושלת אבות מיאלואידית 2 שתואר קודם לכן מח העצם שברים. הפרוטוקול מתאר 3 שלבים: 1) בידוד של מח העצם תאים, 2) העשרה עבור אבות hematopoietic על-ידי מגנטי תא לפעיל על-מיון (דלדול שושלת היוחסין מאת מקינטוש) ולאחר 3) זיהוי של קדמון מיאלואידית קבוצות משנה על-ידי cytometry זרימה (כולל קרינה פלואורסצנטית תא לפעיל על-מיון, FACS, במידת הצורך). גישה זו מאפשרת כימות קדמון ובידוד למגוון רחב של יישומי בתוך חוץ גופית וויוו , כבר הניב תובנות הרומן משעולים, מנגנונים של נויטרופילים, מונוציט DC בידול.

באמצעות פרוטוקול המתואר לעיל, זה אפשרי להשיג ~ 100 מיליון תאים (כולל תאי דם אדומים, או תאים nucleated ~ 50 מיליון) של עצמות הירך והן tibias (2 רגליים) של עכבר C57BL/6J אחד (6-8 שבועות ישנים, זכר או נקבה). 1-2 מיליון תאים לין– ניתן לבודד לכל העכבר על ידי MACS דלדול תאי לין+ .
<p class="jove_conte...

Watch this Scientific Journal Video about Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow at JoVE.com

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

נדגים כיצד לזהות ולבודד 6 קבוצות משנה של אבות מיאלואידית ממח העצם מאתר באמצעות שילוב של מגנטי קרינה פלואורסצנטית מיון (מקינטוש ו- FACS). פרוטוקול זה יכול לשמש in vitro לקשרי תרבות מבחני (תרבויות methylcellulose או נוזל), ויוו המאמצת העברת הניסויים של RNA/חלבון ניתוחים.

