Name: identification and isolation of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from mouse bone marrow
Uploaded: 2018-07-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow at JoVE.com

Detta protokoll har utvecklats med medel från styrelsen av guvernörer regenerativ medicin institutet vid Cedars-Sinai Medical Center (HSG), en karriär inom immunologi fellowship från den amerikanska Association av Immunologer (till AY och HSG) och en Scholar Award från American Society hematologi (till AY). Vi tackar Flow flödescytometri kärnan på Cedars-Sinai Medical Center för hjälp med FACS sortering.

Alla metoderna som beskrivs här godkändes av institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av Cedars-Sinai Medical Center.
1. isolering av mus benmärg och förberedelse av en enda cellsuspension
<ol><li>Avliva musen i enlighet med institutionella riktlinjer.</li>
	<li>Placera euthanized musen på ryggen och spraya den med 70% etanol (EtOH). Gör en liten (3-5 mm) snitt i varje bakbenen på den fotled nivå med skarpa, spetsiga sax, och dra huden mot kroppen för att ta bor...

<ol>
	<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRF8+acts+in+lineage-committed+rather+than+oligopotent+progenitors+to+control+neutrophil+vs+monocyte+production.">IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production.</a> Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).</li><li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX3CR1++CD115++CD135++common+macrophage/DC+precursors+and+the+role+of+CX3CR1+in+their+response+to+inflammation.">CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).</li><li>Fogg, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+bone+marrow+progenitor+specific+for+macrophages+and+dendritic+cells.">A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells.</a> Science. 311 (5757), 83-87 (2006).</li><li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clonogenic+common+Flt3+M-CSFR++plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow.">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).</li><li>Hettinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+monocytes+and+macrophages+in+a+committed+progenitor.">Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor.</a> Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte-monocyte+progenitors+and+monocyte-dendritic+cell+progenitors+independently+produce+functionally+distinct+monocytes.">Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes.</a> Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).</li><li>Olsson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+mixed-lineage+states+leading+to+a+binary+cell+fate+choice.">Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice.</a> Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).</li><li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation.">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+regulatory+factor+8+and+the+regulation+of+neutrophil,+monocyte,+and+dendritic+cell+production.">Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production.</a> Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).</li><li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors.">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).</li></ol>

Den Weissman gating strategi för mus myeloida stamceller identifiering1 har varit guldmyntfoten för Immunologer och hematologer för nästan 20 år, men det framgår nu att ”CMP” och ”GMP” grindarna är mycket heterogen och mer exakt Usenets strategier behövs. Det protokoll som vi har beskrivit här tillåter identifiering av oligopotent och härstamning-begått delmängder i C57BL/6J möss för mer exakt kvantifiering av specifika myeloida och kartläggning av myelopoiesis vägar, liks...

