Name: identification and isolation of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from mouse bone marrow
Uploaded: 2018-07-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow at JoVE.com

Questo protocollo è stato sviluppato utilizzando fondi dal Consiglio dei governatori rigenerativa medicina Institute al Cedars-Sinai Medical Center (HSG), una carriera in comunione di immunologia dal Associazione americana di immunologi (a AY e HSG) e un Scholar Award da la società americana di Ematologia (di AY). Ringraziamo il nucleo di Cytometry di flusso al Cedars-Sinai Medical Center per assistenza con l'ordinamento FACS.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) del Cedars-Sinai Medical Center.
1. isolamento del midollo osseo di topo e preparazione di una sospensione singola cella
<ol><li>Eutanasia il mouse secondo le linee guida istituzionali.</li>
	<li>Posizionare il mouse eutanasizzato sul dorso e spruzzarlo con 70% di etanolo (EtOH). Praticare un'incisione di piccolo (3-5 mm) in ogni arto presso la caviglia livello utilizzando sharp, forbici a...

<ol>
	<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRF8+acts+in+lineage-committed+rather+than+oligopotent+progenitors+to+control+neutrophil+vs+monocyte+production.">IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production.</a> Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).</li><li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX3CR1++CD115++CD135++common+macrophage/DC+precursors+and+the+role+of+CX3CR1+in+their+response+to+inflammation.">CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).</li><li>Fogg, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+bone+marrow+progenitor+specific+for+macrophages+and+dendritic+cells.">A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells.</a> Science. 311 (5757), 83-87 (2006).</li><li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clonogenic+common+Flt3+M-CSFR++plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow.">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).</li><li>Hettinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+monocytes+and+macrophages+in+a+committed+progenitor.">Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor.</a> Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte-monocyte+progenitors+and+monocyte-dendritic+cell+progenitors+independently+produce+functionally+distinct+monocytes.">Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes.</a> Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).</li><li>Olsson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+mixed-lineage+states+leading+to+a+binary+cell+fate+choice.">Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice.</a> Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).</li><li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation.">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+regulatory+factor+8+and+the+regulation+of+neutrophil,+monocyte,+and+dendritic+cell+production.">Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production.</a> Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).</li><li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors.">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).</li></ol>

Weissman gating strategia per mouse progenitrici mieloidi identificazione1 è stato il gold standard per gli immunologi ed ematologi per quasi 20 anni, ma ora è evidente che i cancelli "CMP" e "GMP" sono molto eterogenei e più preciso sono necessarie strategie di Gate. Il protocollo che abbiamo descritto qui consenta l'identificazione dell'oligopotent e dei sottoinsiemi di lignaggio-commesso in topi C57BL/6J per più precisa quantificazione dei progenitori mieloidi specifici e mappatura delle vi...

