यह विधि प्रोटीन संशोधन के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करती है, जिससे एंटीबॉडी दवा कंजूगेट्स की फेसियल और कुशल पीढ़ी को सक्षम किया जा सके। इस तकनीक के मुख्य फायदे हैंडलिंग में आसानी, एंटीबॉडी उत्पादन की उच्च उपज, मनोदविकार प्रतिक्रिया की गति और गठित लिंकेज की स्थिरता है। पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित एचईके निलंबन कोशिकाओं के साथ इस प्रक्रिया को शुरू करें।

जब मिलीलीटर प्रति 2.5 मिलियन कोशिकाओं का घनत्व पहुंच जाता है, तो 1 मोलर सोडियम हाइड्रोक्साइड में लिसाइन या सीपीके के साइक्लोप्रोपेन व्युत्पन्न का एक ताजा समाधान तैयार करें। एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक अभिव्यक्ति माध्यम के लिए सीपीके के 2.5 मिलीलीटर जोड़ें। समाधान को अच्छी तरह से मिलाएं और एक मोलर एचसीएल के 250 माइक्रोलीटर जोड़ें, फिर 22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके समाधान को निष्फल करें।

अब 500 x g पर पांच मिनट के लिए लक्ष्य घनत्व पर 125 मिलियन कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। अपकेंद्रित्र के बाद, सीपीके युक्त अभिव्यक्ति माध्यम में डीएनए-ट्रांसफेक्शन रीएजेंट मिश्रण जोड़ें और कोशिकाओं को फिर से खर्च करने के लिए इस माध्यम का उपयोग करें। सीपीके के अतिरिक्त होने के छह से सात दिन बाद, 3, 000 एक्स जी पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को अपकेंद्री करके सुपरनेट से ट्रास्टुज़ुमाब असर सीपीके एंटीबॉडी की कटाई करें।

इसके बाद सुपरनिट को छानलें। अब 250 मिलीलीटर शंकु नलियों में 5x मनका वॉश बफर जोड़ें और सुपरनेट के साथ मिलाएं और प्रीक्विलिब्रेटेड प्रोटीन ए राल जोड़ें। एंटीबॉडी और सुपरनेट नीचे खींचने के लिए कमरे के तापमान पर तीन घंटे के लिए एक रोलर पर शंकु नली रखें।

इनक्यूबेशन बाद, प्रोटीन एक राल को सुपरनैंट के साथ एक कॉलम में स्थानांतरित करें और तरल को प्रवाहित करने की अनुमति दें। फिर 25 मिलीलीटर वॉश बफर जोड़ें और उस तरह से प्रवाहित होने दें। संग्रह ट्यूब में एक मोलर फॉस्फेट बफर, 150 मिलीमोलर सोडियम क्लोराइड का एक मिलीलीटर जोड़ें और एंटीबॉडी को 1 मोलर सोडियम साइट्रेट पीएच 3 के चार मिलीलीटर के साथ एल्यूट करें।

अम्लीय समाधान तुरंत बेअसर हो जाता है क्योंकि यह संग्रह ट्यूब में पहले से मौजूद बुनियादी समाधान द्वारा कॉलम से आता है। इसके बाद, पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ एंटीबॉडी को पतला करें। अपकेंद्रित्र निस्पंदन द्वारा 5 से एक मिलीलीटर के लिए एंटीबॉडी ध्यान केंद्रित और PBS के साथ तीन बार बफर विनिमय ।

30 मिनट से अधिक उच्च नमक बफर में कम नमक बफर के शून्य से 100% ढाल के साथ एक ब्यूटिल हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन कॉलम का उपयोग करके एफपीएलसी द्वारा नमूनों को शुद्ध करें। सभी अंशों को इकट्ठा करें और 280 नैनोमीटर पर एल्यूशन की निगरानी करें। उन अंशों को केंद्रित करें जिनमें अपकेंद्रित्र निस्पंदन द्वारा एंटीबॉडी होते हैं और पीबीएस के साथ तीन बार बफर का आदान-प्रदान करते हैं।

इसके बाद एंटीबॉडी को चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जा सकता है । मोनोमिथाइल ऑरिस्टाटिन ई, या एमएमएई, अत्यधिक विषाक्त है। इसलिए, एमएमएई डेरिवेटिव को संभालते समय दस्ताने और चश्मे का उपयोग करें।

