Name: identification and isolation of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from mouse bone marrow
Uploaded: 2018-07-29T15:00:00
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このプロトコルは、(AY、HSG し)、免疫学者のアメリカの協会から免疫学フェローシップのキャリアおよび学者賞 (HSG) にボードの知事再生医学研究所からヒマラヤスギ シナイ医療センターで資金を使用して開発されました。(AY) に血液学のアメリカの社会。FACS の並べ替えと支援ありがとうヒマラヤスギ シナイ医療センターで流れ Cytometry コア。

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ヒマラヤスギ シナイの医療センターによって承認されました。
1. 分離マウス骨髄と単一細胞懸濁液の調製
<ol><li>制度のガイドラインに従ってマウスを安楽死させます。</li>
	<li>その裏に euthanized マウスを置き、70% エタノール (エタノール) をスプレーします。鋭い、先の尖ったはさみ、足から?...

<ol>
	<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRF8+acts+in+lineage-committed+rather+than+oligopotent+progenitors+to+control+neutrophil+vs+monocyte+production.">IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production.</a> Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).</li><li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX3CR1++CD115++CD135++common+macrophage/DC+precursors+and+the+role+of+CX3CR1+in+their+response+to+inflammation.">CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).</li><li>Fogg, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+bone+marrow+progenitor+specific+for+macrophages+and+dendritic+cells.">A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells.</a> Science. 311 (5757), 83-87 (2006).</li><li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clonogenic+common+Flt3+M-CSFR++plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow.">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).</li><li>Hettinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+monocytes+and+macrophages+in+a+committed+progenitor.">Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor.</a> Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte-monocyte+progenitors+and+monocyte-dendritic+cell+progenitors+independently+produce+functionally+distinct+monocytes.">Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes.</a> Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).</li><li>Olsson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+mixed-lineage+states+leading+to+a+binary+cell+fate+choice.">Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice.</a> Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).</li><li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation.">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+regulatory+factor+8+and+the+regulation+of+neutrophil,+monocyte,+and+dendritic+cell+production.">Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production.</a> Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).</li><li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors.">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).</li></ol>

マウス骨髄前駆識別1のための戦略をゲート ワイスマン教授は免疫のゴールド スタンダードと約 20 年間、血液をされているが、それは今"の CMP"と"GMP"ゲート、非常に異質かつ精確であることが明らかゲートの戦略が必要です。我々 はここで記述したプロトコルが特定の骨髄前駆細胞のより正確な定量のイエウサギ経路のマッピングだけでなく、調査の c57bl/6 j マウスの寡能?...

