Name: identification and isolation of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from mouse bone marrow
Uploaded: 2018-07-29T15:00:00
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이 프로토콜 (바깥 HSG)를, Immunologists의 미국 협회에서 면역학 화목에서 경력 및 학술 상 수상 (HSG)을 보드의 총재 재생 의학 연구소에서 삼목 시 나이 의료 센터에 자금을 사용 하 여 개발 되었다 (하의) 혈액학의 미국 사회. FACS 정렬 지원에 감사 삼목 시 나이 의료 센터에서 Flow Cytometry 코어 하 고.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 삼목 시 나이 의료 센터에 의해 승인 되었다.
1. 절연 마우스 골 수 및 단일 세포 현 탁 액의 준비
<ol><li>기관 지침에 따라 마우스를 안락사</li>
	<li>그것의 뒤에 안락사 마우스를 놓고 70% 에탄올 (EtOH) 스프레이 합니다. 작은 (3-5 m m) 절 개를 발목 수준 사용에서 각 뒷 다리 사지에 날카로운, 뾰족한가 위, 그리?...

<ol>
	<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRF8+acts+in+lineage-committed+rather+than+oligopotent+progenitors+to+control+neutrophil+vs+monocyte+production.">IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production.</a> Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).</li><li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX3CR1++CD115++CD135++common+macrophage/DC+precursors+and+the+role+of+CX3CR1+in+their+response+to+inflammation.">CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).</li><li>Fogg, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+bone+marrow+progenitor+specific+for+macrophages+and+dendritic+cells.">A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells.</a> Science. 311 (5757), 83-87 (2006).</li><li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clonogenic+common+Flt3+M-CSFR++plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow.">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).</li><li>Hettinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+monocytes+and+macrophages+in+a+committed+progenitor.">Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor.</a> Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte-monocyte+progenitors+and+monocyte-dendritic+cell+progenitors+independently+produce+functionally+distinct+monocytes.">Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes.</a> Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).</li><li>Olsson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+mixed-lineage+states+leading+to+a+binary+cell+fate+choice.">Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice.</a> Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).</li><li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation.">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+regulatory+factor+8+and+the+regulation+of+neutrophil,+monocyte,+and+dendritic+cell+production.">Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production.</a> Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).</li><li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors.">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).</li></ol>

와 이즈 맨 마우스 골수성 조상 식별1 전략 게이팅 immunologists에 대 한 황금 표준 hematologists 거의 20 년 동안 왔지만 그것은 명백한 "CMP"와 "GMP" 게이츠는 매우 이질적인 더 정확한 지금 제어 전략 필요 합니다. 우리는 여기에 설명 된 프로토콜 특정 골수성 창시자의 더 정확한 정량화 및 myelopoiesis 통로 조사에 대 한 C57BL/6J 쥐에 oligopotent 및 계보 커밋된 하위 집합의 식별을 허용 골수?...

