Name: identification and isolation of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from mouse bone marrow
Uploaded: 2018-07-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow at JoVE.com

Este protocolo fue desarrollado con fondos de la Junta de Gobernadores regenerativa medicina Instituto de Cedars-Sinai Medical Center (HSG), carreras en beca de Inmunología de la Asociación Americana de inmunólogos (AY y HSG) y Scholar Award de la sociedad americana de Hematología (para sí). Agradecemos al núcleo de citometría de flujo en el Cedars-Sinai Medical Center para obtener ayuda con la clasificación de FACS.

Todos los métodos aquí descritos fueron aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de Cedars-Sinai Medical Center.
1. aislamiento de médula ósea de ratón y la preparación de una suspensión unicelular
<ol><li>Eutanasia el ratón según las directrices.</li>
	<li>Coloque el ratón sacrificaron a sus espaldas y rociar con 70% de etanol (EtOH). Hacer una incisión pequeña (3-5 mm) en cada miembro trasero en el tobillo nivel usando afiladas, tijeras puntiagudas y ...

<ol>
	<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRF8+acts+in+lineage-committed+rather+than+oligopotent+progenitors+to+control+neutrophil+vs+monocyte+production.">IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production.</a> Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).</li><li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX3CR1++CD115++CD135++common+macrophage/DC+precursors+and+the+role+of+CX3CR1+in+their+response+to+inflammation.">CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).</li><li>Fogg, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+bone+marrow+progenitor+specific+for+macrophages+and+dendritic+cells.">A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells.</a> Science. 311 (5757), 83-87 (2006).</li><li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clonogenic+common+Flt3+M-CSFR++plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow.">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).</li><li>Hettinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+monocytes+and+macrophages+in+a+committed+progenitor.">Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor.</a> Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte-monocyte+progenitors+and+monocyte-dendritic+cell+progenitors+independently+produce+functionally+distinct+monocytes.">Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes.</a> Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).</li><li>Olsson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+mixed-lineage+states+leading+to+a+binary+cell+fate+choice.">Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice.</a> Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).</li><li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation.">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+regulatory+factor+8+and+the+regulation+of+neutrophil,+monocyte,+and+dendritic+cell+production.">Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production.</a> Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).</li><li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors.">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).</li></ol>

Weissman gating estrategia para ratón progenitor mieloide identificación1 ha sido el estándar de oro para los inmunólogos y hematólogos durante casi 20 años, pero ahora es evidente que las puertas "CMP" y "GMP" son muy heterogéneas y más precisa se necesitan estrategias bloquea. El protocolo que hemos descrito aquí permite la identificación de oligopotent y subconjuntos linaje comprometido en ratones C57BL/6J más precisa cuantificación de progenitores mieloides específicos y asignaci?...