זיהוי ובידוד של Oligopotent, ביצע לשושלת אבות מיאלואידית ממח העצם העכבר

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

This method could be helpful for hematologists and immunologists studying the production and function of myeloid cells, including neutrophils, monocytes, and dendritic cells. The main advantage of this technique is that it enables more precise identification of myeloid progenitor subsets than previous strategies. To enrich bone marrow cells for progenitors by magnetic-activated cell sorting, or MACS, pellet the cells by centrifugation and resuspend the pellet in 40 microliters of MACS staining buffer per one times 10 to the seven bone marrow cells.To deplete differentiated lineage positive cells, add 10 microliters of biotin antibody cocktail per one times 10 to the seven cells and to mix by pipetting for a 10 minute incubation at four degrees Celsius. At the end of the incubation, add 30 microliters of staining buffer per one times 10 to the seven cells with mixing, followed by 20 microliters of anti-biotin microbeads per one times 10 to the seven cells. After 15 minutes at four degrees Celsius, wash the cells with one milliliter of staining buffer per one times 10 to the seven cells and resuspend the pellet in 500 microliters of fresh staining buffer for up to one times 10 to the eight cells.Next, set up the automated magnetic separator according to the manufacturer's instructions and place the tube of labeled cells into the separator. Begin the negative selection program to collect the negative fraction which contains the progenitor enriched lineage negative cells. Pellet the lineage negative cells by centrifugation and resuspend the pellet, which is now white, in two milliliters of staining buffer per mouse for counting.To isolate the myeloid progenitor cells by FACS, add one times 10 to the fifth lineage negative cells to each of eight control microcentrifuge tubes for voltage selection and color compensation and add the rest of the cell sample to a ninth microcentrifuge tube for staining with all seven of the surface marker antibodies of interest for progenitor identification and sorting. Pellet the cells by centrifugation and resuspend the control pellets in 100 microliters of FACS staining buffer and the experimental sample pellet in 100 microliters of staining buffer per five times 10 to the six cells. Next, add anti-CD16/CD32 antibody to the Fc gamma receptor single stain tube and the sample tube.Vortex gently and incubate the samples for 10 minutes at four degrees Celsius. At the end of the incubation, add the other antibodies to the appropriate corresponding single stain tubes and to the sample tube and after gentle vortexing, incubate the samples for 15 minutes at four degrees Celsius. At the end of the incubation, add 900 microliters of staining buffer to the control tubes and one milliliter of staining buffer per one times 10 to the seven cells to the sample tube for centrifugation.Resuspend the control pellets in 200 microliters of fresh staining buffer per tube and the experimental pellet in 500 microliters per 2.5 times 10 to the seven cells and transfer the labeled cells to individual corresponding five milliliter FACS tubes. Then set up the flow cytometer according to standard protocols and use the unstained and single stained controls to set the voltages and the color compensations. To identify and isolate the myeloid progenitor cells, load the experimental cell sample onto the cytometer and create a forward scatter area versus side scatter area plot, gating to exclude the debris and dead cells.Create a forward scatter height versus forward scatter width plot of the live cells and gate to exclude the doublets. Repeat this process with a side scatter height versus side scatter width plot of the forward scatter singlets and gate to exclude the doublets. Create a Sca-1 versus c-Kit plot and gate to select the c-Kit positive Sca-1 negative progenitors.Then create a CD-34 versus FC gamma receptor plot and gate to select the mixed common myeloid progenitor and mixed granulocyte monocyte progenitor populations. It's important to gate the mixed common myeloid progenitor and mixed granulocyte monocyte progenitor populations as precisely as possible. It can be helpful to use a pseudo-color density plot or a contour plot for more accurate gating.Use the cells in the mixed common myeloid progenitor gate to create a CD115 versus Flt3 plot and gate to select the common myeloid progenitor Flt3 positive CD115 low cells, the common myeloid progenitor Flt3 negative CD115 low cells, and the Flt3 positive CD115 high monocyte dendritic cell progenitors. Use the cells in the mixed granulocyte monocyte progenitor gate to create a Ly6C versus FC Gamma receptor plot and gate to select the Ly6C negative cells and the Ly6C positive cells. Then create a CD115 versus Flt3 plot for each gated mixed granulocyte monocyte progenitor cell subpopulation and gate the Ly6C negative Flt3 negative CD115 low granulocyte monocyte progenitors, the Ly6C positive Flt3 negative CD115 low granulocyte progenitors, and the Ly6C positive Flt3 negative CD115 high monocyte progenitors.Max lineage depletion is efficient at depleting differentiated cells and for enriching for the c-Kit positive progenitor cells. The lineage negative fraction does still contain some c-Kit negative cells, but these cells will be eliminated in subsequent flow cytometry gating steps. Progenitor yields after FACS sorting can vary depending on the sorter settings used, but it should be possible to obtain between one to four times 10 to the fourth cells per fraction from each mouse with a post-sort purity of greater than 95%for each fraction.Good staining is critical for clean separation of the populations. You may need to titrate the antibodies or choose different fluorophores to ensure optimal separation. This protocol can be used to identify progenitor cells to assess differences in bone marrow composition between samples, to isolate progenitors for molecular analysis or to assess their ability to produce myeloid cells.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

בידוד, טיהור וסימון של נויטרופילים מח עצם עכבר ללימודים פונקציונליים וניסויי העברת מאמצת

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

מח עצם נגזרות Macrophage הפקה

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

המונוציטים בידוד והזרקה תוך ורידית של Murine מח העצם נגזר

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

מעקב עכבר מח עצם המונוציטים<em&gt; In vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

בידוד תא מיאלואידית מעור העכבר וניקוז הלימפה הצומת בעקבות החיסון תוך-עורית עם נחלש חי<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Murine הינד לימב ארוך עצם Dissection ובידוד מח העצם

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

דור וזיהוי GM-CSF נגזר מכתשיים דמוי מאקרופאגים דנדריטים תאי עכבר מח עצם

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

דור מספר גדול של תאים מיאלואידים אבות ו מבשרי תא דנדריטי ממח העצם מאתר באמצעות תא הרומן מיון אסטרטגיה

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...