Name: identification and isolation of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from mouse bone marrow
Uploaded: 2018-07-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow at JoVE.com

इस प्रोटोकॉल को देवदारों-सिनाई मेडिकल सेंटर (HSG), अमेरिकन एसोसिएशन ऑफ Immunologists (प्र और HSG) से इम्यूनोलॉजी फैलोशिप में एक कॅरिअर, और एक विद्वान पुरस्कार से बोर्ड ऑफ गवर्नर्स का पुनर्उत्पादक चिकित्सा संस्थान से धन का उपयोग कर विकसित किया गया था अमेरिकन सोसायटी ऑफ रुधिर (प्र.). हम देवदारों पर प्रवाह Cytometry कोर धंयवाद-FACS छंटाई के साथ सहायता के लिए सिनाई चिकित्सा केंद्र ।

यहां बताए गए सभी तरीकों देवदार-सिनाई मेडिकल सेंटर के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया ।
1. माउस अस्थि मज्जा और एक एकल सेल निलंबन की तैयारी के अलगाव
<ol><li>संस्थागत ?...

<ol>
	<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRF8+acts+in+lineage-committed+rather+than+oligopotent+progenitors+to+control+neutrophil+vs+monocyte+production.">IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production.</a> Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).</li><li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX3CR1++CD115++CD135++common+macrophage/DC+precursors+and+the+role+of+CX3CR1+in+their+response+to+inflammation.">CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).</li><li>Fogg, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+bone+marrow+progenitor+specific+for+macrophages+and+dendritic+cells.">A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells.</a> Science. 311 (5757), 83-87 (2006).</li><li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clonogenic+common+Flt3+M-CSFR++plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow.">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).</li><li>Hettinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+monocytes+and+macrophages+in+a+committed+progenitor.">Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor.</a> Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte-monocyte+progenitors+and+monocyte-dendritic+cell+progenitors+independently+produce+functionally+distinct+monocytes.">Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes.</a> Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).</li><li>Olsson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+mixed-lineage+states+leading+to+a+binary+cell+fate+choice.">Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice.</a> Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).</li><li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation.">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+regulatory+factor+8+and+the+regulation+of+neutrophil,+monocyte,+and+dendritic+cell+production.">Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production.</a> Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).</li><li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors.">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).</li></ol>

माउस माइलॉयड जनक पहचान के लिए Weissman गेटिंग रणनीति1 लगभग 20 वर्षों के लिए immunologists और hematologists के लिए सोने के मानक किया गया है, लेकिन यह अब स्पष्ट है कि "सीएमपी" और "जीएमपी" गेट्स बहुत विषम और अधिक सटीक रहे है ग?...