単球、好中球、樹状細胞 (Dc) は、イエウサギと呼ばれるプロセスによって主に骨髄での造血前駆細胞から生じる骨髄系の細胞です。一般的な骨髄前駆細胞 (Cmp の) 骨髄細胞と同様に巨核球、赤血球、ないリンパ様細胞を生成する可能性があります。顆粒球単球前駆細胞 (適性) Cmp から派生した、顆粒球、単球が巨核球と潜在的な赤血球を失っています。単球および古典的な樹状 (cDCs/Pdc) も Cmp 徐々 に分化能の制限の血統で、コミット結果最終的によって作り出される球 DC 前駆細胞 (MDPs) として知られている共通の前駆細胞から生じると考えられている。前駆細胞: 顆粒球前駆細胞、単球前駆細胞、樹状細胞前駆細胞 (図 1)。
ワイズマンと同僚の報告林- c-キットに+ Sca-1- (-以下 LKS) CD34 既に報告がある+ FcγRloの一部マウス骨髄、省は、LKS- CD34 に含まれている間+ FcγRこんにちは分数1。しかし、これらの"の CMP"と"GMP"分数が非常に異質です。たとえば、"GMP"分数には、リネージュ コミット顆粒球前駆細胞と単球前駆細胞1,2も含まれています。CX3CR1 をこと MDPs が別々 に報告された+ Flt3+ CD115+前駆細胞 CD34 と FcγR3、4を表す。MDPs は、cDC/pDC 生産共通 DC 前駆細胞 (Cdp)、c-Kit (CD117) のより低いレベルを表現する報告されてきたを生じ、LKS-一部5には含まれません。
それは従来の単一経路 (CMP-GMP-民主党-単球) 単球が発生する予想。(単球前駆細胞、MPs の名前) 省によって生成されるこのモデル, 単球コミット前駆細胞と一貫性のある2と (一般的な単球前駆細胞、cMoPs の名前) MDPs6共有表面マーカー式に基づいて同一の細胞のように見える.しかし、我々 は最近単球によって生産されているいない独立して省と MDPs、実証、単一細胞 RNA シーケンス7MPs と cMoPs を区別することができた。
最近、c57bl/6 j マウス骨髄異なる寡能性と系統コミットの myeloid 祖先のサブセットを含む 6 亜分画を識別するワイズマン"の CMP"と"GMP"ゲート戦略を変更しました。寡能性省と同様、顆粒球前駆細胞 (GPs) と単球前駆細胞 (MPs および cMoPs は、我々 は現在を区切ることができない) の隔離を可能に Ly6C と CD115 のために汚れることをまず報告"GMP"分数2 (LKS から-CD34+ FcγRこんにちはゲート;図 1)。我々 はその後 MDPs は"の CMP"の割合で主に見られることを実証 (LKS- CD34+ FcγRloゲート)、Flt3 が含まれている+ CD115lo Flt3-サブセット7 (図 1).CMP Flt3+ CD115lo分数は、養子の転送時に適性と MDPs を生成します。CMP Flt3-のサブセットには、CMP Flt3+ CD115lo細胞と省の間の中間体のように見える前駆細胞が含まれています。MDPs とは異なり両方、CMP Flt3+ CD115loおよび CMP Flt3-分数も所有している球および赤血球の潜在的です。
ただし、"の CMP"分数に寡能性 (例えば、個々 のセル CMP Flt3+ CD115lo分数内好中球を所有していることは、本当に前駆細胞が含まれているかどうかは現在のところ明確のことにそれが重要です。単球、DC、巨核球、および潜在的な赤血球)、または、代わりより制限されている血統で、潜在的な前駆細胞の混合物を構成します。コロニー形成アッセイ (セルロース文化) 明らかに細胞顆粒球 (好中球)、赤血球、単球、巨核球潜在的な (ジェム細胞)"CMP"の CMP Flt3+ CD115loと CMP Flt3- 1 、7、直流電位の評価を許可しないが。対照的に、コロニー形成アッセイ"GMP"分数1、2、寡能性適性 (好中球と単球の潜在的な前駆細胞) の存在とこれは最近単一セルによってサポートされてトランスクリプトーム解析8。それは現在知られていない、しかし、これらの寡能性適性はまた他の顆粒球 (好酸球、好塩基球、肥満細胞) を生成するかどうか。
今を示すこれらの研究に基づいて 7 表面のマーカー (cd34 陽性、FcγR、Flt3、Ly6C と CD115 の c キット、Sca-1) 使用でき、寡能性と系列拘束された骨髄前駆細胞のこれらの 6 のサブセットを分離します。体外培養の試金 (セルロースまたは液体文化) のここで説明されているプロトコルを適用ことができますマウス、および分子解析 (バルクで単一細胞の RNA シーケンス、西部にしみが付くこと、の生体内で養子転送実験など)。
プロトコルは 3 つの段階で構成されています: 1) 骨髄の単一細胞懸濁液調製された細胞、2) (磁気活性化細胞ソーティング)、造血前駆細胞、3) 識別、および分離の流れによって前駆細胞サブセットの望まれた場合の濃縮フローサイトメトリー (適切なアナライザーまたは、ソーターを使用)。最初のステップは、大腿骨から骨骨髄細胞の分離と安楽死させたマウスの脛骨、9その他の前述のプロトコルに似ています。次に、サンプルは、幹・前駆細胞の赤血球、好中球、単球、リンパ球などの細胞表面マーカーに対する抗体のカクテルを使用して分化した細胞を破壊するために濃縮されています。これは必須、前駆細胞のサブセットの検出を最適化し、前駆細胞の識別に必要な抗体とフローサイトメトリーに必要な時間の量を低減する強くお勧めします。以下の血統の枯渇プロトコル説明 Magnetic-Activated セルの並べ替え (MAC) のいずれもマウス系統の細胞枯渇キットを使用して (CD5、CD45R ビオチン化抗体が含まれている (B220) テル-119、Gr-1 (Ly6G/C)、7-4、CD11b 反ビオチン プラスマイクロ ビーズ) と自動磁選機。最後のステップは、識別 (と必要な場合、並べ替え) フローサイトメトリーによる前駆細胞サブセットの。抗体パネルが下記 4 レーザーで流れの cytometer (アナライザーまたは選別機) で使用する設計されています (テーブル 1を参照してください) (405 488 nm nm、561 nm、640 nm)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58061/58061fig1.jpg"> 図 1: 好中球、単球および DC 前駆細胞と分化経路。"Cmp"(青)、「適性」(グリーン)1オーバーレイ ワイズマン ゲート イエウサギ7の最近改正されたモデルを示します。この図は、ヤーニェスら20177から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58061/58061fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="945">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2)</td>
			<td style="width:177px;">The Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:172px;">Cat#JAX:000664</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:172px;">Cat#130-090-858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">Cat#553733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse CD16/CD32 (Fc&#947;R; clone 93) APC-Cy7</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#101327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#108114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#105820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#128012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#135506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">Cat#560718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td style="width:177px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:172px;">Cat#C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">AutoMACS Separator</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>Use the &#34;deplete&#34; program</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">BD LSRFortessa</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>5 lasers, 15 colors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">BD FACS Aria III cell sorter</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>5 lasers, 13 colors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">FlowJo</td>
			<td style="width:177px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:172px;">https://www.flowjo.com</td>
			<td>For further analysis of the .fcs files</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification and isolation of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from mouse bone marrow