Monocytes, 호 중구, 및 모 수석 세포 (DCs)는 주로 골 수에서 조 혈 창시자에서 myelopoiesis 라는 프로세스에 의해 발생 하는 골수성 세포. 일반적인 골수성 창시자 (CMPs) 골수성 세포로 없으며, 적혈구, 하지만 하지 림프 세포 생산 가능성이 있다. CMPs에서 파생 됩니다, granulocyte monocyte 창시자 (GMPs) granulocytes 그리고 monocytes, 생산 하지만 잃은 megakaryocyte 잠재적인 적혈구. Monocytes 그리고 클래식 plasmacytoid Dc (cDCs/Pdc) monocyte DC 창시자 (MDPs), CMPs. 서서히 제한 혈통 잠재력의 궁극적으로 혈통 커밋된 결과 의해 생산으로 알려진 일반적인 창시자에서 발생을 또한 생각 됩니다 창시자: granulocyte 창시자, monocyte 창시자, 및 수지상 세포 창시자 (그림 1).
와 이즈 맨과 동료 보고 CMPs 린- c-키트+ Sca-1- CD34 (LKS-)에서 발견 되는+ FcγRlo 의 분수 마우스 골 수, GMPs LKS- CD34에 포함 하는 동안+ FcγR 안녕하세요 분수1. 그러나, 이러한 "CMP"와 "GMP" 분수는 매우 이질적인. 예를 들어, "GMP" 분수 또한 포함 되어 혈통 커밋된 granulocyte 창시자 monocyte 창시자1,2. MDPs 했다 별도로 보고 CX3CR1+ Flt3+ CD115+ CD34 및 FcγR3,4익스프레스 창시자. MDPs는 cDC/pDC 생산 일반적인 DC 창시자 (Cdp), c-Kit (CD117)의 저수준을 표현 하기 위해 보고 하 고 LKS- 분수5에 포함 되지 않습니다.
그것은 이전 monocytes (CMP-GMP-민주당-monocyte) 단일 경로 통해 발생 간주 되었다. 제작한 GMPs (monocyte 창시자, MPs 라는)이 모델, monocyte 커밋된 창시자와 일치2 및 MDPs (라는 일반적인 monocyte 창시자, cMoPs)6 공유 표면 마커 식에 근거 하 여 동일한 셀 표시 . 그러나, 우리가 최근에 monocytes는 생산 하지 독립적으로 GMPs와 MDPs, 시연 하 고 단일 셀 RNA 시퀀싱7MPs와 cMoPs 사이 구별을 수 있었다.
우리는 최근에 다른 oligopotent 및 골수성 조상 계보 커밋된 하위 집합을 포함 하는 C57BL/6J 마우스 골 수의 6 subfractions 식별 하는 이즈 맨 "CMP" 및 "GMP" 제어 전략 수정. 처음 보고는 oligopotent GMPs granulocyte 창시자 (GPs) 및 monocyte 창시자 (MPs 및 cMoPs, 우리는 현재 별도 수)의 절연을 허용 Ly6C 및 CD115에 대 한 얼룩 "GMP" 분수2 (LKS에서 - CD34+ FcγR안녕하세요 게이트; 그림 1)입니다. 우리는 그 후 MDPs는 주로 "CMP" 분수 있는 시연 (LKS- CD34+ FcγRlo 게이트), 또한 Flt3 포함+ CD115lo 와 Flt3- 하위 집합7 (그림 1 ). CMP Flt3+ CD115lo 분수 입양 전송 시 GMPs와 MDPs를 생성합니다. CMP-Flt3- 하위 집합 CMP Flt3+ CD115lo 셀 사이의 GMPs 중간체 처럼 창시자를 포함 합니다. MDPs, 달리 CMP Flt3+ CD115lo 와 CMP Flt3- 분수 또한가지고 megakaryocyte 및 잠재적인 적혈구.
단, 그 그것은 현재 불분명 여부 "CMP" 분수 정말 oligopotent (예: 개별 셀 CMP Flt3+ CD115lo 분수 내 neutrophil, 소유 하는 창시자를 포함 하는 것이 중요 하다 monocyte, DC, megakaryocyte, 및 잠재적인 적혈구), 또는 양자 택일로, 더 제한 된 혈통 잠재력 창시자의 혼합물을 구성. 분석 실험 (스 문화)를 형성 하는 식민지 공개 셀 granulocyte (호 중구), 적혈구, monocyte와 megakaryocyte 잠재적인 (GEMM 세포) "CMP"에서 CMP Flt3+ CD115lo 분수 CMP Flt3- 1 ,7, 하지만 DC 잠재력의 평가 허용 하지 않습니다. 대조적으로, 분석 실험을 형성 하는 식민지 "GMP" 분수1,2, oligopotent GMPs (neutrophil와 잠재적인 monocyte 창시자)의 존재를 증명 하 고이 최근 단일 셀에 의해 지원 됩니다. transcriptomic 분석8. 그러나 그것은 현재 알 수 없습니다,, 또한 다른 granulocytes (호 산 구는, basophils 그리고 돛대 세포)을 생산 하는이 oligopotent GMPs 여부.
우리 지금 보여주는 이러한 연구에 따라 어떻게 7 표면 마커 (c 키트, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C 및 CD115) 사용할 수 있습니다 식별 하 고 이러한 6 하위 집합 oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자의 분리. 여기에 설명 된 프로토콜 생체 외에서 문화 분석 (스 또는 액체 문화)에 대 한 적용 될 수 있다 vivo에서 입양 전송 실험 쥐, 및 분자 분석 (대량 및 단일 셀 RNA 시퀀싱, 부 럽, 등).