Monocyter och neutrofiler dendritiska celler (DCs) är myeloida celler som uppstår från hematopoetiska progenitorceller, främst i benmärgen, genom en process som kallas myelopoiesis. Gemensamma myeloida (CMPs) har potential att producera myeloida celler, samt megakaryocyter och erytrocyter, men inte lymfoida celler. Granulocyt-monocyt stamfäder (god tillverkningssed), som härledas från CMPs, producera granulocyter och monocyter, men har förlorat megakaryocyt och erytrocyt potentiella. Monocyter och klassisk och dess DCs (cDCs/PDC) är också tänkt att uppstå från gemensamma stamfäder kallas monocyt-DC stamfäder (MDPs), som produceras av CMPs. successiv inskränkning av härstamning potential i slutändan resulterar i härstamning-begått föräldraparets: granulocyt stamfäder, monocyt stamfäder och dendritiska cellen stamfäder (figur 1).
Weissman och kollegor rapporterade att CMPs finns i Lin– c-Kit+ Sca-1– (LKS–) CD34+ FcγRlo bråkdel av mus benmärgen, medan god tillverkningssed ingår i den LKS– CD34+ FcγR Hej bråkdel1. Men är dessa ”CMP” och ”GMP” fraktioner mycket heterogen. Exempelvis innehåller ”GMP” fraktionen också härstamning-begått granulocyt stamfäder och monocyt föräldraparets1,2. MDPs rapporterades separat vara CX3CR1+ Flt3+ CD115+ stamfäder som också uttrycka CD34 och FcγR3,4. MDPs ge upphov till cDC/pDC-producerande gemensamma DC stamfäder (CDP), som har rapporterats att uttrycka lägre nivåer av c-Kit (CD117) och ingår inte i LKS– del5.
Tidigare antogs det att monocyter uppstå via en enda väg (CMP-GMP-MDP-monocyt). Konsekvent med denna modell, monocyt-begått stamfäder som produceras av god tillverkningssed (heter monocyt progenitorceller, MPs)2 och MDPs (heter gemensamma monocyt progenitorceller, cMoPs)6 verkar vara samma celler på grundval av delade ytan markör uttryck . Dock vi nyligen visat att monocyter produceras oberoende av god tillverkningssed och MDPs, och kunde urskilja mellan parlamentsledamöter och cMoPs av encelliga RNA-sekvensering7.
Vi ändrade nyligen den Weissman ”CMP” och ”GMP” Usenets strategi för att identifiera 6 och av C57BL/6J mus benmärgen som innehåller olika oligopotent och härstamning-begått myeloida stamceller deluppsättningar. Första rapporterade vi att färgning för Ly6C och CD115 tillåter isoleringen av oligopotent god tillverkningssed, och granulocyt stamfäder (GPs) samt monocyt stamfäder (MPs och cMoPs, som vi för närvarande inte att separera) från ”GMP” bråkdel2 (LKS - CD34+ FcγRHej gate; (Se figur 1). Vi visade senare att MDPs finns huvudsakligen i ”CMP” fraktionen (LKS– CD34+ FcγRlo gate), som också innehåller Flt3+ CD115lo och Flt3– delmängder7 (figur 1 ). Den CMP-Flt3+ CD115lo bråkdel ger både god tillverkningssed och MDPs vid överföring. Delmängden CMP-Flt3– innehåller stamfäder som verkar vara intermediärer mellan CMP-Flt3+ CD115lo celler och god tillverkningssed. Till skillnad från MDPs äger både CMP-Flt3+ CD115lo och CMP-Flt3– fraktioner också megakaryocyt och erytrocyt potentiella.
Det är viktigt att Observera dock att det är för närvarande oklart om ”CMP” fraktioner innehåller stamfäder som verkligen är oligopotent (t.ex. enskilda celler inom den CMP-Flt3+ CD115lo bråkdel som besitter neutrofiler, monocyt, DC, megakaryocyt och erytrocyt potentiella), eller alternativt kan bestå av en blandning av föräldraparets med mer begränsad härstamning potential. Kolonibildande analyser (metylcellulosa kulturer) avslöjade celler med granulocyt (neutrofila), erytrocyt, monocyt och megakaryocyt potentiella (GEMM celler) i ”CMP”, CMP-Flt3+ CD115lo och CMP-Flt3– fraktioner1 ,7, men tillåter inte bedömningen av DC potential. Däremot kolonibildande analyser visat förekomsten av oligopotent god tillverkningssed (föräldraparets med både neutrofila och monocyt potentiella) i ”GMP” bråkdel1,2, och detta stöds av senaste encelliga transcriptomic analys8. Det är för närvarande okänt, men huruvida dessa oligopotent genetiskt modifierade växter producerar även andra granulocyter (eosinofiler, basofiler och mastceller).
Baserat på dessa studier, visar vi nu kan hur 7 yta markörer (c-Kit, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C och CD115) användas för att identifiera och isolera dessa 6 undergrupper av oligopotent och härstamning-begått myeloida. Protokollet beskrivs här kan användas för in vitro- kultur analyser (metylcellulosa eller vätska kulturer), in-vivo överföring experiment på möss, och molekylär analys (bulk och encelliga RNA-sekvensering, Western blotting, etc.).
Protokollet består av 3 steg: (1) förberedelse av en enda cellsuspension av benmärg celler, 2) berikning för hematopoetiska progenitorceller (magnetisk-aktiverad cell sortering), och 3) identifiering och isolering om så önskas, av stamceller delmängder av flöde flödescytometri (med en analysator eller en sorterare, i förekommande fall). Det första steget är isoleringen av benmärgsceller från lårbenet och skenbenet euthanized möss och liknande till andra tidigare beskrivna protokoll9. Nästa, provet är berikad för stamceller och stamceller celler med en cocktail av antikroppar mot cell yta markörer av neutrofiler, lymfocyter, monocyter, erytrocyter, etc., för att tömma de differentierade cellerna. Detta är inte obligatoriskt, men rekommenderas starkt att optimera upptäckten av stamceller delmängder, och att minska mängden av antikroppar som behövs för identifiering av stamceller och den tid som krävs för flödescytometri. Lineage utarmning protokollet nedan beskriver Magnetic-Activated Cell sortering (Mac) med hjälp av en mus härstamning Cell utarmning Kit (som innehåller biotinylerade antikroppar mot CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4, och Ter-119, plus anti biotin Mikrokulor) och en automatiserad magnetiska avskiljare. Det sista steget är att identifiera (och sortering, om så önskas) av stamceller delmängder av flödescytometri. Panelen antikropp beskrivs nedan (se även tabell 1) har utformats för att användas i en flödescytometer (analyzer eller sorterare) med 4 lasrar (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58061/58061fig1.jpg"> Figur 1: antal neutrofiler, monocyt och DC stamfäder och differentiering vägar. Den nyligen reviderade modellen av myelopoiesis7 illustreras, med Weissman grindarna för ”CMPs” (blå) och ”genetiskt modifierade växter” (grön)1 överlagras. Denna siffra har ändrats från Yáñez et al. 20177. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58061/58061fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="945">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2)</td>
			<td style="width:177px;">The Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:172px;">Cat#JAX:000664</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:172px;">Cat#130-090-858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">Cat#553733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse CD16/CD32 (Fc&#947;R; clone 93) APC-Cy7</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#101327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#108114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#105820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#128012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#135506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">Cat#560718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td style="width:177px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:172px;">Cat#C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">AutoMACS Separator</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>Use the &#34;deplete&#34; program</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">BD LSRFortessa</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>5 lasers, 15 colors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">BD FACS Aria III cell sorter</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>5 lasers, 13 colors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">FlowJo</td>
			<td style="width:177px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:172px;">https://www.flowjo.com</td>
			<td>For further analysis of the .fcs files</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification and isolation of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from mouse bone marrow

