Name: identification and isolation of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from mouse bone marrow
Uploaded: 2018-07-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow at JoVE.com

Этот протокол был разработан с использованием средств от Совета управляющих регенеративной медицины института в медицинский центр Седарс-Синай (HSG), карьеру в иммунологии стипендий от Американской ассоциации иммунологов (Ай и HSG) и ученый награду от Американского общества гематологии (для AY). Мы благодарим основной поток Cytometry в медицинский центр Седарс-Синай для помощи с СУИМ сортировки.

Все методы, описанные здесь были утверждены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) от Медицинский центр Седарс-Синай.
1. изоляция костного мозга мыши и приготовление суспензии одну ячейку
<ol><li>Усыпить мыши институциональных руководящих принципов....

<ol>
	<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRF8+acts+in+lineage-committed+rather+than+oligopotent+progenitors+to+control+neutrophil+vs+monocyte+production.">IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production.</a> Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).</li><li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX3CR1++CD115++CD135++common+macrophage/DC+precursors+and+the+role+of+CX3CR1+in+their+response+to+inflammation.">CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).</li><li>Fogg, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+bone+marrow+progenitor+specific+for+macrophages+and+dendritic+cells.">A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells.</a> Science. 311 (5757), 83-87 (2006).</li><li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clonogenic+common+Flt3+M-CSFR++plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow.">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).</li><li>Hettinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+monocytes+and+macrophages+in+a+committed+progenitor.">Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor.</a> Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte-monocyte+progenitors+and+monocyte-dendritic+cell+progenitors+independently+produce+functionally+distinct+monocytes.">Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes.</a> Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).</li><li>Olsson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+mixed-lineage+states+leading+to+a+binary+cell+fate+choice.">Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice.</a> Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).</li><li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation.">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+regulatory+factor+8+and+the+regulation+of+neutrophil,+monocyte,+and+dendritic+cell+production.">Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production.</a> Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).</li><li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors.">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).</li></ol>

Вайсман, стробирование стратегия для мыши миелоидного progenitor идентификации1 был золотым стандартом для иммунологов и гематологи почти 20 лет, но сейчас очевидно, что «КПВ» и «GMP» ворота являются весьма разнородными и более точные шлюзовые стратегии необходимы. Протокол, кот?...