프로토콜 구성 3 단계: 골의 단일 세포 현 탁 액의 준비 1) 세포, 조 혈 창시자 (자석 활성화 된 세포 분류), 및 3) 식별, 격리의 흐름에 의해 조상 하위 집합 원하는 경우 2) 농축 cytometry (또는 사용 하는 분석기는 다소 적절 한). 첫 번째 단계는 화관에서 골 수 세포의 분리 및 안락사 마우스의 tibias 이며 다른 앞에서 설명한 프로토콜9와 비슷합니다. 다음으로, 샘플 줄기와 조상 세포 적혈구, 호 중구, monocytes, lymphocytes, 등 의 세포 표면 표식에 대 한 항 체의 칵테일을 사용 하 여 차별화 된 세포를 고갈에 대 한 농축입니다. 이것은 필수, 하지만 조상 하위 집합의 검색을 최적화 하 고 cytometry에 필요한 시간과 조상 식별에 필요한 항 체의 양을 줄이기 위해 강력 하 게 권장 하지. Magnetic-Activated 셀 정렬 (맥) 마우스 계보 셀 고갈 키트를 사용 하 여 아래 계보 고갈 프로토콜에 설명 합니다 (CD5, CD45R에 대하여 biotinylated 항 체를 포함 된 (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4, 그리고 Ter-119, 안티 비오 틴 플러스 microbeads)와 자동된 자석 분리기. 마지막 단계는 id (및 필요한 경우 정렬) cytometry에 의해 조상 하위 집합의. 항 체 패널 아래에 설명 된 4 레이저 분석기 (다소) 교류 cytometer에서 사용 하도록 설계 되었습니다 ( 표 1참조) (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58061/58061fig1.jpg"> 그림 1: Neutrophil, monocyte와 DC 창시자와 차별화 경로. 와 이즈 맨 게이츠 "CMPs" (파란색)와 "GMPs" (녹색)1 중첩에 대 한 myelopoiesis7 의 최근 수정된 모델은 나와 있습니다. 이 그림은 Yáñez 외. 20177에서 수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58061/58061fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="945">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2)</td>
			<td style="width:177px;">The Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:172px;">Cat#JAX:000664</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:172px;">Cat#130-090-858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">Cat#553733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse CD16/CD32 (Fc&#947;R; clone 93) APC-Cy7</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#101327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#108114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#105820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#128012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#135506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">Cat#560718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td style="width:177px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:172px;">Cat#C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">AutoMACS Separator</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>Use the &#34;deplete&#34; program</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">BD LSRFortessa</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>5 lasers, 15 colors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">BD FACS Aria III cell sorter</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>5 lasers, 13 colors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">FlowJo</td>
			<td style="width:177px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:172px;">https://www.flowjo.com</td>
			<td>For further analysis of the .fcs files</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification and isolation of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from mouse bone marrow

