Name: identification and isolation of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from mouse bone marrow
Uploaded: 2018-07-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow at JoVE.com

Denne protokollen ble utviklet ved hjelp av midler fra styret i guvernører regenerativ medisin Institute ved Cedars-Sinai Medical Center (til HSG), en karriere innen immunologi fellesskap fra den amerikanske foreningen Immunologists (til AY og HSG) og en Scholar Award fra American Society for hematologi (å Ja). Vi takker Flow cytometri kjernen ved Cedars-Sinai Medical Center for hjelp med FACS sortering.

Alle metodene som er beskrevet her ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Cedars-Sinai Medical Center.
1. isolering av musen benmargen og utarbeidelse av en enkelt celle suspensjon
<ol><li>Euthanize musen institusjonelle retningslinjer.</li>
	<li>Plasser euthanized musen på ryggen og spray den med 70% etanol (EtOH). Gjør en liten (3-5 mm) innsnitt i hver baklem på ankelen nivå med skarp, spisse saks, og trekke huden opp mot kroppen å fjerne det fra bein...

<ol>
	<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRF8+acts+in+lineage-committed+rather+than+oligopotent+progenitors+to+control+neutrophil+vs+monocyte+production.">IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production.</a> Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).</li><li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX3CR1++CD115++CD135++common+macrophage/DC+precursors+and+the+role+of+CX3CR1+in+their+response+to+inflammation.">CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).</li><li>Fogg, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+bone+marrow+progenitor+specific+for+macrophages+and+dendritic+cells.">A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells.</a> Science. 311 (5757), 83-87 (2006).</li><li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clonogenic+common+Flt3+M-CSFR++plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow.">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).</li><li>Hettinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+monocytes+and+macrophages+in+a+committed+progenitor.">Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor.</a> Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte-monocyte+progenitors+and+monocyte-dendritic+cell+progenitors+independently+produce+functionally+distinct+monocytes.">Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes.</a> Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).</li><li>Olsson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+mixed-lineage+states+leading+to+a+binary+cell+fate+choice.">Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice.</a> Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).</li><li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation.">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+regulatory+factor+8+and+the+regulation+of+neutrophil,+monocyte,+and+dendritic+cell+production.">Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production.</a> Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).</li><li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors.">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).</li></ol>

Weissman gating strategi for musen myeloid progenitor identifikasjon1 har vært gullstandarden for immunologists og hematologists i nesten 20 år, men det er nå klart at "CMP" og "GMP" portene er svært heterogen og mer presis gating strategier er nødvendig. Protokollen som vi har beskrevet her tillater identifisering av oligopotent og avstamning forpliktet delsett i C57BL/6J mus for mer presise kvantifisering av bestemte myelogen progenitors og kartlegging av myelopoiesis, samt undersøkelse av...