यदि आप एक नियंत्रण के रूप में असंशोधित एमएमएई का उपयोग करते हैं, तो एमएसओ में स्टॉक समाधान तैयार करते समय एक धुएं के हुड के अंदर ठोस उत्पाद को संभालें। टेट्राज़ीन असर अणु के साथ एंटीबॉडी को संयोजित करने के लिए, एक छोटी शंकु नली में एसीटोनिट्रिल के 20 माइक्रोलीटर और पीबीएस के 76 माइक्रोलीटर के साथ प्रति एंटीबॉडी टेट्राज़ीन एमएमएई के 10 मोलर तुल्यता को पतला करें। सीपीके असर trastuzumab के एक मोलर समकक्ष जोड़ें।

अच्छी तरह से मिलाएं और एमएमएई से जुड़े ट्रास्टुज़ुमाब बनाने के लिए कमरे के तापमान पर तीन घंटे तक प्रतिक्रिया करने की अनुमति दें। एमएमएई के अलावा अन्य अणुओं को संभावित रूप से बड़ा और अधिक स्टरल रुकावट इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके एंटीबॉडी से जोड़ा जा सकता है। एक मिनट के लिए 1500 x g पर स्पिन कॉलम और अपकेंद्रित्र पर प्रतिक्रिया की पूरी मात्रा जोड़ें।

संजूगेट का विश्लेषण करने के लिए, एचपीएलसी एचआईसी कॉलम को पांच मिनट के लिए 100% उच्च नमक बफर के साथ बराबर करें। फिर एक शीशी में 2X उच्च नमक बफर के 15 माइक्रोलीटर के साथ एमएमएई से जुड़े trastuzumab के मिलीलीटर समाधान प्रति मिलीग्राम के 15 माइक्रोलीटर मिलाएं। मिश्रण को एचपीएलसी कॉलम पर इंजेक्ट करें।

एक मिनट के लिए 100% उच्च नमक बफर के साथ एक आइसोक्रेटिक वन मिलीलीटर प्रति मिनट प्रवाह में एल्यूट। कम नमक बफर में उच्च नमक बफर के 100 से शून्य प्रतिशत तक 15 मिनट के ढाल के साथ इसका पालन करें। 280 नैनोमीटर पर एल्यूशन की निगरानी करें।

क्रोमेटोग्राम पर चोटियों को 7.5, 9.2 और 11.5 मिनट के प्रतिधारण समय के साथ एकीकृत करें, जो क्रमशः शून्य, एक और दो संयुग्मित विषाक्त पदार्थों के साथ ट्रास्टुज़ुमाब के अनुरूप है। अब, 9.2 मिनट पर चोटियों के क्षेत्रों को जोड़कर डार की गणना करें, जिसका वजन एक है, और 10.5 मिनट, जिसका वजन दो है, और तीन चोटियों के कुल क्षेत्रफल से विभाजित है। एलसी-एमएस द्वारा संजूगेट का विश्लेषण करने के लिए, सबसे पहले, एक मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर एडीसी के 30 माइक्रोलीटर और 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम छह घंटे के लिए PNGase एफ की 250 इकाइयों का उपयोग करके गैर-कम करने वाली स्थितियों में असंशोधित एंटीबॉडी को कम करने के लिए।

सीरम को पिघलाकर 22 माइक्रोन फिल्टर के जरिए फिल्टर करें। इसके बाद 96 कुएं की प्लेट के बाहरी कुओं को पानी से भर दें। केंद्रीय कुओं में, पीबीएस में एक मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर ट्रास्टुजुमाब टेट्रामेथाइलरोडमाइन के 10 माइक्रोलीटर के साथ सीरम के 90 माइक्रोलीटर में 1 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता पर मिलाएं।

थाली को ३७ डिग्री सेल्सियस और चार प्रतिशत CO2 पर आर्द्रता के साथ संतृप्त एक इनक्यूबेटर में रखें । पांच दिनों में हर 24 घंटे, प्रत्येक अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए और एक पांच माइक्रोलीटर aliquot लेने के लिए पिपेट । फ्लैश तरल नाइट्रोजन के साथ एलिकोट फ्रीज और ८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।