Monociti, neutrofili e cellule dendritiche (DCs) sono cellule mieloidi che derivano da progenitori ematopoietici, principalmente nel midollo osseo, tramite un processo chiamato mielopoiesi. Comune dei progenitori mieloidi (CMPs) hanno il potenziale per produrre cellule mieloidi, come pure i megacariociti ed eritrociti, ma cellule non linfoidi. Progenitori del granulocyte-monocito (GMP), che sono derivati da CMPs, producono di granulociti e monociti, ma hanno perso dei megacariociti e potenziali dell'eritrocito. Monociti e classica e plasmacytoid DCs (cDCs/PDC) sono anche pensato di derivano da progenitori comuni, noti come progenitori del monocito-DC (MDPs), che sono prodotte da CMPs. graduale limitazione del potenziale di lignaggio infine provoca lignaggio-commesso progenitori: progenitori granulociti, monociti progenitori e dei progenitori delle cellule dendritiche (Figura 1).
Weissman e colleghi ha riferito che CMPs si trovano in Lin– c-Kit+ Sca-1– CD34 (LKS–)+ FcγRlo frazione del midollo osseo di topo, mentre le GMP sono contenute nel CD34 LKS– + FcγR Ciao frazione1. Tuttavia, queste frazioni "CMP" e "GMP" sono molto eterogenee. Per esempio, la frazione "GMP" contiene anche dei progenitori del granulocyte lignaggio-commessi e monocito progenitori1,2. MDPs separatamente sono stati segnalati per essere CX3CR1+ Flt3+ CD115+ progenitori che inoltre esprimono CD34 e FcγR3,4. MDPs danno luogo a cDC/pDC-produzione comune DC progenitori (CDP), che sono stati segnalati per esprimere più bassi livelli di c-Kit (CD117) e non sono inclusi nella frazione LKS– 5.
Si è precedentemente ipotizzato che monociti derivano attraverso una singola via (CMP-GMP-MDP-monocito). Coerente con questo modello, monocito-commesso dei progenitori prodotto da PGM (denominato progenitori del monocito, MPs)2 e MDPs (denominato comuni progenitori del monocito, cMoPs)6 sembrano essere le stesse celle sulla base dell'espressione dei marker di superficie condivisa . Tuttavia, abbiamo recentemente dimostrato che monociti sono prodotte in modo indipendente da GMPs e MDPs e sono stati in grado di distinguere tra MPs e cMoPs di cella singola sequenziamento del RNA,7.
Abbiamo recentemente modificato il Weissman "CMP" e "GMP" gating strategia per identificare 6 subfractions del midollo osseo di topo C57BL/6J contenente diversi oligopotent e sottoinsiemi di lignaggio-commesso progenitrici mieloidi. Abbiamo segnalato prima che la macchiatura per Ly6C e CD115 consente l'isolamento di GMPs oligopotent, così come di progenitori del granulocyte (GPs) e di progenitori del monocito (MPs e cMoPs, che siamo attualmente in grado di separare) dalla frazione "GMP"2 (LKS - CD34+ FcγRCiao cancello; Figura 1). Abbiamo successivamente dimostrato che MDPs si trovano principalmente nella frazione "CMP" (CD34 LKS– + FcγRlo cancello), che contiene anche Flt3+ CD115lo e Flt3– sottoinsiemi7 (Figura 1 ). Il CMP-Flt3+ CD115lo frazione rendimenti sia GMPs e MDPs su trasferimento adottivo. Il sottoinsieme di CMP-Flt3– contiene dei progenitori che sembrano essere intermedi tralo cellule CD115 CMP-Flt3+ e GMP. A differenza di MDPs, CMP-Flt3+ CD115lo sia il CMP-Flt3– frazioni anche possiedono megacariocita e potenziali dell'eritrocito.
È importante notare, tuttavia, che non è attualmente chiaro se le frazioni "CMP" contengono progenitori che sono veramente oligopotent (ad es., cellule individuali all'interno del CMP-Flt3+ CD115lo frazione che possiedono dei neutrofili, monociti, DC, megacariocita e potenziali dell'eritrocito), o in alternativa, comprendono una miscela di progenitori con più limitato potenziale di lignaggio. Colonie del saggi (culture metilcellulosa) ha rivelato le cellule con potenziale megacariocita (cellule di GEMM) in "CMP", dell'eritrocito, monociti e granulociti (neutrofili) CMP-Flt3+ CD115lo e frazioni di CMP-Flt3– 1 ,7, ma non consentono la valutazione del potenziale di DC. Al contrario, Colonia formando le analisi ha dimostrato l'esistenza di oligopotent PGM (progenitori con neutrofili e monociti potenziali) in "GMP" frazione1,2, e questo è supportato da recenti unicellulare di analisi trascrittomica8. Non è attualmente noto, tuttavia, se questi PGM oligopotent produrre anche altri granulociti (eosinofili, basofili e mastociti).