Monocitos, neutrófilos y células dendríticas (DCs) son células mieloides que provienen de progenitores hematopoyéticos, principalmente en la médula ósea, por un proceso llamado mielopoyesis. Progenitores mieloides comunes (CMPs) tienen el potencial para producir células mieloides, así como megacariocitos y eritrocitos, pero las células no linfoides. Progenitores de granulocitos-monocitos (BPF), que se derivan de los CMPs, producen granulocitos y monocitos, pero han perdido megakaryocyte y el potencial del eritrocito. Monocitos y clásica y plasmacytoid DCs (CDC/PDC) también se piensan para presentarse de progenitores comunes conocidos como progenitores de monocito DC (MDPs), que son producidos por CMPs. Gradual restricción potencial del linaje que finalmente se traduce en linaje comprometido progenitores: progenitores de granulocitos, monocito progenitores y progenitoras de células dendríticas (figura 1).
Weissman y sus colegas informaron que los CMPs se encuentran en Lin– c-Kit+ Sca-1– CD34 (LKS–)+ FcγRlo fracción de médula ósea de ratón, mientras que las prácticas correctas de fabricación están contenidos en el CD34 LKS– + FcγR Hola fracción1. Sin embargo, estas fracciones "CMP" y "GMP" son muy heterogéneas. Por ejemplo, la fracción de "GMP" también contiene progenitores comprometidos linaje granulocito monocito progenitores y1,2. MDPs se informaron por separado que CX3CR1+ Flt3+ CD115+ progenitores que también expresan CD34 y FcγR3,4. MDPs dan lugar a cDC/pDC-producción común DC progenitores (CDP), que se han divulgado para expresar niveles más bajos de c-Kit (CD117) y no están incluidos en la fracción LKS– 5.
Previamente, fue asumido que los monocitos surgen a través de una sola vía (CMP-GMP-MDP-monocito). Consistente con este modelo, cometidos por el monocito progenitores producida por prácticas correctas de fabricación (nombre de progenitores de monocitos, MPs)2 y MDPs (nombradas de progenitores comunes de monocitos, cMoPs)6 parecen ser las células del mismo en base a la expresión del marcador de superficie compartido . Sin embargo, nosotros recientemente demostró que los monocitos son producidos independientemente por GMPs y MDPs y fueron capaces de distinguir entre el MPs y el cMoPs unicelular RNA la secuencia7.
Recientemente modificamos la estrategia bloquea "GMP" y Weissman "CMP" para identificar 6 subfracciones de médula de ratón C57BL/6J que contiene diferentes oligopotent y subconjuntos de progenitor mieloide linaje comprometido. Primero nos informan que la coloración de Ly6C y CD115 permite el aislamiento de oligopotent correctas, como progenitores de granulocitos (GPs) y progenitores de monocitos (MPs y cMoPs, que actualmente no podemos separar) del "GMP" fracción2 (LKS - CD34+ FcγRHola puerta; Figura 1). Posteriormente demostró que MDPs se encuentran predominantemente en la fracción "CMP" (CD34 LKS– + lo puerta de FcγR), que también contiene Flt3+ CD115lo y Flt3– subconjuntos7 (figura 1 ). El CMP-Flt3+ CD115lo fracción rinde GMPs y MDPs sobre transferencia adoptiva. El CMP-– de Flt3 subconjunto contiene progenitores que parecen intermedios entre CD115 CMP-Flt3+ lo y las células correctas. A diferencia de MDPs, CD115 CMP-Flt3+ lo tanto fracciones de CMP-Flt3– también poseen megakaryocyte y el potencial del eritrocito.
Es importante señalar, sin embargo, que no está actualmente claro si las fracciones "CMP" contienen progenitores que son realmente oligopotent (por ejemplo, las células individuales en el CMP-Flt3+ CD115lo fracción que poseen del neutrófilo, monocito DC, megacariocitos y eritrocito potencial), o alternativamente, comprenden una mezcla de progenitores con potencial más restringido de linaje. Formadoras de ensayos (culturas de metilcelulosa) revelaron las células con granulocitos (neutrófilos), eritrocitos, monocitos y potencial de megacariocitos (células GEMM) en la "AMC", CMP-+ CD115lo de Flt3 y fracciones de CMP-Flt3– 1 ,7, pero no permiten la evaluación del potencial de DC. En cambio, formadoras de ensayos demostraron la existencia de oligopotent correctas (progenitores con recuento de neutrófilos y monocitos potencial) en el "GMP" fracción1,2, y esto es apoyado por recientes unicelular de análisis transcriptómico8. No se actualmente sabe, sin embargo, si estos oligopotent BPF también produce otros granulocitos (eosinófilos, basófilos y mastocitos).
Basado en estos estudios, ahora demostramos cómo 7 superficie marcadores (c-Kit, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C y CD115) puede utilizarse para identificar y aislar estos 6 subconjuntos de oligopotent y de progenitores mieloides linaje comprometido. El protocolo descrito aquí puede ser aplicado para en vitro ensayos de cultura (culturas de la pastilla o líquido), en vivo experimentos transferencia adoptiva en ratones y el análisis molecular (secuencia de RNA a granel y unicelular, Western blotting, etc.).
El protocolo consta de 3 etapas: 1) preparación de una suspensión unicelular de la médula ósea las células, 2) enriquecimiento de progenitores hematopoyéticos (clasificación celular activada por el magnético) y 3) la identificación y aislamiento si lo desea, de subconjuntos del progenitor por flujo Citometría (mediante un analizador o un clasificador, según sea el caso). El primer paso es el aislamiento de las células de la médula ósea de los fémures y tibias de ratones eutanasia y es similar a otros protocolos previamente descritos9. A continuación, la muestra es enriquecida de células madre y progenitoras utilizando un cóctel de anticuerpos contra los marcadores de superficie celular de los eritrocitos, neutrófilos, monocitos, linfocitos, etc., para agotar las células diferenciadas. Esto no es obligatorio, pero se recomienda fuertemente para optimizar la detección de los subconjuntos de la progenitora y a reducir la cantidad de anticuerpos necesarios para la identificación del progenitor y el tiempo necesario para citometría de flujo. El protocolo de agotamiento del linaje más abajo describe Magnetic-Activated celular clasificación (MACS) usando un ratón linaje celular agotamiento Kit (que contiene anticuerpos biotinilados contra CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4 y Ter-119, más anti-biotina microesferas) y un separador magnético automatizado. El paso final es la identificación (y ordenar, si lo desea) de los subconjuntos de progenitoras por citometria de flujo. El panel de anticuerpos se describe a continuación (ver también tabla 1) ha sido diseñado para ser utilizado en un citómetro de flujo (analizador o clasificador) con 4 rayos láser (405 nanómetro, 488 nanómetro, 561 nm, 640 nm).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58061/58061fig1.jpg"> Figura 1: vías de diferenciación y progenitores de neutrófilos, monocitos y DC. El modelo recientemente revisado de mielopoyesis7 se ilustra, con las puertas de Weissman "CMP" (azul) y "Correctas" (verde)1 overlaid. Esta figura ha sido modificada desde Yáñez et al. 20177. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58061/58061fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="945">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2)</td>
			<td style="width:177px;">The Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:172px;">Cat#JAX:000664</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:172px;">Cat#130-090-858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">Cat#553733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse CD16/CD32 (Fc&#947;R; clone 93) APC-Cy7</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#101327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#108114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#105820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#128012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#135506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">Cat#560718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td style="width:177px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:172px;">Cat#C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">AutoMACS Separator</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>Use the &#34;deplete&#34; program</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">BD LSRFortessa</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>5 lasers, 15 colors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">BD FACS Aria III cell sorter</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>5 lasers, 13 colors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">FlowJo</td>
			<td style="width:177px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:172px;">https://www.flowjo.com</td>
			<td>For further analysis of the .fcs files</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification and isolation of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from mouse bone marrow