Monocytes, न्यूट्रोफिल, और वृक्ष कोशिकाओं (dc) माइलॉयड कोशिकाओं है कि टेम progenitors से पैदा होते हैं, मुख्य रूप से अस्थि मज्जा में, एक प्रक्रिया द्वारा myelopoiesis बुलाया । आम माइलॉयड progenitors (CMPs) माइलॉयड कोशिकाओं का उत्पादन करने की क्षमता है, साथ ही megakaryocytes और एरिथ्रोसाइट्स, लेकिन नहीं लसीकावत् कोशिकाओं । Granulocyte-monocyte progenitors (GMPs), जो CMPs से प्राप्त होते हैं, granulocytes और monocytes का उत्पादन करते हैं, लेकिन megakaryocyte और एरिथ्रोसाइट क्षमता खो चुके हैं. Monocytes और शास्त्रीय और plasmacytoid dc (cDCs/पीडीसी) भी progenitors द्वारा उत्पादित कर रहे हैं, जो आम monocyte से उत्पन्न करने के लिए सोचा-डीसी progenitors (MDPs), CMPs के रूप में जाना जाता है । वंश क्षमता के क्रमिक प्रतिबंध अंततः वंश में परिणाम प्रतिबद्ध progenitors: granulocyte progenitors, monocyte progenitors, और वृक्ष सेल progenitors (figure 1).
Weissman और सहकर्मियों ने बताया कि CMPs में पाए जाते हैं कि लिन- सी-किट+ Sca-1- (LKS-) CD34+ FcγRलो अंश माउस की अस्थि मज्जा, जबकि GMPs में समाहित हैं LKS- CD34+ FcγR हाय अंश1। हालांकि, इन "सीएमपी" और "जीएमपी" भिन्न बहुत विषम हैं. उदाहरण के लिए, "जीएमपी" अंश में वंश-कमिट granulocyte progenitors और monocyte progenitors1,2भी शामिल हैं । MDPs को CX3CR1+ Flt3+ CD115+ progenitors होने की सूचना अलग से दी गई थी जो CD34 और FcγR3,4को भी व्यक्त करती है । MDPs सीडीसी/pDC-उत्पादन आम डीसी progenitors (CDPs), जो सी-किट (CD117) के निचले स्तर व्यक्त करने के लिए सूचित किया गया है और LKS- अंश5में शामिल नहीं है दे ।
यह पहले से ही माना जाता था कि monocytes एक मार्ग (सीएमपी-जीएमपी-एचडीपी-monocyte) के माध्यम से उठता है । इस मॉडल के अनुरूप, monocyte प्रतिबद्ध progenitors द्वारा उत्पादित GMPs (नामित monocyte progenitors, एमपीएस)2 और MDPs (नामांकित कॉमन monocyte progenitors, cMoPs)6 को साझा सतह मार्कर अभिव्यक्ति के आधार पर एक ही कोशिकाओं को दिखाई . हालांकि, हम हाल ही में प्रदर्शित किया कि monocytes स्वतंत्र रूप से GMPs और MDPs द्वारा उत्पादित कर रहे हैं, और एकल सेल आरएनए अनुक्रमण7द्वारा सांसदों और cMoPs के बीच भेद करने में सक्षम थे.
हम हाल ही में संशोधित Weissman "सीएमपी" और "जीएमपी" गेटिंग रणनीति C57BL के 6 उपभागों की पहचान करने के लिए/6J माउस अस्थि मज्जा अलग oligopotent और वंश-प्रतिबद्ध माइलॉयड जनक सबसेट युक्त. हम पहले की रिपोर्ट है कि Ly6C और CD115 के लिए धुंधला oligopotent GMPs के अलगाव परमिट, साथ ही साथ granulocyte progenitors (जीपीएस) और monocyte progenitors (दोनों सांसदों और cMoPs, जो वर्तमान में हम अलग करने में असमर्थ हैं) से "जीएमपी" अंश2 (LKS - CD34+ FcγRहाय गेट; चित्रा 1) । हम बाद में प्रदर्शन किया है कि MDPs मुख्य रूप से "सीएमपी" अंश में पाया जाता है (LKS- CD34+ FcγRलो गेट), जो भी शामिलFlt3 + CD115lo और Flt3- सबसेट7 (चित्रा 1 ). सीएमपी-Flt3+ CD115lo भिन्न पैदावार दोनों GMPs और MDPs अपनाने पर स्थानांतरण. सीएमपी-Flt3- सबसेट progenitors सीएमपी-Flt3+ CD115लो कोशिकाओं और GMPs के बीच मध्यवर्ती होने के लिए दिखाई देते हैं. MDPs के विपरीत, दोनों सीएमपी-Flt3+ CD115लो और सीएमपी-Flt3- भिन्न भी megakaryocyte और एरिथ्रोसाइट क्षमता के अधिकारी.
यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है, तथापि, कि यह वर्तमान में स्पष्ट नहीं है कि क्या "सीएमपी" भिन्न progenitors होते हैं कि वास्तव में oligopotent हैं (जैसे, सीएमपी के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं-Flt3+ CD115lo अंश कि अधिकारी न्युट्रोफिल, monocyte, डीसी, megakaryocyte, और एरिथ्रोसाइट क्षमता), या वैकल्पिक रूप से, और अधिक प्रतिबंधित वंश क्षमता के साथ progenitors का एक मिश्रण शामिल हैं । कॉलोनी बनाने की परख (methylcellulose संस्कृतियों) granulocyte के साथ कोशिकाओं से पता चला (न्युट्रोफिल), एरिथ्रोसाइट, monocyte और megakaryocyte क्षमता (GEMM कोशिकाओं) में "सीएमपी", सीएमपी-Flt3+ CD115lo और सीएमपी-Flt3- भिन्न1 ,7, लेकिन डीसी क्षमता के आकलन की अनुमति नहीं है । इसके विपरीत, कॉलोनी बनाने की परख oligopotent GMPs के अस्तित्व को प्रदर्शित किया (दोनों न्युट्रोफिल और monocyte क्षमता के साथ progenitors) "जीएमपी" अंश1,2में, और यह हाल ही में एकल सेल द्वारा समर्थित है transcriptomic विश्लेषण8. यह वर्तमान में ज्ञात नहीं है, तथापि, क्या इन oligopotent GMPs भी अंय granulocytes (इयोस्नोफिल्स, बेसोफिल, और मस्तूल कोशिकाओं) का उत्पादन ।