एक बार सभी नमूनों को एकत्र किया गया है, aliquots गल और एक अप्रत्यक्ष एलिसा का उपयोग कर विश्लेषण, के रूप में पाठ प्रोटोकॉल में विस्तृत । वैकल्पिक रूप से, एडीसी की एकाग्रता को मापने के लिए एक वाणिज्यिक एलिसा किट का उपयोग किया जा सकता है। परख से दो दिन पहले 96 कुएं की थाली के बाहरी कुओं को पानी से भर दें।

फिर 5 मिलीमोलर ईडीटीए में 05% ट्राइप्सिन के साथ कोशिकाओं को उठाएं। कोशिकाओं को 250 x ग्राम पर तीन मिनट और नए माध्यम में रिसिपेंड करें। फिर 96 अच्छी तरह से प्लेटों में 100 माइक्रोलीटर प्रति अच्छी तरह से बीज 3, 000 कोशिकाओं और उन्हें वापस इनक्यूबेटर में रखें।

कोशिकाओं को सीडिंग करने के दो दिन बाद, पूर्ण माध्यम में 1% DMSO के साथ ट्रिपलीकेट में सभी नमूनों के धारावाहिक कमजोर तैयार करें। अब प्रत्येक नमूने के १०० माइक्रोलीटर प्रत्येक कुएं में जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस और चार प्रतिशत CO2 पर पांच दिनों के लिए इनक्यूबेट । पांच दिन, कोशिका व्यवहार्यता को मापें।

इस उद्देश्य के लिए, कोशिकाओं को lyse और जारी एटीपी को मापने के लिए एक वाणिज्यिक किट का उपयोग करें । 1% DMSO के साथ इलाज कोशिकाओं को नियंत्रित करने के संबंध में संकेत का प्रतिशत प्लॉट। एडीसी सीरम में पांच दिनों के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड किया जा सकता है और कार्यात्मक स्थिरता साबित करने के लिए साइटोटॉक्सिकिटी के लिए कहा जा सकता है ।

प्रोटीन एक शुद्धि के बाद 20 मिलीग्राम प्रति लीटर से ऊपर की पैदावार के साथ इस प्रक्रिया का उपयोग करके साइक्लोप्रोपेंप हैंडल के साथ एक एंटीबॉडी प्राप्त की जा सकती है। उत्पादित एंटीबॉडी तेजी से और साइट-विशेष रूप से एक टेट्राज़ीन वाले विष के लिए संयुग्मित किया जा सकता है। टॉक्सिन के साथ एंटीबॉडी के संजीदशन पर, एंटीबॉडी अनुपात के लिए औसत दवा 1.9 से अधिक है, जैसा कि हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन क्रोमेटोग्राफी द्वारा मापा जाता है।

एडीसी की पहचान की पुष्टि मास स्पेक्ट्रोमेट्री से होती है। मानव सीरम में पांच दिनों से अधिक समय तक ३७ डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है । एंटीबॉडी दवा संजूगेट शक्तिशाली है और चुनिंदा HER2 के उच्च स्तर के साथ कोशिकाओं को मारता है, बजाय HER2 के कम स्तर के साथ कोशिकाओं ।

इसके अलावा, टॉक्सिन के बिना एंटीबॉडी और टेट्राज़ीन लिंकर के साथ संशोधित विष में बहुत कम विषाक्तता होती है। अकेले विष एक गैर HER2 निर्भर विषाक्तता को दर्शाता है जो चयनशीलता प्राप्त करने के लिए लक्ष्यीकरण की आवश्यकता को रेखांकित करता है । इस प्रक्रिया के बाद, हम ट्यूमर के इलाज के लिए एंटीबॉडी दवा conjugates तेजी से और कुशलता से तैयार कर सकते हैं।

संभवतः, टेट्राज़ीन के साथ कार्यात्मक किसी भी दवा को कैंसर सेल बायोमार्कर को लक्षित करने वाले किसी भी एंटीबॉडी से जोड़ा जा सकता है। इस तकनीक के निहितार्थ चिकित्सा या निदान के लिए इरादा किसी भी प्रोटीन conjugate करने के लिए विस्तार।

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