Durch eine schnelle Bioorthogonal Reaktion Konjugate genetischen Codierung einer nicht-kanonische Aminosäure für die Erzeugung von Antikörper-Wirkstoff

Diese Methode ist ein wichtiges Werkzeug auf dem Gebiet der Proteinmodifikation und ermöglicht die einfache und effiziente Erzeugung von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten. Die Hauptvorteile dieser Technik sind die einfache Handhabung, die hohe Ausbeute der Antikörperproduktion, die Geschwindigkeit der Psychodisionsreaktion und die Stabilität der gebildeten Verbindung. Beginnen Sie dieses Verfahren mit wachsenden HEK-Suspensionszellen, wie im Textprotokoll beschrieben.

Wenn die Dichte von 2,5 Millionen Zellen pro Milliliter erreicht ist, bereiten Sie eine frische Lösung des Cyclopropenderivats von Lysin, oder CpK, in 1 Mol-Natriumhydroxid vor. Fügen Sie 2,5 Milliliter CpK zu ExpressionMedium mit Antibiotika ergänzt. Mischen Sie die Lösung gut und fügen Sie 250 Mikroliter eines Molaren HCl, dann sterilisieren Sie die Lösung mit einem 22-Mikron-Filter.

Jetzt Zentrifugieren 125 Millionen Zellen bei der Zieldichte für fünf Minuten bei 500 x g. Nach der Zentrifugation fügen Sie das DNA-Transfektionsreagenz-Gemisch in das Expressionenmedium, das CpK enthält, und verwenden Sie dieses Medium, um die Zellen wieder auszusetzen. Sechs bis sieben Tage nach Zugabe von CpK die Trastuzumab-haltigen CpK-Antikörper aus dem Überstand ernten, indem sie die Zellen 15 Minuten lang bei 3.000 x g zentrifugieren.

Filtern Sie dann den Überstand. Nun 5x Perlenwaschpuffer in 250 Milliliter konische Schläuche geben und mit dem Überstand mischen und das vorfinanzierte Protein A Harz hinzufügen. Legen Sie das konische Rohr drei Stunden lang bei Raumtemperatur auf eine Walze, um den Antikörper und den Überstand nach unten zu ziehen.

Nach der Inkubation das Protein A-Harz mit dem Überstand in eine Säule übertragen und die Flüssigkeit durchfließen lassen. Dann fügen Sie 25 Milliliter Waschpuffer hinzu und lassen Sie diesen durchfließen. Fügen Sie dem Sammelrohr einen Milliliter eines Molarenphosphatpuffers, 150 Millimolar-Natriumchlorid hinzu und den Antikörper mit vier Millilitern von 1 Molar-Natriumcitrat pH 3 zu vereiteln.

Die saure Lösung wird sofort neutralisiert, da sie durch die bereits im Sammelrohr vorhandene Basislösung aus der Säule kommt. Als nächstes verdünnen Sie den Antikörper mit 10 Milliliter PBS. Den Antikörper durch Zentrifugalfiltration auf 5 bis 1 Milliliter konzentrieren und den Puffer dreimal mit PBS austauschen.

Reinigen Sie die Proben mit FPLC mit einer butylhydrophoben Wechselwirkungssäule mit einem Gradienten von null bis 100 % des niedrigen Salzpuffers im hohen Salzpuffer über 30 Minuten. Sammeln Sie alle Fraktionen und überwachen Sie die Elution bei 280 Nanometern. Konzentrieren Sie die Fraktionen, die Antikörper durch Zentrifugalfiltration enthalten, und tauschen Sie den Puffer dreimal mit PBS aus.

Der Antikörper kann dann bei vier Grad Celsius gelagert werden. Monomethyl-Auristatin E, oder MMAE, ist hochgiftig. Verwenden Sie daher Handschuhe und Schutzbrillen beim Umgang mit MMAE-Derivaten.

Wenn Sie unveränderte MMAE als Steuerung verwenden, behandeln Sie das feste Produkt in einer Dunstabzugshaube, wenn Sie die Lagerlösung im MSO vorbereiten. Um den Antikörper mit Tetrazin-haltigem Molekül zu konjugieren, verdünnen Sie 10 Moläquivalenz von Tetrazin MMAE pro Antikörper mit 20 Mikroliter Acetonitril und 76 Mikroliter PBS in einem kleinen konischen Rohr. Fügen Sie ein molares Äquivalent von Trastuzumab-Lager CPK hinzu.

Mischen Sie gründlich und lassen Sie für drei Stunden bei Raumtemperatur reagieren, um Trastuzumab mit MMAE verbunden zu bilden. Andere Moleküle als MMAE, die potenziell größer und sterisch behinderter sind, können mit diesem Protokoll mit dem Antikörper in Verbindung gebracht werden. Fügen Sie das gesamte Volumen der Reaktion auf die Spinsäule und Zentrifuge bei 1500 x g für eine Minute.

Um das Konjugat zu analysieren, gleicht die HPLC-HIC-Säule fünf Minuten lang mit einem 100% hohen Salzpuffer aus. Mischen Sie dann 15 Mikroliter einer ein Milligramm pro Milliliter Lösung von Trastuzumab verbunden mit MMAE mit 15 Mikroliter 2X hohen Salzpuffer in einer Durchstechflasche. Injizieren Sie das Gemisch in die HPLC-Säule.