Monocytter og nøytrofile dendrittiske celler (DCs) er myeloide celler som oppstår fra blodkreft progenitors, hovedsakelig i benmargen, ved en prosess kalt myelopoiesis. Vanlige myelogen progenitors (CMPs) har muligheten å tilvirke myeloide celler, samt megakaryocytes og erytrocytter, men ikke lymfoide celler. Granulocytt-monocytt progenitors (GMPs), som er avledet fra CMPs, produserer granulocytter og monocytter, men har mistet megakaryocyte og røde blodlegemer potensielle. Monocytter og klassisk og presenterer antigener DCs (cDCs/PDC) er også tenkt å oppstå fra vanlige progenitors kalles monocytt-DC progenitors (MDPs), som er produsert av CMPs. gradvis begrensning avstamning potensial til slutt resulterer i avstamning forpliktet progenitors: granulocytt progenitors og monocytt progenitors dendrittiske celle progenitors (figur 1).
Weissman og kolleger rapporterte at CMPs er funnet i Lin- c-Kit+ Sca-1- (LKS-) CD34+ FcγRlo brøkdel av musen benmargen, mens GMPs finnes i LKS- -CD34+ FcγR Hei del1. Men er disse "CMP" og "GMP" fraksjoner svært uensartet. For eksempel inneholder "GMP" delen også avstamning forpliktet granulocytt progenitors og monocytt progenitors1,2. MDPs separat rapportert å være CX3CR1+ Flt3+ CD115+ progenitors som uttrykker også CD34 og FcγR3,4. MDPs gi opphav til cDC/pDC-produserende felles DC progenitors (CDPs), som har blitt rapportert å uttrykke lavere nivåer av c-Kit (CD117) og er ikke inkludert i LKS- brøkdel5.
Det var tidligere antatt at monocytter oppstå via en enkelt sti (CMP-GMP-MDP-monocytt). Samsvar med denne modell, monocyte forpliktet progenitors produsert av GMPs (heter monocyte progenitors, MPs)2 og MDPs (kalt felles monocytt progenitors, cMoPs)6 synes å være de samme cellene på grunnlag av delte overflaten markør uttrykk . Men vi nylig vist at monocytter produseres uavhengig av GMPs og MDPs, og kunne skille mellom MPs og cMoPs av encellede RNA sekvensering7.
Vi har nylig endret Weissman "CMP" og "GMP" gating strategi for å identifisere 6 subfractions av C57BL/6J musen benmarg som inneholder forskjellige oligopotent og avstamning forpliktet myeloid progenitor delsett. Vi først rapportert at flekker for Ly6C og CD115 tillater isolering av oligopotent GMPs, samt granulocytt progenitors (GPs) og monocytt progenitors (MPs og cMoPs, som vi ikke skille) fra "GMP" del2 (LKS - CD34+ FcγRHei gate; Figur 1). Vi senere viste at MDPs er hovedsakelig funnet i "CMP" fraksjonen (LKS- CD34+ FcγRlo gate), som også inneholder Flt3+ CD115lo og Flt3- delsett7 (figur 1 ). CMP-Flt3+ CD115lo brøkdel gir både GMPs og MDPs ved adopsjon overføring. CMP-Flt3- delsettet inneholder progenitors som synes å være mellomprodukter mellom CMP-Flt3+ CD115lo celler og GMPs. I motsetning til MDPs har både CMP-Flt3+ CD115lo og CMP-Flt3- brøker megakaryocyte og røde blodlegemer potensielle.
Det er viktig å merke seg at det er foreløpig uklart om "CMP" fraksjoner inneholder progenitors som virkelig oligopotent (f.eks enkeltceller i CMP-Flt3+ CD115lo brøkdel har nøytrofile, monocytt, DC, megakaryocyte og røde blodlegemer potensielle), eller eventuelt består av en blanding av progenitors med mer begrenset avstamning potensial. Kolonien danner analyser (methylcellulose kulturer) avslørte celler med granulocytt (nøytrofile), røde blodlegemer, monocyte og megakaryocyte potensielle (GEMM celler) i "CMP", CMP-Flt3+ CD115lo og CMP-Flt3- fraksjoner1 ,7, men tillater ikke vurdering av DC potensial. Derimot kolonien danner analyser viste eksistensen av oligopotent GMPs (progenitors med både nøytrofile og monocytt potensielle) i "GMP" brøkdel1,2, og dette er støttet av siste encellede transcriptomic analyse8. Det kjent ikke er, men om disse oligopotent GMPs produserer også andre granulocytter (eosinofile, basofile og mastceller).
Basert på disse studiene har vi nå viser kan hvordan 7 overflate markører (c-utstyr, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C og CD115) brukes til å identifisere og isolere disse 6 delsett av oligopotent og avstamning forpliktet myelogen progenitors. Protokollen beskrevet her kan brukes for i vitro kultur analyser (methylcellulose eller flytende kulturer), i vivo adoptivforeldre overføring eksperimenter i mus og molekylære analyse (bulk og encellede RNA sekvensering, vestlige blotting, etc.).
Protokollen består av 3 faser: 1) utarbeidelse av en enkelt celle suspensjon av bein margtransplantasjon celler, 2) berikelse blodkreft progenitors (magnetisk-aktivert celle sortering), og 3) identifisering og isolering eventuelt av stamfar undergrupper av flyt cytometri (med en analyserer eller sortering, avhengig). Det første trinnet er isolering av bein margtransplantasjon celler fra femurs og tibias av euthanized mus og ligner andre beskrevet tidligere protokoller9. Deretter er prøven beriket for stammen og stamfar celler ved hjelp av en cocktail av antistoffer mot celle overflate markører erytrocytter, nøytrofile, monocytter, lymfocytter, etc., til deplete differensierte celler. Dette er ikke obligatorisk, men anbefales sterkt å optimalisere oppdagelsen stamfar delsettene og redusere mengden av antistoffer nødvendig for stamfar identifikasjon og tiden som kreves for flowcytometri. Avstamning uttømming protokollen nedenfor beskriver Magnetic-Activated celle sortering (Mac) bruker en mus avstamning celle uttømming Kit (som inneholder biotinylated antistoffer mot CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4 og Ter-119, pluss anti-biotin microbeads) og en automatisert magnetiske skilletegnet. Det siste trinnet er identifikasjonen (og sortering, hvis ønskelig) stamfar delsettene av flowcytometri. Antistoff panelet beskrevet nedenfor (se tabell 1) er utformet for å brukes i en flyt cytometer (analyzer eller sorter) med 4 lasere (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58061/58061fig1.jpg"> Figur 1: nøytrofile, monocyte og DC progenitors og differensiering trasé. Nylig revidert modell av myelopoiesis7 er illustrert med Weissman portene for "CMPs" (blå) og "GMPs" (grønn)1 kledde. Dette tallet er endret fra Yanez et al. 20177. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58061/58061fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="945">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2)</td>
			<td style="width:177px;">The Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:172px;">Cat#JAX:000664</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:172px;">Cat#130-090-858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">Cat#553733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse CD16/CD32 (Fc&#947;R; clone 93) APC-Cy7</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#101327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#108114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#105820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#128012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#135506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">Cat#560718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td style="width:177px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:172px;">Cat#C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">AutoMACS Separator</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>Use the &#34;deplete&#34; program</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">BD LSRFortessa</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>5 lasers, 15 colors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">BD FACS Aria III cell sorter</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>5 lasers, 13 colors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">FlowJo</td>
			<td style="width:177px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:172px;">https://www.flowjo.com</td>
			<td>For further analysis of the .fcs files</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification and isolation of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from mouse bone marrow