Моноциты, нейтрофилов и дендритных клеток (DCs) являются миелоидных клеток, возникающих от гемопоэтических прародителями, главным образом в костном мозге, этот процесс называется myelopoiesis. Общие миелоидного прародителями (CMPs) имеют потенциал для производства миелоидных клеток, а также megakaryocytes и эритроцитов, но не лимфоидных клеток. Предшественники гранулоцитов и моноцитов (ГИП), которые являются производными от CMPs, производят гранулоцитов и моноцитов, но потеряли мегакариоцитов и эритроцитов потенциал. Моноциты и классические и плазмоцитарная DCs (cDCs/PDC) также считается вытекают из общих прародителей, известный как предшественники Моноцит DC (MDPs), которые производятся CMPs. постепенное ограничение потенциал линии в конечном итоге приводит родословную, совершенные прародители: предшественники гранулоцитов, моноцитов прародителями и Предшественники дендритных клеток (рис. 1).
Вайсман и коллеги сообщили, что CMPs находятся в Линь– c комплект+ Sca-1– (ЛКС–) CD34 FcγRЛо часть костного мозга мыши, в то время как ГИП содержатся в CD34 ЛКС– + + FcγR Привет часть1. Однако эти «КПВ» и «GMP» фракции являются весьма разнородными. Например «GMP» фракции также содержит восходящей линии, совершенные гранулоцитов и моноцитов прародителями1,2. MDPs отдельно сообщается CX3CR1+ Flt3+ CD115+ прародителей, которые также выразить CD34 и FcγR3,4. MDPs привести к cDC/pDC производство общих DC прародителями (CDP), сообщившие выразить более низкие уровни c-Kit (CD117) и не включаются в ЛКС– часть5.
Ранее предполагалось, что моноциты возникают по одной дорожке (CMP-GMP-MDP-Моноцит). В соответствии с этой модели, совершенные Моноцит прародителями, производимые ГИП (названный Моноцит прародителями, м/с)2 и MDPs (названный общих Моноцит прародителями, cMoPs)6 , по-видимому, те же клетки на основе общей поверхности маркер выражения . Однако мы недавно продемонстрировали, что моноциты производятся независимо ГИП и MDPs и были в состоянии провести различие между депутаты и cMoPs сингл клеточной РНК последовательности7.
Мы недавно изменен Вайсман «КПВ» и «GMP» стробирования стратегии для выявления 6 подфракций костного C57BL/6J мыши, содержащих различные oligopotent и совершенные линии миелоидного progenitor подмножеств. Мы впервые сообщили, что окрашивание для Ly6C и CD115 позволяет изоляции oligopotent ГИП, так как предшественники гранулоцитов (GPs) и Моноцит прародителями (MPs и cMoPs, который мы в настоящее время не в состоянии отделить) от «GMP» часть2 (ЛКС - CD34+ FcγRПривет ворота; Рисунок 1). Впоследствии мы показали, что MDPs преимущественно находятся в «КПВ» фракции (CD34 ЛКС– + FcγRЛо ворота), который также содержит Flt3+ CD115Ло и Flt3– подмножеств7 (Рисунок 1 ). CMP-Flt3+ CD115Ло фракция дает ГИП и MDPs после приемных передачи. CMP-Flt3– подмножество содержит прародителей, которые представляются промежуточные между CMP-Flt3+ CD115Ло клетки и ГИП. В отличие от MDPs CMP-Flt3+ CD115Ло и CMP-Flt3– фракции также обладают мегакариоцитов и эритроцитов потенциал.
Важно отметить, однако, что это в настоящее время неясно ли «КПВ» фракции содержат прародителей, которые действительно oligopotent (например, отдельных ячеек в CMP-Flt3+ CD115Ло фракции обладают нейтрофилов, Моноцит, DC, мегакариоцитов и потенциальных эритроцитов), или альтернативно, составляют смесь прародителями с более ограниченным потенциалом линии. Колонии, формируя assays (метилцеллюлоза культуры) показали клетки с гранулоцитарный (нейтрофилов), эритроцитов, моноцитов и мегакариоцитов потенциальных (ГЭММ клетки) в «СС», CMP-Flt3+ CD115Ло и фракции CMP-Flt3– 1 ,7, но не позволяют оценку потенциала постоянного тока. В отличие от колонии, формируя assays продемонстрировал существование oligopotent ГИП (предшественники нейтрофилов и моноцитов потенциальных) в «GMP» часть1,2, и это подтверждается недавно одноклеточного транскриптомики анализ8. Это не известно в настоящее время, однако, является ли эти oligopotent ГИП также производить другие гранулоцитов (эозинофилов, базофилов и тучных клеток).
На основании этих исследований, мы теперь продемонстрировать как 7 поверхности маркеры (c комплект Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C и CD115), может использоваться для идентифицировать и изолировать эти 6 подмножества oligopotent и совершенные линии миелоидного прародителями. Протокол, описанные здесь может применяться для анализов в vitro культуры (метилцеллюлоза или жидкости культуры), в естественных условиях приемных передачи эксперименты в мышей и молекулярный анализ (насыпных и одноклеточного последовательности РНК, Западный blotting, и т.д.).
Протокол состоит из 3 этапов: 1) подготовка подвески одной клетки костного мозга клетки, 2) обогащения гемопоэтических прародителями (сортировки) магнитные активации клеток и 3) выявления и изоляции, при желании, прародитель подмножеств потоком цитометрии (с использованием анализатора или сортировщик, в соответствующих случаях). Первым шагом является изоляция клетки костного мозга от бедра и tibias Усыпленных мышей и похож на другие ранее описанные протоколы9. Затем образец обогащен для стволовых и прогениторных клеток с помощью коктейль антител против клеток поверхностных маркеров эритроцитов, нейтрофилы, моноциты, лимфоциты и т.д., чтобы истощить дифференцированных клеток. Это не является обязательным, но настоятельно рекомендуется оптимизировать обнаружения подмножеств прародителю и уменьшить количество антител, необходимых для идентификации прародителем и время, необходимое для проточной цитометрии. Родословная истощения протокол ниже описывает Magnetic-Activated ячейку Сортировка (ПДК) с помощью мыши Lineage ячейки истощение Kit (который содержит биотинилированным антитела CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4 и тер-119, плюс анти биотин микрошарики) и автоматизированных магнитный сепаратор. Последним шагом является идентификация (и сортировки, если это необходимо) Прародитель подмножеств подачей cytometry. Группа антител, описанных ниже (см. также таблицу 1) была разработана для использования в проточный цитометр (анализатор или Сортировщике) с 4 лазеры (405 нм, 488 нм, 561 Нм, 640 Нм).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58061/58061fig1.jpg"> Рисунок 1: нейтрофилов, моноцитов и DC прародителями и дифференциация путей. Недавно пересмотренная модель myelopoiesis7 иллюстрирован, Вайсман ворота для «CMPs» (синий) и «ГИП» (зеленый)1 обложил. Эта цифра была изменена Яньес et al. 20177. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58061/58061fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="945">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2)</td>
			<td style="width:177px;">The Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:172px;">Cat#JAX:000664</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:172px;">Cat#130-090-858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">Cat#553733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse CD16/CD32 (Fc&#947;R; clone 93) APC-Cy7</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#101327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#108114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#105820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#128012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#135506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">Cat#560718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td style="width:177px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:172px;">Cat#C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">AutoMACS Separator</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>Use the &#34;deplete&#34; program</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">BD LSRFortessa</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>5 lasers, 15 colors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">BD FACS Aria III cell sorter</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>5 lasers, 13 colors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">FlowJo</td>
			<td style="width:177px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:172px;">https://www.flowjo.com</td>
			<td>For further analysis of the .fcs files</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification and isolation of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from mouse bone marrow