Progenitores mieloides que neutrófilos, monocitos y células dendríticas (DCs) pueden ser identificados en y aisladas de la médula ósea de ratones para análisis hematológicos e inmunológicos. Por ejemplo, estudios de las propiedades celulares y moleculares de las poblaciones progenitoras mieloides pueden revelar mecanismos subyacentes a la transformación leucémica, o demostrar cómo el sistema inmune responde a la exposición del patógeno. Previamente estrategias de citometría de flujo se describe para la identificación del progenitor mieloide han permitido avances significativos en muchos campos, pero las fracciones que se identifican son muy heterogéneas. Las estrategias más frecuentemente usadas bloquea definen fracciones de médula ósea que están enriquecidos para la población deseada, pero también contienen grandes cantidades de progenitores de "contaminar". Nuestros estudios recientes han resuelto gran parte de esta heterogeneidad y el protocolo que presentamos permite el aislamiento de 6 subpoblaciones de oligopotent y progenitores mieloides linaje comprometido de 2 describen anteriormente fracciones de médula ósea. El protocolo describe 3 etapas: 1) aislamiento de médula células, 2) enriquecimiento de progenitores hematopoyéticos por célula activada por el magnético clasificación (agotamiento del linaje por Mac) y 3) la identificación de subconjuntos del progenitor mieloide mediante citometría de flujo (incluyendo fluorescencia activada célula clasificación, FACS, si lo desea). Este enfoque permite la cuantificación de la progenitora y el aislamiento para una variedad de aplicaciones in vitro e in vivo y ya ha dado nuevo penetración en las vías y mecanismos de neutrófilos, monocitos y la diferenciación de DC.

Utilizando el protocolo descrito anteriormente, es posible obtener células 100 millones (incluyendo células de sangre rojas, o 50 millones de células nucleadas) de fémur y tibia (2 patas) de un ratón C57BL/6J (6-8 semanas edad, hombres o mujeres). 1-2 millones Lin– células pueden ser aisladas por ratón por agotamiento de MACS de células Lin+ .
Cada uno de los subconjuntos de progenitor mieloide 6 ...

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Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Demostramos cómo identificar y aislar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de médula murine usando una combinación de magnético y fluorescencia clasificación (MACS y FACS). Este protocolo puede ser utilizado para RNA/proteína análisis, experimentos de transferencia adoptiva en vivo y en vitro ensayos de cultura (culturas de la pastilla o líquido).

Identificación y aislamiento de Oligopotent y linaje comprometido progenitores mieloides de la médula ósea de ratón

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Diferenciar los roles funcionales de la expresión génica de las células inmunes y no inmunes en la colitis de ratón por Trasplante de Médula Ósea

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Investigación

Inmunología e Infección

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Investigación de la polarización de macrófagos utilizando la médula ósea macrófagos derivados

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

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Generación e identificación de GM-CSF Derivado alveolares-como los macrófagos y las células dendríticas A partir de médula ósea de ratones

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...