Sulla base di questi studi, ora dimostriamo come 7 marcatori (c-Kit, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C e CD115) di superficie può essere utilizzato per identificare e isolare questi 6 sottogruppi della oligopotent e dei progenitori mieloidi lignaggio-commesso. Il protocollo descritto qui può essere applicato per i test di cultura in vitro (colture di metilcellulosa o liquido), esperimenti di trasferimento adottivo in vivo in topi e l'analisi molecolare (sequenziamento di RNA alla rinfusa e a cella singola, Western blotting, ecc).
Il protocollo consiste di 3 fasi: 1) preparazione di una sospensione di singola cellula del midollo osseo cellule, 2) arricchimento di progenitori ematopoietici (ordinamento magnetico-attivata delle cellule) e 3) l'identificazione e l'isolamento se lo si desidera, dei sottoinsiemi di cellule progenitrici di flusso cytometry (utilizzando un analizzatore o un fascicolatore, come appropriato). Il primo passo è l'isolamento delle cellule del midollo osseo dai femori e le tibie di topi eutanasizzati ed è simile ad altri protocolli precedentemente descritti9. Successivamente, il campione si arricchisce per cellule staminali e progenitrici usando un cocktail di anticorpi contro gli indicatori di superficie delle cellule di eritrociti, i neutrofili, monociti, linfociti, ecc., per vuotare le cellule differenziate. Questo non è obbligatorio, ma fortemente consigliato per ottimizzare il rilevamento dei sottoinsiemi progenitore e per ridurre la quantità di anticorpi necessari per l'identificazione di cellule progenitrici e il tempo necessario per citometria a flusso. Il protocollo di deplezione di lignaggio qui sotto descrive l'ordinamento delle cellule Magnetic-Activated (MACS) utilizzando un Kit di svuotamento di Mouse Lineage delle cellule (che contiene anticorpi biotinilati CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4 e Ter-119, plus anti-biotina microsfere) e un separatore magnetico automatizzato. Il passo finale è l'individuazione (e l'ordinamento, se lo si desidera) dei sottoinsiemi progenitore tramite flusso cytometry. Il pannello di anticorpi descritti di seguito (Vedi anche tabella 1) è stato progettato per essere utilizzato in un citometro a flusso (analizzatore o selezionatore) con 4 laser (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58061/58061fig1.jpg"> Figura 1: vie di differenziazione e progenitori dei neutrofili, monociti e DC. Il modello recentemente riveduto della mielopoiesi7 è illustrato, con i cancelli di Weissman per "CMP" (blu) e "PGM" (verde)1 sovrapposti. Questa figura è stata modificata da Yáñez et al 20177. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58061/58061fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="945">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2)</td>
			<td style="width:177px;">The Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:172px;">Cat#JAX:000664</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:172px;">Cat#130-090-858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">Cat#553733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse CD16/CD32 (Fc&#947;R; clone 93) APC-Cy7</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#101327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#108114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#105820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#128012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#135506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">Cat#560718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td style="width:177px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:172px;">Cat#C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">AutoMACS Separator</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>Use the &#34;deplete&#34; program</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">BD LSRFortessa</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>5 lasers, 15 colors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">BD FACS Aria III cell sorter</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>5 lasers, 13 colors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">FlowJo</td>
			<td style="width:177px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:172px;">https://www.flowjo.com</td>
			<td>For further analysis of the .fcs files</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification and isolation of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from mouse bone marrow