Миелоидные прародителей, которые дают нейтрофилов, моноцитов и дендритных клеток (DCs) могут быть определены в и изолированы от костного мозга мышей для гематологических и иммунологические анализы. Например исследования клеточном и молекулярном свойств миелоидного progenitor населения можно выявить механизмы, лежащие в основе лейкозных преобразования, или продемонстрировать, как иммунная система реагирует на патогенные воздействия. Ранее описанных потока цитометрии стратегии для идентификации миелоидного progenitor позволили значительных успехов во многих областях, но фракций, которые они определяют весьма неоднородны. Наиболее часто используемые стробирования стратегии определить костного фракций, которые обогащаются для желаемого населения, но и содержат большое количество «заражая» прародителей. Наши недавние исследования решили большую часть этой неоднородности и протокол, который мы представляем здесь позволяет изоляции 6 субпопуляции oligopotent и совершенные линии миелоидного прародителей от 2 ранее описанных костного дробей. Протокол описывает 3 этапа: 1) изоляции костного клеток, 2) обогащения гемопоэтических прародителями сортировки магнитные активации клеток (линии истощение, MACS), и 3) идентификация миелоидного progenitor подмножеств подачей cytometry (включая флуоресценции активированный ячейку Сортировка, FACS, при необходимости). Этот подход позволяет прародитель квантификации и изоляции для различных приложений в пробирке и в естественных условиях и уже принесли Роман понимание путей и механизмов нейтрофилов, моноцитов и DC дифференциации.

Используя протокол, описанных выше, можно получить от бедра и tibias (2 ноги) одной C57BL/6J мыши (6-8 недель старый, мужчина или женщина) ~ 100 миллионов клеток (включая красные кровяные клетки, или ~ 50 миллионов ядерных клеток). 1-2 миллионов Линь– клетки могут быть изолирован?...

Watch this Scientific Journal Video about Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow at JoVE.com

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Мы показали, как идентифицировать и изолировать 6 подмножеств миелоидного прародителей из мышиных костного мозга с помощью комбинации магнитных и флуоресценции, сортировка (MACS и СУИМ). Этот протокол может использоваться для в vitro assays культуры (метилцеллюлоза или жидкости культуры), в естественных условиях приемных передачи экспериментов и РНК/белка анализа.

Выявление и изоляция Oligopotent и Lineage, совершенные миелоидного предшественники костного мозга мыши

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Дифференцируя функциональной роли экспрессии генов от иммунной и не-иммунных клеток в мышь колит трансплантацией костного мозга

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Исследование поляризации Использование макрофагов костного мозга макрофагов

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Выделение, очистка и маркировки Мышь нейтрофилов костного мозга для функциональных исследований и приемных Эксперименты Трансфер

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Изоляция миелоидных дендритных клеток и эпителиальных клеток из человеческого тимуса

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Костного мозга, полученных макрофагов производства

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Выделение и внутривенное введение мышиных костного мозга моноцитов

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Отслеживание костного мозга мышей моноцитов<em&gt; В Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Миелоидный Выделение клеток из кожи мышей и Слив лимфатического узла После внутрикожной иммунизации с живой аттенуированной<em&gt; Plasmodium</em&gt; Спорозоиты

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Мышиные Hind Лимб длинных трубчатых костей Вскрытие и костного мозга Изоляция

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Генерация и идентификация GM-CSF производный альвеол, как макрофаги и дендритные клетки из костного мозга мыши

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...