골수성 창시자 호 중구, monocytes 및 모 수석 세포 (DCs)에서 확인 하 고 혈액 및 면역 분석에 대 한 생쥐의 골 수에서 분리 수 있습니다. 예를 들어 골수성 조상 인구의 세포 및 분자 속성의 연구 leukemic 변환, 기본 메커니즘을 밝힐 수 또는 면역 시스템 병원 체 노출에 응답 하는 방법을 보여 줍니다. 이전 많은 분야에서 상당한 진보를 사용 하는 골수성 조상 식별에 대 한 설명된 흐름 cytometry 전략 하지만 그들을 식별 하는 분수는 아주 이질적인. 가장 일반적으로 사용 되는 제어 전략 정의 골 분수 원하는 인구에 대 한 풍성 하 게 하지만 또한 "오염" 창시자의 많은 수를 포함 합니다. 우리의 최근 학문이이 많이 해결 선물이 여기 프로토콜 oligopotent의 6 부분 모집단의 격리를 허용 하 고 혈통 커밋된 골수성 창시자 2에서 설명한 골 분수. 3 단계는 프로토콜에 설명 합니다: 1) 절연 골 수의 세포, 2) 농축 조 혈 창시자 자기 활성화 셀 정렬 (맥에 의해 혈통 소모), 및 3) 식별 골수성 조상 cytometry (를 포함 하 여 하위 집합에 대 한 형광 활성화 된 세포 분류, FACS, 원하는 경우). 이 이렇게 조상 정량화 및 생체 외에서 그리고 vivo에서 응용 프로그램의 다양 한 절연을 허용 하 고 경로 및 neutrophil, monocyte, 및 DC 차별화의 메커니즘에 새로운 통찰력을 나왔고 이미 있다.