好中球、単球や樹状細胞 (Dc) をもたらす骨髄前駆細胞はで識別でき、血液学的および免疫学的解析のためのマウスの骨髄から分離しました。たとえば、骨髄前駆細胞集団の細胞・分子物性研究は白血病変換のメカニズムを明らかにしたり免疫系が病原体に応答する方法を示します。以前の myeloid 祖先識別のため説明流れ cytometry 戦略は、多くの分野で重要な進歩を有効にしているが、彼らを識別する分数は非常に異質。最も一般的に使用されるゲートの戦略目的の集団に濃縮されているもが多数「汚染」の前駆細胞の骨髄分数を定義します。私たちの最近の研究は、この不均一性の多くを解決したし、ここでは提示プロトコル寡能性 6 集団の隔離を可能に前述の 2 系列コミット骨髄前駆細胞骨髄分数。プロトコルは 3 つの段階を記述: 1) 分離骨髄の細胞、2) 磁気活性化細胞ソーティング (MAC で血統の枯渇)、および 3) (を含むフローサイトメトリーによる骨髄系前駆細胞サブセットの識別によって造血前駆細胞の濃縮蛍光活性化細胞選別、FACS、必要な場合)。このアプローチは、前駆の定量化と様々 なin vitroとin vivoのアプリケーションの分離が可能、既に経路と好中球、単球、および DC 分化のメカニズムに新しい洞察力をもたらした。

上記プロトコルを使用して、それは大腿骨から脛骨 (2 脚) 1 つの c57bl/6 j マウス (6-8 週古い、男性または女性) の 1 億の細胞 (赤血球、または 5000 万の有核細胞を含む) を取得することが可能です。1-200 万林-細胞は、Lin+細胞の枯渇を MAC でマウスあたりに分離できます。
6 骨髄前駆細胞サブセットのそれぞれ...

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Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

識別し、並べ替え (MAC および FACS) 蛍光と磁気の組み合わせを使ってマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の 6 のサブセットを分離する方法を示します。このプロトコルは、体外培養の試金 (セルロースまたは液体文化)、養子の転送実験生体内RNA ・ タンパク質解析に使用できます。

寡能性と系列拘束されたマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の分離と同定

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

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