Progenitori mieloidi che producono neutrofili, monociti e cellule dendritiche (DCs) possono essere identificati e isolati dal midollo osseo di topi per analisi ematologiche ed immunologiche. Ad esempio, studi delle proprietà molecolari e cellulari delle popolazioni di cellule progenitrici mieloidi possono rivelare meccanismi sottostanti la trasformazione leucemica o dimostrare come il sistema immunitario risponde all'esposizione di agente patogeno. In precedenza strategie di citometria a flusso descritto per l'identificazione di cellule progenitrici mieloidi hanno permesso significativi progressi in molti campi, ma le frazioni che identificano sono molto eterogenee. Le strategie più comunemente usate di Gate definiscono frazioni del midollo osseo che sono arricchite per le popolazioni desiderate, ma contengono anche un numero elevato di "contaminare" progenitori. Nostri studi recenti hanno risolto gran parte di questa eterogeneità e il protocollo che presentiamo qui consente l'isolamento 6 sottopopolazioni di oligopotent e dei progenitori mieloidi lignaggio-commessi da 2 precedentemente descritto frazioni del midollo osseo. Il protocollo descrive 3 fasi: 1) l'isolamento del midollo osseo cellule, 2) arricchimento di progenitori ematopoietici di ordinamento magnetico-attivata delle cellule (svuotamento di stirpe di MACS) e 3) identificazione dei sottoinsiemi di cellule progenitrici mieloidi mediante citometria a flusso (tra cui fluorescenza-attivato cella ordinamento, FACS, se lo si desidera). Questo approccio consente la quantificazione di progenitore e isolamento per una varietà di applicazioni in vitro e in vivo e ha già dato romanzo insight sulle vie e sui meccanismi di neutrofili, monociti e differenziazione delle DC.