इन अध्ययनों के आधार पर, अब हम प्रदर्शन कैसे 7 सतह मार्करों (सी-किट, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C और CD115) की पहचान और oligopotent और वंश की प्रतिबद्ध माइलॉयड progenitors के इन 6 सबसेट को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल में इन विट्रो संस्कृति परख (methylcellulose या तरल संस्कृतियों) के लिए लागू किया जा सकता है, में vivo अपनाने चूहों में स्थानांतरण प्रयोगों, और आणविक विश्लेषण (थोक और एकल सेल आरएनए अनुक्रमण, पश्चिमी सोख्ता, आदि) ।
प्रोटोकॉल 3 चरणों के होते हैं: 1) अस्थि मज्जा कोशिकाओं के एक एकल सेल निलंबन की तैयारी, 2) टेम progenitors के लिए संवर्धन (चुंबकीय-सक्रिय सेल छंटाई), और 3) पहचान, और अलगाव अगर वांछित, जनक के प्रवाह द्वारा सबसेट cytometry (एक विश्लेषक या एक सॉर्टर, के रूप में उपयुक्त का उपयोग करके) । पहला कदम femurs और euthanized चूहों के tibias से अस्थि मज्जा कोशिकाओं का अलगाव है और अन्य पहले वर्णित प्रोटोकॉल9के समान है. अगला, नमूना स्टेम और जनक कोशिकाओं एरिथ्रोसाइट्स, न्यूट्रोफिल, monocytes, लिम्फोसाइटों, आदि के सेल सतह मार्करों के खिलाफ एंटीबॉडी का एक कॉकटेल का उपयोग करने के लिए समृद्ध है , विभेदित कोशिकाओं को चूस । यह अनिवार्य नहीं है, लेकिन दृढ़ता से जनक सबसेट का पता लगाने का अनुकूलन की सिफारिश की है, और जनक पहचान और प्रवाह cytometry के लिए आवश्यक समय के लिए जरूरत एंटीबॉडी की मात्रा को कम करने के लिए. वंश घट प्रोटोकॉल नीचे का वर्णन चुंबकीय-सक्रिय कक्ष छँटाई (एमएसीएस) एक चूहे वंश सेल कमी किट का उपयोग (जो CD5 के खिलाफ biotinylated एंटीबॉडी शामिल हैं, CD45R (B220), CD11b, जीआर-1 (Ly6G/ग), 7-4, और तेर-११९, प्लस विरोधी बायोटिन microbeads) और एक स्वचालित चुंबकीय विभाजक । अंतिम चरण की पहचान है (और छंटाई, यदि वांछित) जनक उपसमुच्चय के प्रवाह cytometry द्वारा । एंटीबॉडी पैनल नीचे वर्णित (भी तालिका 1देखें) 4 पराबैंगनीकिरण (४०५ एनएम, ४८८ एनएम, ५६१ एनएम, ६४० एनएम) के साथ एक प्रवाह cytometer (विश्लेषक या सॉर्टर) में इस्तेमाल किया जा करने के लिए डिजाइन किया गया है ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58061/58061fig1.jpg"> चित्रा 1: न्युट्रोफिल, monocyte और डीसी progenitors और भेदभाव रास्ते । myelopoiesis7 के हाल ही में संशोधित मॉडल "CMPs" (नीला) और "GMPs" (हरा)1 मढ़ा के लिए Weissman गेट्स के साथ, सचित्र है । यह आंकड़ा Yáñez एट अल. २०१७7से संशोधित किया गया है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58061/58061fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="945">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2)</td>
			<td style="width:177px;">The Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:172px;">Cat#JAX:000664</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:172px;">Cat#130-090-858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">Cat#553733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse CD16/CD32 (Fc&#947;R; clone 93) APC-Cy7</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#101327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#108114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#105820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#128012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#135506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">Cat#560718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td style="width:177px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:172px;">Cat#C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">AutoMACS Separator</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>Use the &#34;deplete&#34; program</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">BD LSRFortessa</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>5 lasers, 15 colors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">BD FACS Aria III cell sorter</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>5 lasers, 13 colors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">FlowJo</td>
			<td style="width:177px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:172px;">https://www.flowjo.com</td>
			<td>For further analysis of the .fcs files</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification and isolation of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from mouse bone marrow