위에서 설명한 프로토콜을 사용 하 여, 그것은 화관과 한 C57BL/6J 마우스 (6-8 주 오래 된, 남성 또는 여성)의 tibias (2 다리)에서 ~ 100 백만 세포 (적혈구, 또는 ~ 50 백만 nucleated 세포를 포함 하 여)를 얻을 수 있습니다. 1-2 백만 린- 셀 린+ 세포의 맥 고갈 마우스 당 격리할 수 있습니다.
6 골수성 조상 하위 집합의 각 ?...

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Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

식별 하 고 자석의 조합 및 형광 정렬 (맥 및 FACS)를 사용 하 여 murine 골에서 골수성 창시자의 6 하위 집합을 격리 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 생체 외에서 문화 분석 (스 또는 액체 문화), 입양 전송 실험 vivo에서 및 RNA/단백질 분석에 대 한 사용할 수 있습니다.

식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

This method could be helpful for hematologists and immunologists studying the production and function of myeloid cells, including neutrophils, monocytes, and dendritic cells. The main advantage of this technique is that it enables more precise identification of myeloid progenitor subsets than previous strategies. To enrich bone marrow cells for progenitors by magnetic-activated cell sorting, or MACS, pellet the cells by centrifugation and resuspend the pellet in 40 microliters of MACS staining buffer per one times 10 to the seven bone marrow cells.To deplete differentiated lineage positive cells, add 10 microliters of biotin antibody cocktail per one times 10 to the seven cells and to mix by pipetting for a 10 minute incubation at four degrees Celsius. At the end of the incubation, add 30 microliters of staining buffer per one times 10 to the seven cells with mixing, followed by 20 microliters of anti-biotin microbeads per one times 10 to the seven cells. After 15 minutes at four degrees Celsius, wash the cells with one milliliter of staining buffer per one times 10 to the seven cells and resuspend the pellet in 500 microliters of fresh staining buffer for up to one times 10 to the eight cells.Next, set up the automated magnetic separator according to the manufacturer's instructions and place the tube of labeled cells into the separator. Begin the negative selection program to collect the negative fraction which contains the progenitor enriched lineage negative cells. Pellet the lineage negative cells by centrifugation and resuspend the pellet, which is now white, in two milliliters of staining buffer per mouse for counting.To isolate the myeloid progenitor cells by FACS, add one times 10 to the fifth lineage negative cells to each of eight control microcentrifuge tubes for voltage selection and color compensation and add the rest of the cell sample to a ninth microcentrifuge tube for staining with all seven of the surface marker antibodies of interest for progenitor identification and sorting. Pellet the cells by centrifugation and resuspend the control pellets in 100 microliters of FACS staining buffer and the experimental sample pellet in 100 microliters of staining buffer per five times 10 to the six cells. Next, add anti-CD16/CD32 antibody to the Fc gamma receptor single stain tube and the sample tube.Vortex gently and incubate the samples for 10 minutes at four degrees Celsius. At the end of the incubation, add the other antibodies to the appropriate corresponding single stain tubes and to the sample tube and after gentle vortexing, incubate the samples for 15 minutes at four degrees Celsius. At the end of the incubation, add 900 microliters of staining buffer to the control tubes and one milliliter of staining buffer per one times 10 to the seven cells to the sample tube for centrifugation.Resuspend the control pellets in 200 microliters of fresh staining buffer per tube and the experimental pellet in 500 microliters per 2.5 times 10 to the seven cells and transfer the labeled cells to individual corresponding five milliliter FACS tubes. Then set up the flow cytometer according to standard protocols and use the unstained and single stained controls to set the voltages and the color compensations. To identify and isolate the myeloid progenitor cells, load the experimental cell sample onto the cytometer and create a forward scatter area versus side scatter area plot, gating to exclude the debris and dead cells.Create a forward scatter height versus forward scatter width plot of the live cells and gate to exclude the doublets. Repeat this process with a side scatter height versus side scatter width plot of the forward scatter singlets and gate to exclude the doublets. Create a Sca-1 versus c-Kit plot and gate to select the c-Kit positive Sca-1 negative progenitors.Then create a CD-34 versus FC gamma receptor plot and gate to select the mixed common myeloid progenitor and mixed granulocyte monocyte progenitor populations. It's important to gate the mixed common myeloid progenitor and mixed granulocyte monocyte progenitor populations as precisely as possible. It can be helpful to use a pseudo-color density plot or a contour plot for more accurate gating.Use the cells in the mixed common myeloid progenitor gate to create a CD115 versus Flt3 plot and gate to select the common myeloid progenitor Flt3 positive CD115 low cells, the common myeloid progenitor Flt3 negative CD115 low cells, and the Flt3 positive CD115 high monocyte dendritic cell progenitors. Use the cells in the mixed granulocyte monocyte progenitor gate to create a Ly6C versus FC Gamma receptor plot and gate to select the Ly6C negative cells and the Ly6C positive cells. Then create a CD115 versus Flt3 plot for each gated mixed granulocyte monocyte progenitor cell subpopulation and gate the Ly6C negative Flt3 negative CD115 low granulocyte monocyte progenitors, the Ly6C positive Flt3 negative CD115 low granulocyte progenitors, and the Ly6C positive Flt3 negative CD115 high monocyte progenitors.Max lineage depletion is efficient at depleting differentiated cells and for enriching for the c-Kit positive progenitor cells. The lineage negative fraction does still contain some c-Kit negative cells, but these cells will be eliminated in subsequent flow cytometry gating steps. Progenitor yields after FACS sorting can vary depending on the sorter settings used, but it should be possible to obtain between one to four times 10 to the fourth cells per fraction from each mouse with a post-sort purity of greater than 95%for each fraction.Good staining is critical for clean separation of the populations. You may need to titrate the antibodies or choose different fluorophores to ensure optimal separation. This protocol can be used to identify progenitor cells to assess differences in bone marrow composition between samples, to isolate progenitors for molecular analysis or to assess their ability to produce myeloid cells.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

분리, 정제 및 기능 연구 및 입양 전송 실험 쥐의 골수 호중구의 라벨링

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

뼈 대식 세포 생산에게 골수 유래

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

분리 및 설치류 골수의 정맥 주사 유래 단핵구

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

마우스 골수 단핵구를 추적<em&gt; 생체</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

약독 화와 피내 접종에 따라 마우스의 피부와 배수 림프절에서 골수 세포 분리<em&gt; 변형체</em&gt; 포자 소체

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

쥐 뒷다리 긴 뼈 해부 및 골수 격리

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

마우스 골수에서 생성 및 GM-CSF의 식별 파생 폐포와 같은 대 식세포와 수지상 세포

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

마우스 골수에서 형질 수지상 세포의 정화를위한 형광 활성화 셀 정렬

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

골수성 창시자 및 정렬 전략 소설 셀을 사용 하 여 Murine 골에서 수지상 세포 선구자의 큰 숫자의 생성

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...