Utilizzando il protocollo descritto in precedenza, è possibile ottenere cellule 100 milioni (compresi i globuli rossi, o 50 milioni di cellule nucleate) da entrambi i femori e tibie (2 gambe) di un mouse C57BL/6J (6-8 settimane vecchie, maschile o femminile). 1-2 milioni Lin– cellule possono essere isolate per topo da svuotamento di MACS delle cellule Lin+ .
Ognuno dei 6 sottoinsiemi progenitrici mieloid...

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Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Dimostriamo come identificare e isolare 6 sottoinsiemi dei progenitori mieloidi dal midollo osseo murino utilizzando una combinazione di magnetico e fluorescenza ordinamento (MACS e FACS). Questo protocollo può essere usato per analisi di RNA/proteine, in vivo gli esperimenti di trasferimento adottivo e saggi di cultura in vitro (colture di metilcellulosa o liquido).

Identificazione e isolamento di Oligopotent e dei progenitori mieloidi Lineage-commesso dal midollo osseo del topo

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

This method could be helpful for hematologists and immunologists studying the production and function of myeloid cells, including neutrophils, monocytes, and dendritic cells. The main advantage of this technique is that it enables more precise identification of myeloid progenitor subsets than previous strategies. To enrich bone marrow cells for progenitors by magnetic-activated cell sorting, or MACS, pellet the cells by centrifugation and resuspend the pellet in 40 microliters of MACS staining buffer per one times 10 to the seven bone marrow cells.To deplete differentiated lineage positive cells, add 10 microliters of biotin antibody cocktail per one times 10 to the seven cells and to mix by pipetting for a 10 minute incubation at four degrees Celsius. At the end of the incubation, add 30 microliters of staining buffer per one times 10 to the seven cells with mixing, followed by 20 microliters of anti-biotin microbeads per one times 10 to the seven cells. After 15 minutes at four degrees Celsius, wash the cells with one milliliter of staining buffer per one times 10 to the seven cells and resuspend the pellet in 500 microliters of fresh staining buffer for up to one times 10 to the eight cells.Next, set up the automated magnetic separator according to the manufacturer's instructions and place the tube of labeled cells into the separator. Begin the negative selection program to collect the negative fraction which contains the progenitor enriched lineage negative cells. Pellet the lineage negative cells by centrifugation and resuspend the pellet, which is now white, in two milliliters of staining buffer per mouse for counting.To isolate the myeloid progenitor cells by FACS, add one times 10 to the fifth lineage negative cells to each of eight control microcentrifuge tubes for voltage selection and color compensation and add the rest of the cell sample to a ninth microcentrifuge tube for staining with all seven of the surface marker antibodies of interest for progenitor identification and sorting. Pellet the cells by centrifugation and resuspend the control pellets in 100 microliters of FACS staining buffer and the experimental sample pellet in 100 microliters of staining buffer per five times 10 to the six cells. Next, add anti-CD16/CD32 antibody to the Fc gamma receptor single stain tube and the sample tube.Vortex gently and incubate the samples for 10 minutes at four degrees Celsius. At the end of the incubation, add the other antibodies to the appropriate corresponding single stain tubes and to the sample tube and after gentle vortexing, incubate the samples for 15 minutes at four degrees Celsius. At the end of the incubation, add 900 microliters of staining buffer to the control tubes and one milliliter of staining buffer per one times 10 to the seven cells to the sample tube for centrifugation.Resuspend the control pellets in 200 microliters of fresh staining buffer per tube and the experimental pellet in 500 microliters per 2.5 times 10 to the seven cells and transfer the labeled cells to individual corresponding five milliliter FACS tubes. Then set up the flow cytometer according to standard protocols and use the unstained and single stained controls to set the voltages and the color compensations. To identify and isolate the myeloid progenitor cells, load the experimental cell sample onto the cytometer and create a forward scatter area versus side scatter area plot, gating to exclude the debris and dead cells.Create a forward scatter height versus forward scatter width plot of the live cells and gate to exclude the doublets. Repeat this process with a side scatter height versus side scatter width plot of the forward scatter singlets and gate to exclude the doublets. Create a Sca-1 versus c-Kit plot and gate to select the c-Kit positive Sca-1 negative progenitors.Then create a CD-34 versus FC gamma receptor plot and gate to select the mixed common myeloid progenitor and mixed granulocyte monocyte progenitor populations. It's important to gate the mixed common myeloid progenitor and mixed granulocyte monocyte progenitor populations as precisely as possible. It can be helpful to use a pseudo-color density plot or a contour plot for more accurate gating.Use the cells in the mixed common myeloid progenitor gate to create a CD115 versus Flt3 plot and gate to select the common myeloid progenitor Flt3 positive CD115 low cells, the common myeloid progenitor Flt3 negative CD115 low cells, and the Flt3 positive CD115 high monocyte dendritic cell progenitors. Use the cells in the mixed granulocyte monocyte progenitor gate to create a Ly6C versus FC Gamma receptor plot and gate to select the Ly6C negative cells and the Ly6C positive cells. Then create a CD115 versus Flt3 plot for each gated mixed granulocyte monocyte progenitor cell subpopulation and gate the Ly6C negative Flt3 negative CD115 low granulocyte monocyte progenitors, the Ly6C positive Flt3 negative CD115 low granulocyte progenitors, and the Ly6C positive Flt3 negative CD115 high monocyte progenitors.Max lineage depletion is efficient at depleting differentiated cells and for enriching for the c-Kit positive progenitor cells. The lineage negative fraction does still contain some c-Kit negative cells, but these cells will be eliminated in subsequent flow cytometry gating steps. Progenitor yields after FACS sorting can vary depending on the sorter settings used, but it should be possible to obtain between one to four times 10 to the fourth cells per fraction from each mouse with a post-sort purity of greater than 95%for each fraction.Good staining is critical for clean separation of the populations. You may need to titrate the antibodies or choose different fluorophores to ensure optimal separation. This protocol can be used to identify progenitor cells to assess differences in bone marrow composition between samples, to isolate progenitors for molecular analysis or to assess their ability to produce myeloid cells.

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Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Mieloide isolamento delle cellule da topo pelle e drenante linfonodi seguito intradermica immunizzazione con vivo attenuato<em&gt; Plasmodium</em&gt; sporozoiti

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Murino arto posteriore osso lungo dissezione e isolamento di midollo osseo

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Generazione e identificazione di GM-CSF Derivato alveolo-come macrofagi e dendritiche cellule da midollo osseo di topo

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Separazione delle cellule fluorescenza-attivato per la purificazione delle cellule dendritiche plasmacitoidi dal midollo osseo di topo

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Generazione di un gran numero di progenitori mieloidi e precursori delle cellule dendritiche dal midollo osseo murino utilizzando una romanzo cella ordinamento strategia

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...