माइलॉयड progenitors कि उपज न्यूट्रोफिल, monocytes और वृक्ष कोशिकाओं (dc) में पहचाना जा सकता है और रक्त और प्रतिरक्षा विश्लेषण के लिए चूहों की अस्थि मज्जा से अलग । उदाहरण के लिए, सेलुलर और माइलॉयड जनक आबादी की आणविक संपत्तियों के अध्ययन ल्यूकेमिया से प्रभावित परिवर्तन, या प्रदर्शन कैसे प्रतिरक्षा प्रणाली रोगजनक जोखिम का जवाब देने के लिए अंतर्निहित तंत्र प्रकट कर सकते हैं । पहले वर्णित माइलॉयड जनक पहचान के लिए प्रवाह cytometry रणनीतियों कई क्षेत्रों में महत्वपूर्ण प्रगति सक्षम है, लेकिन अंशों वे की पहचान बहुत विषम हैं । सबसे अधिक इस्तेमाल किया गेटिंग रणनीतियों अस्थि मज्जा भिन्न है कि वांछित आबादी के लिए समृद्ध कर रहे हैं को परिभाषित, लेकिन यह भी "दूषित" progenitors की बड़ी संख्या में होते हैं. हमारे हाल के अध्ययनों से इस विविधता का ज्यादा हल किया है, और प्रोटोकॉल हम यहां मौजूद oligopotent और वंश की 6 उपआबादी के अलगाव की अनुमति-2 से प्रतिबद्ध माइलॉयड progenitors पहले अस्थि मज्जा भिंन वर्णित है । प्रोटोकॉल 3 चरणों का वर्णन करता है: 1) अस्थि मज्जा कोशिकाओं के अलगाव, 2) टेम progenitors के लिए संवर्धन चुंबकीय द्वारा सक्रिय कोशिका छँटाई (एमएसीएस द्वारा वंश कमी), और 3) (सहित) प्रवाह cytometry द्वारा माइलॉयड जनक उपसमुच्चय की पहचान प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष छँटाई, FACS, यदि वांछित). इस दृष्टिकोण जनक ठहराव और अलगाव की एक किस्म के लिए इन विट्रो और vivo अनुप्रयोगों में अनुमति देता है, और पहले से ही रास्ते और न्युट्रोफिल, monocyte, और डीसी भेदभाव के तंत्र में उपंयास अंतर्दृष्टि झुकेंगे ।