Elute in einem isokratischen 1 Milliliter pro Minute Durchfluss mit 100% hohem Salzpuffer für eine Minute. Folgen Sie dies mit einem 15-minütigen Gradienten von 100 bis null Prozent des hohen Salzpuffers in niedrigem Salzpuffer. Überwachen Sie die Elution mit 280 Nanometern.

Integrieren Sie die Spitzen des Chromatogramms mit Retentionszeiten von 7,5, 9,2 und 11,5 Minuten, die Trastuzumab mit null, einem und zwei konjugierten Toxinen entsprechen. Berechnen Sie nun die DAR- und -addieren Sie die Bereiche der Spitzen mit 9,2 Minuten, die ein Gewicht von einem hat, und 10,5 Minuten, die ein Gewicht von zwei hat, und dividieren Sie durch die Gesamtfläche der drei Spitzen. Um das Konjugat durch LC-MS zu analysieren, deglycosylate 30 Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter ADC und der unmodifizierte Antikörper unter nicht reduzierenden Bedingungen mit 250 Einheiten PNGase F für mindestens sechs Stunden bei 37 Grad Celsius.

Das Serum auftauen und durch einen 22-Mikron-Filter filtern. Dann füllen Sie die Außenbrunnen einer 96 Brunnenplatte mit Wasser. In den zentralen Brunnen 90 Mikroliter Serum mit 10 Mikrolitern von einem Milligramm pro Milliliter Trastuzumab Tetramethylrhodamine in PBS bei einer Endkonzentration von 1 Milligramm pro Milliliter vermischen.

Legen Sie die Platte in einen Mitbrutplatz mit Feuchtigkeit bei 37 Grad Celsius und vier Prozent CO2. Alle 24 Stunden während fünf Tagen, Pipette jeder gut gründlich zu mischen und nehmen Sie eine fünf Mikroliter Aliquot. Blitz einfrieren Sie das Aliquot mit flüssigem Stickstoff und lagern bei 80 Grad Celsius.

Sobald alle Proben gesammelt wurden, tauen Sie die Aliquots auf und analysieren Sie sie mit einem indirekten ELISA, wie im Textprotokoll beschrieben. Alternativ kann ein kommerzielles ELISA-Kit verwendet werden, um die Konzentration des ADC zu messen. Zwei Tage vor dem Test die äußeren Brunnen einer 96-Brunnenplatte mit Wasser füllen.

Heben Sie dann Zellen mit 05%Trypsin in 5 Millimolar EDTA. Zentrifugieren Sie die Zellen drei Minuten bei 250 x g und setzen Sie sie in einem neuen Medium wieder auf. Dann säen 3 000 Zellen in 100 Mikroliter pro Brunnen in 96 Brunnenplatten und legen Sie sie wieder in den Inkubator.

Zwei Tage nach dem Aussaat der Zellen, bereiten Sie serielle Verdünnungen aller Proben in Dreifache mit 1%DMSO in vollständigem Medium. Fügen Sie nun 100 Mikroliter jeder Probe in jeden Brunnen und inkubieren für fünf Tage bei 37 Grad Celsius und vier Prozent CO2. Messen Sie am fünften Tag die Zelllebensfähigkeit.

Verwenden Sie zu diesem Zweck ein kommerzielles Kit, um die Zellen zu lysieren und die freigesetzte ATP zu messen. Zeichnen Sie den Prozentsatz des Signals in Bezug auf Kontrollzellen, die mit 1%DMSO behandelt werden. ADCs können bei 37 Grad Celsius für fünf Tage im Serum inkubiert und auf Zytotoxizität untersucht werden, um die funktionelle Stabilität zu beweisen.

Mit diesem Verfahren kann ein Antikörper mit einem Cyclopropengriff mit Erträgen über 20 Milligramm pro Liter nach der Protein-A-Reinigung erhalten werden. Der produzierte Antikörper kann schnell und standortspezifisch mit einem Toxin konjugiert werden, das ein Tetrazin trägt. Bei konjugation des Antikörpers mit einem Toxin sind die durchschnittlichen Wirkstoff-Antikörper-Verhältnisse größer als 1,9, gemessen durch hydrophobe Wechselwirkungschromatographie.

Die Identität des ADC wird durch Massenspektrometrie bestätigt. Die erzeugte Dihydropyridizen-Bindung ist im menschlichen Serum über fünf Tage bei 37 Grad Celsius stabil. Das Antikörper-Wirkstoff-Konjugat ist potent und tötet selektiv Zellen mit hohem HER2-Spiegel ab, anstatt Zellen mit niedrigem HER2-Spiegel.

Darüber hinaus haben der Antikörper ohne das Toxin und das mit dem Tetrazin-Linker modifizierte Toxin eine sehr geringe Toxizität. Allein das Toxin zeigt eine nicht-HER2-abhängige Toxizität, die die Notwendigkeit des Targetings unterstreicht, um Selektivität zu erreichen. Nach diesem Verfahren können wir schnell und effizient Antikörper-Wirkstoff-Konjugate für die Behandlung von Tumoren vorbereiten.

Potenziell kann jedes Medikament, das mit einem Tetrazin funktionalisiert ist, mit jedem Antikörper in Verbindung gebracht werden, der auf einen Krebszell-Biomarker abzielt. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf jedes Proteinkonjugat, das für die Therapie oder Diagnose bestimmt ist.