Myeloid progenitors som gir nøytrofile og monocytter dendrittiske celler (DCs) kan identifiseres i og isolert fra benmargen av mus for Hematologisk og immunologiske analyser. For eksempel kan studier av mobilnettet og molekylære egenskapene myeloid progenitor befolkninger avsløre mekanismene bak leukemic transformasjon, eller vise hvordan immunsystem reagerer på patogen eksponering. Tidligere beskrevet flyt cytometri strategier for myeloid progenitor identifikasjon har aktivert betydelige fremskritt på mange felt, men fraksjoner de identifiserer er svært uensartet. De vanligste gating strategiene definere benmarg brøker som er beriket for ønsket befolkningen, men også inneholde store mengder "forurensende" progenitors. Våre studier har løst mye av denne heterogenitet, og protokollen vi presenterer her tillater isolering av 6 subpopulasjoner av oligopotent og avstamning forpliktet myelogen progenitors 2 beskrevet tidligere benmarg fraksjoner. Protokollen beskriver 3 faser: 1) isolering av bein margtransplantasjon celler, 2) berikelse for blodkreft progenitors av magnetiske-aktivert celle sortering (avstamning uttømming av Mac) og 3) identifikasjon av myeloid progenitor delsett av flowcytometri (inkludert fluorescens-aktivert celle sortering, FACS, om ønskelig). Denne tilnærmingen tillater stamfar kvantifisering og isolasjon for en rekke i vitro og i vivo , og har allerede gitt romanen innsikt stier og mekanismer av nøytrofile, monocyte og DC differensiering.

Ved hjelp av protokollen som er beskrevet ovenfor, er det mulig å få ~ 100 millioner celler (inkludert røde blodlegemer, eller ~ 50 millioner kjerne celler) fra både femurs og tibias (2 ben) en C57BL/6J mus (6-8 uker gamle, mann eller kvinne). 1-2 millioner Lin- celler kan isoleres per musen av Mac uttømming av Lin+ celler.
Hver 6 myeloid progenitor delsettene utgjør ~ 1-4% av Lin- celler. ...

Watch this Scientific Journal Video about Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow at JoVE.com

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Vi viser hvordan å identifisere og isolere 6 delsett av myelogen progenitors fra murine benmarg bruker en kombinasjon av magnetiske og fluorescens sortering (Mac og FACS). Denne protokollen kan brukes i vitro kultur analyser (methylcellulose eller væske kulturer), i vivo adoptivforeldre overføring eksperimenter og RNA/protein analyser.

Identifisering og isolering av Oligopotent og avstamning forpliktet myelogen Progenitors fra musen benmarg