प्रोटोकॉल का प्रयोग ऊपर वर्णित है, यह ~ १००,०००,००० कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए संभव है (लाल रक्त कोशिकाओं, या ~ ५०,०००,००० nucleated कोशिकाओं सहित) दोनों femurs और tibias (एक C57BL/6J माउस के 2 पैर) से (6-8 सप्ताह पु...

Watch this Scientific Journal Video about Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow at JoVE.com

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

हम कैसे पहचान करने के लिए और murine अस्थि मज्जा से माइलॉयड progenitors के 6 सबसेट चुंबकीय और प्रतिदीप्ति छंटाई (एमएसीएस और FACS) का एक संयोजन का उपयोग कर अलग करने के लिए प्रदर्शित करता है । इस प्रोटोकॉल के लिए इन विट्रो संस्कृति परख (methylcellulose या तरल संस्कृतियों) में इस्तेमाल किया जा सकता है, vivo adoption हस्तांतरण प्रयोगों में , और आरएनए/

पहचान और Oligopotent और वंश की अलगाव-प्रतिबद्ध माइलॉयड Progenitors से माउस अस्थि मज्जा

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

This method could be helpful for hematologists and immunologists studying the production and function of myeloid cells, including neutrophils, monocytes, and dendritic cells. The main advantage of this technique is that it enables more precise identification of myeloid progenitor subsets than previous strategies. To enrich bone marrow cells for progenitors by magnetic-activated cell sorting, or MACS, pellet the cells by centrifugation and resuspend the pellet in 40 microliters of MACS staining buffer per one times 10 to the seven bone marrow cells.To deplete differentiated lineage positive cells, add 10 microliters of biotin antibody cocktail per one times 10 to the seven cells and to mix by pipetting for a 10 minute incubation at four degrees Celsius. At the end of the incubation, add 30 microliters of staining buffer per one times 10 to the seven cells with mixing, followed by 20 microliters of anti-biotin microbeads per one times 10 to the seven cells. After 15 minutes at four degrees Celsius, wash the cells with one milliliter of staining buffer per one times 10 to the seven cells and resuspend the pellet in 500 microliters of fresh staining buffer for up to one times 10 to the eight cells.Next, set up the automated magnetic separator according to the manufacturer's instructions and place the tube of labeled cells into the separator. Begin the negative selection program to collect the negative fraction which contains the progenitor enriched lineage negative cells. Pellet the lineage negative cells by centrifugation and resuspend the pellet, which is now white, in two milliliters of staining buffer per mouse for counting.To isolate the myeloid progenitor cells by FACS, add one times 10 to the fifth lineage negative cells to each of eight control microcentrifuge tubes for voltage selection and color compensation and add the rest of the cell sample to a ninth microcentrifuge tube for staining with all seven of the surface marker antibodies of interest for progenitor identification and sorting. Pellet the cells by centrifugation and resuspend the control pellets in 100 microliters of FACS staining buffer and the experimental sample pellet in 100 microliters of staining buffer per five times 10 to the six cells. Next, add anti-CD16/CD32 antibody to the Fc gamma receptor single stain tube and the sample tube.Vortex gently and incubate the samples for 10 minutes at four degrees Celsius. At the end of the incubation, add the other antibodies to the appropriate corresponding single stain tubes and to the sample tube and after gentle vortexing, incubate the samples for 15 minutes at four degrees Celsius. At the end of the incubation, add 900 microliters of staining buffer to the control tubes and one milliliter of staining buffer per one times 10 to the seven cells to the sample tube for centrifugation.Resuspend the control pellets in 200 microliters of fresh staining buffer per tube and the experimental pellet in 500 microliters per 2.5 times 10 to the seven cells and transfer the labeled cells to individual corresponding five milliliter FACS tubes. Then set up the flow cytometer according to standard protocols and use the unstained and single stained controls to set the voltages and the color compensations. To identify and isolate the myeloid progenitor cells, load the experimental cell sample onto the cytometer and create a forward scatter area versus side scatter area plot, gating to exclude the debris and dead cells.Create a forward scatter height versus forward scatter width plot of the live cells and gate to exclude the doublets. Repeat this process with a side scatter height versus side scatter width plot of the forward scatter singlets and gate to exclude the doublets. Create a Sca-1 versus c-Kit plot and gate to select the c-Kit positive Sca-1 negative progenitors.Then create a CD-34 versus FC gamma receptor plot and gate to select the mixed common myeloid progenitor and mixed granulocyte monocyte progenitor populations. It's important to gate the mixed common myeloid progenitor and mixed granulocyte monocyte progenitor populations as precisely as possible. It can be helpful to use a pseudo-color density plot or a contour plot for more accurate gating.Use the cells in the mixed common myeloid progenitor gate to create a CD115 versus Flt3 plot and gate to select the common myeloid progenitor Flt3 positive CD115 low cells, the common myeloid progenitor Flt3 negative CD115 low cells, and the Flt3 positive CD115 high monocyte dendritic cell progenitors. Use the cells in the mixed granulocyte monocyte progenitor gate to create a Ly6C versus FC Gamma receptor plot and gate to select the Ly6C negative cells and the Ly6C positive cells. Then create a CD115 versus Flt3 plot for each gated mixed granulocyte monocyte progenitor cell subpopulation and gate the Ly6C negative Flt3 negative CD115 low granulocyte monocyte progenitors, the Ly6C positive Flt3 negative CD115 low granulocyte progenitors, and the Ly6C positive Flt3 negative CD115 high monocyte progenitors.Max lineage depletion is efficient at depleting differentiated cells and for enriching for the c-Kit positive progenitor cells. The lineage negative fraction does still contain some c-Kit negative cells, but these cells will be eliminated in subsequent flow cytometry gating steps. Progenitor yields after FACS sorting can vary depending on the sorter settings used, but it should be possible to obtain between one to four times 10 to the fourth cells per fraction from each mouse with a post-sort purity of greater than 95%for each fraction.Good staining is critical for clean separation of the populations. You may need to titrate the antibodies or choose different fluorophores to ensure optimal separation. This protocol can be used to identify progenitor cells to assess differences in bone marrow composition between samples, to isolate progenitors for molecular analysis or to assess their ability to produce myeloid cells.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