Myeloida som ger neutrofiler, monocyter och dendritiska celler (DCs) kan identifieras i och isolerad från benmärgen hos möss för hematologiska och immunologiska analyser. Exempelvis kan studier av de cellulära och molekylära egenskaperna hos myeloida stamceller populationer avslöja mekanismerna bakom leukemiska transformation, eller demonstrera hur immunförsvaret reagerar på patogen exponering. Tidigare beskrivna flöde flödescytometri strategier för myeloida stamceller identifiering har aktiverat betydande framsteg på många områden, men de fraktioner som de identifierar är mycket heterogen. De vanligaste Usenets strategierna definiera benmärgen fraktioner som är berikad för önskad befolkningen, men också innehåller ett stort antal ”förorena” stamfäder. Vår nyligen genomförda studier har löst mycket av denna heterogenitet, och det protokoll som vi presenterar här tillåter isolering av 6 subpopulations av oligopotent och härstamning-begått myeloida från 2 tidigare beskrivits benmärgen fraktioner. Protokollet beskrivs 3 faser: 1) isolering av benmärg celler, 2) berikning för hematopoetiska progenitorceller genom magnetisk-aktiverad cell sortering (härstamning utarmning av Mac-datorer), och 3) identifiering av myeloida stamceller delmängder av flödescytometri (inklusive fluorescens-aktiverad cell sortering, FACS, om så önskas). Denna metod tillåter stamceller kvantifiering och isolering för en mängd olika in vitro - och in-vivo -program, och har redan gett roman insikt vägar och mekanismer av neutrofiler, monocyt och DC differentiering.

Med hjälp av protokollet som beskrivs ovan, är det möjligt att få ~ 100 miljoner celler (inklusive röda blodkroppar eller ~ 50 miljoner kärnförsedda celler) från både lårbenet och förbenade (2 ben) av en C57BL/6J mus (6-8 veckor gammal, man eller kvinna). 1-2 miljoner Lin– celler kan isoleras per mus av MACS uttömning av Lin+ -celler.
Varje 6 myeloida stamceller delmängder utgör ~ 1-4% av Li...

Watch this Scientific Journal Video about Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow at JoVE.com

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Vi visar hur att identifiera och isolera 6 delmängder av myeloida från murina benmärg med en kombination av magnetiska och fluorescens sortering (Mac och FACS). Detta protokoll kan användas för in vitro- kultur analyser (metylcellulosa eller vätska kulturer), in-vivo överföring experiment och RNA och protein analyser.

Identifiering och isolering av Oligopotent och härstamning-begått myeloida från mus benmärg