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

This method could be helpful for hematologists and immunologists studying the production and function of myeloid cells, including neutrophils, monocytes, and dendritic cells. The main advantage of this technique is that it enables more precise identification of myeloid progenitor subsets than previous strategies. To enrich bone marrow cells for progenitors by magnetic-activated cell sorting, or MACS, pellet the cells by centrifugation and resuspend the pellet in 40 microliters of MACS staining buffer per one times 10 to the seven bone marrow cells.To deplete differentiated lineage positive cells, add 10 microliters of biotin antibody cocktail per one times 10 to the seven cells and to mix by pipetting for a 10 minute incubation at four degrees Celsius. At the end of the incubation, add 30 microliters of staining buffer per one times 10 to the seven cells with mixing, followed by 20 microliters of anti-biotin microbeads per one times 10 to the seven cells. After 15 minutes at four degrees Celsius, wash the cells with one milliliter of staining buffer per one times 10 to the seven cells and resuspend the pellet in 500 microliters of fresh staining buffer for up to one times 10 to the eight cells.Next, set up the automated magnetic separator according to the manufacturer's instructions and place the tube of labeled cells into the separator. Begin the negative selection program to collect the negative fraction which contains the progenitor enriched lineage negative cells. Pellet the lineage negative cells by centrifugation and resuspend the pellet, which is now white, in two milliliters of staining buffer per mouse for counting.To isolate the myeloid progenitor cells by FACS, add one times 10 to the fifth lineage negative cells to each of eight control microcentrifuge tubes for voltage selection and color compensation and add the rest of the cell sample to a ninth microcentrifuge tube for staining with all seven of the surface marker antibodies of interest for progenitor identification and sorting. Pellet the cells by centrifugation and resuspend the control pellets in 100 microliters of FACS staining buffer and the experimental sample pellet in 100 microliters of staining buffer per five times 10 to the six cells. Next, add anti-CD16/CD32 antibody to the Fc gamma receptor single stain tube and the sample tube.Vortex gently and incubate the samples for 10 minutes at four degrees Celsius. At the end of the incubation, add the other antibodies to the appropriate corresponding single stain tubes and to the sample tube and after gentle vortexing, incubate the samples for 15 minutes at four degrees Celsius. At the end of the incubation, add 900 microliters of staining buffer to the control tubes and one milliliter of staining buffer per one times 10 to the seven cells to the sample tube for centrifugation.Resuspend the control pellets in 200 microliters of fresh staining buffer per tube and the experimental pellet in 500 microliters per 2.5 times 10 to the seven cells and transfer the labeled cells to individual corresponding five milliliter FACS tubes. Then set up the flow cytometer according to standard protocols and use the unstained and single stained controls to set the voltages and the color compensations. To identify and isolate the myeloid progenitor cells, load the experimental cell sample onto the cytometer and create a forward scatter area versus side scatter area plot, gating to exclude the debris and dead cells.Create a forward scatter height versus forward scatter width plot of the live cells and gate to exclude the doublets. Repeat this process with a side scatter height versus side scatter width plot of the forward scatter singlets and gate to exclude the doublets. Create a Sca-1 versus c-Kit plot and gate to select the c-Kit positive Sca-1 negative progenitors.Then create a CD-34 versus FC gamma receptor plot and gate to select the mixed common myeloid progenitor and mixed granulocyte monocyte progenitor populations. It's important to gate the mixed common myeloid progenitor and mixed granulocyte monocyte progenitor populations as precisely as possible. It can be helpful to use a pseudo-color density plot or a contour plot for more accurate gating.Use the cells in the mixed common myeloid progenitor gate to create a CD115 versus Flt3 plot and gate to select the common myeloid progenitor Flt3 positive CD115 low cells, the common myeloid progenitor Flt3 negative CD115 low cells, and the Flt3 positive CD115 high monocyte dendritic cell progenitors. Use the cells in the mixed granulocyte monocyte progenitor gate to create a Ly6C versus FC Gamma receptor plot and gate to select the Ly6C negative cells and the Ly6C positive cells. Then create a CD115 versus Flt3 plot for each gated mixed granulocyte monocyte progenitor cell subpopulation and gate the Ly6C negative Flt3 negative CD115 low granulocyte monocyte progenitors, the Ly6C positive Flt3 negative CD115 low granulocyte progenitors, and the Ly6C positive Flt3 negative CD115 high monocyte progenitors.Max lineage depletion is efficient at depleting differentiated cells and for enriching for the c-Kit positive progenitor cells. The lineage negative fraction does still contain some c-Kit negative cells, but these cells will be eliminated in subsequent flow cytometry gating steps. Progenitor yields after FACS sorting can vary depending on the sorter settings used, but it should be possible to obtain between one to four times 10 to the fourth cells per fraction from each mouse with a post-sort purity of greater than 95%for each fraction.Good staining is critical for clean separation of the populations. You may need to titrate the antibodies or choose different fluorophores to ensure optimal separation. This protocol can be used to identify progenitor cells to assess differences in bone marrow composition between samples, to isolate progenitors for molecular analysis or to assess their ability to produce myeloid cells.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Isolering, rensing og merking av benmarg fra mus Nøytrofiler for funksjonelle studier og adoptivforeldre Transfer Eksperimenter

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolering av myeloid dendrittiske celler og Epitelceller fra Menneskelig Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Bone Marrow-avledet Macrophage Produksjon

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolasjon og intravenøs injeksjon av murine Bone Marrow Avledet Monocytter

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Sporing Mouse Bone Marrow Monocytter<em&gt; I Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Myelogen Cell Isolasjon fra Mouse Hud og Drenering Lymph Node Etter Intradermal Immunisering med levende svekket<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoitter

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Murine Hind Limb Long Bone Dissection og benmarg Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Generasjon og identifisering av GM-CSF Avledet Alveolære lignende makrofager og dendrittiske celler fra mus Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescens-aktivert cellesortering for Rensing av Plasmacytoid dendrittiske celler fra mus Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Generasjon av stort antall myelogen Progenitors og dendrittiske celle forløpere fra Murine benmarg bruker en roman celle sortering strategi

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...