अलगाव, शोधन और कार्यात्मक अध्ययन और दत्तक स्थानांतरण प्रयोगों के लिए माउस अस्थि मज्जा न्यूट्रोफिल का लेबल

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

मानव थाइमस से माइलॉयड वृक्ष के समान कोशिकाओं और उपकला कोशिकाओं का अलगाव

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

अस्थि मैक्रोफेज उत्पादन मज्जा व्युत्पन्न

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

अलगाव और murine अस्थि मज्जा की नसों में इंजेक्शन व्युत्पन्न Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

माउस अस्थि मज्जा Monocytes ट्रैकिंग<em&gt; Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

माउस त्वचा और draining लिम्फ नोड से माइलॉयड सेल अलगाव लाइव तनु के साथ intradermal टीकाकरण के बाद<em&gt; प्लाज्मोडियम</em&gt; स्पोरोजोएट्स

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Murine हिंद अंग लंबी हड्डी विच्छेदन और अस्थि मज्जा अलगाव

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

जनरेशन और जीएम-सीएसएफ की पहचान व्युत्पन्न वायुकोशीय तरह मैक्रोफेज और वृक्ष के समान माउस अस्थि मज्जा से कोशिकाओं

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

माउस अस्थि मज्जा से Plasmacytoid वृक्ष के समान कोशिकाओं की शुद्धि के लिए प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटनी

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

एक उपंयास सेल छँटाई रणनीति का उपयोग कर Murine अस्थि मज्जा से माइलॉयड Progenitors और वृक्ष सेल पुरोगामी की बड़ी संख्या की पीढ़ी

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...