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

This method could be helpful for hematologists and immunologists studying the production and function of myeloid cells, including neutrophils, monocytes, and dendritic cells. The main advantage of this technique is that it enables more precise identification of myeloid progenitor subsets than previous strategies. To enrich bone marrow cells for progenitors by magnetic-activated cell sorting, or MACS, pellet the cells by centrifugation and resuspend the pellet in 40 microliters of MACS staining buffer per one times 10 to the seven bone marrow cells.To deplete differentiated lineage positive cells, add 10 microliters of biotin antibody cocktail per one times 10 to the seven cells and to mix by pipetting for a 10 minute incubation at four degrees Celsius. At the end of the incubation, add 30 microliters of staining buffer per one times 10 to the seven cells with mixing, followed by 20 microliters of anti-biotin microbeads per one times 10 to the seven cells. After 15 minutes at four degrees Celsius, wash the cells with one milliliter of staining buffer per one times 10 to the seven cells and resuspend the pellet in 500 microliters of fresh staining buffer for up to one times 10 to the eight cells.Next, set up the automated magnetic separator according to the manufacturer's instructions and place the tube of labeled cells into the separator. Begin the negative selection program to collect the negative fraction which contains the progenitor enriched lineage negative cells. Pellet the lineage negative cells by centrifugation and resuspend the pellet, which is now white, in two milliliters of staining buffer per mouse for counting.To isolate the myeloid progenitor cells by FACS, add one times 10 to the fifth lineage negative cells to each of eight control microcentrifuge tubes for voltage selection and color compensation and add the rest of the cell sample to a ninth microcentrifuge tube for staining with all seven of the surface marker antibodies of interest for progenitor identification and sorting. Pellet the cells by centrifugation and resuspend the control pellets in 100 microliters of FACS staining buffer and the experimental sample pellet in 100 microliters of staining buffer per five times 10 to the six cells. Next, add anti-CD16/CD32 antibody to the Fc gamma receptor single stain tube and the sample tube.Vortex gently and incubate the samples for 10 minutes at four degrees Celsius. At the end of the incubation, add the other antibodies to the appropriate corresponding single stain tubes and to the sample tube and after gentle vortexing, incubate the samples for 15 minutes at four degrees Celsius. At the end of the incubation, add 900 microliters of staining buffer to the control tubes and one milliliter of staining buffer per one times 10 to the seven cells to the sample tube for centrifugation.Resuspend the control pellets in 200 microliters of fresh staining buffer per tube and the experimental pellet in 500 microliters per 2.5 times 10 to the seven cells and transfer the labeled cells to individual corresponding five milliliter FACS tubes. Then set up the flow cytometer according to standard protocols and use the unstained and single stained controls to set the voltages and the color compensations. To identify and isolate the myeloid progenitor cells, load the experimental cell sample onto the cytometer and create a forward scatter area versus side scatter area plot, gating to exclude the debris and dead cells.Create a forward scatter height versus forward scatter width plot of the live cells and gate to exclude the doublets. Repeat this process with a side scatter height versus side scatter width plot of the forward scatter singlets and gate to exclude the doublets. Create a Sca-1 versus c-Kit plot and gate to select the c-Kit positive Sca-1 negative progenitors.Then create a CD-34 versus FC gamma receptor plot and gate to select the mixed common myeloid progenitor and mixed granulocyte monocyte progenitor populations. It's important to gate the mixed common myeloid progenitor and mixed granulocyte monocyte progenitor populations as precisely as possible. It can be helpful to use a pseudo-color density plot or a contour plot for more accurate gating.Use the cells in the mixed common myeloid progenitor gate to create a CD115 versus Flt3 plot and gate to select the common myeloid progenitor Flt3 positive CD115 low cells, the common myeloid progenitor Flt3 negative CD115 low cells, and the Flt3 positive CD115 high monocyte dendritic cell progenitors. Use the cells in the mixed granulocyte monocyte progenitor gate to create a Ly6C versus FC Gamma receptor plot and gate to select the Ly6C negative cells and the Ly6C positive cells. Then create a CD115 versus Flt3 plot for each gated mixed granulocyte monocyte progenitor cell subpopulation and gate the Ly6C negative Flt3 negative CD115 low granulocyte monocyte progenitors, the Ly6C positive Flt3 negative CD115 low granulocyte progenitors, and the Ly6C positive Flt3 negative CD115 high monocyte progenitors.Max lineage depletion is efficient at depleting differentiated cells and for enriching for the c-Kit positive progenitor cells. The lineage negative fraction does still contain some c-Kit negative cells, but these cells will be eliminated in subsequent flow cytometry gating steps. Progenitor yields after FACS sorting can vary depending on the sorter settings used, but it should be possible to obtain between one to four times 10 to the fourth cells per fraction from each mouse with a post-sort purity of greater than 95%for each fraction.Good staining is critical for clean separation of the populations. You may need to titrate the antibodies or choose different fluorophores to ensure optimal separation. This protocol can be used to identify progenitor cells to assess differences in bone marrow composition between samples, to isolate progenitors for molecular analysis or to assess their ability to produce myeloid cells.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Isolering, rening och märkning av benmärg hos möss Neutrofiler för funktionella studier och adoptivföräldrar Experimentera Transfer

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolering av myeloida dendritiska celler och epitelceller från Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Härledd från benmärg Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolering och intravenös injektion av murin benmärg härledda Monocyter

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Spårning musbenmärg Monocyter<em&gt; In Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Myeloid cellisolering från mushud och dränerande lymfkörteln Efter Intradermal immunisering med levande försvagade<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoiter

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Murin bakbenen rörben Dissection och benmärg Isolering

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Generering och identifiering av GM-CSF Derived Alveolära liknande makrofager och dendritiska celler från benmärg från mus

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescensaktiverad cellsortering för Rening av Plasmacytoid dendritiska celler från benmärg från mus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Generation av stort antal myeloida och dendritiska cellen prekursorer från murina benmärg med en roman Cell sortering strategi

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...