Name: expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow-derived dendritic cells and macrophages
Uploaded: 2018-10-30T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages at JoVE.com

وأيد هذا العمل بالتشيكية العلم مؤسسة (جاكر) (المشروع رقم 16-07425S)، تشارلز الجامعة منحة الوكالة (جاك) (رقم المشروع 923116) وعن طريق التمويل المؤسسي من معهد الوراثة الجزيئية، أكاديمية العلوم التشيكية الجمهورية (رفو 68378050).

تمت الموافقة على جميع الأساليب الموصوفة هنا "لجنة الخبراء" المعنية "رعاية الحيوانات التجريبية" لمعهد علم الوراثة الجزيئي، وأكاديمية العلوم للجمهورية التشيكية.
1-كاشف إعداد
<ol><li>إعداد المخزن المؤقت الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم (ACK). إضافة غ 4.145 NH4Cl و 0.5 غ كهكو3 إلى 50...

<ol>
	<li>Moghaddam, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity,+polarization+and+function+in+health+and+disease.">Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease.</a> Journal of Cellular Physiology. , (2018).</li><li>Qian, C., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+the+regulation+of+immunity+and+inflammation.">Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation.</a> Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).</li><li>Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function:+from+mechanisms+to+disease.">Neutrophil function: from mechanisms to disease.</a> Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).</li><li>Kondo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+and+myeloid+lineage+commitment+in+multipotent+hematopoietic+progenitors.">Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors.</a> Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).</li><li>Andrews, T., Sullivan, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+in+patients+with+inherited+defects+in+phagocytic+function.">Infections in patients with inherited defects in phagocytic function.</a> Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).</li><li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+biology+in+development,+homeostasis+and+disease.">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li><li>Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+factor+in+L-cell+conditioned+medium+capable+of+stimulating+colony+formation+by+mouse+marrow+cells+in+culture.">Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture.</a> Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).</li><li>Scheicher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+GM-CSF+induces+in+vitro+differentiation+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow.">Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).</li><li>Stanley, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+colony-stimulating+factor,+CSF-1.">The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1.</a> Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).</li><li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow.">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).</li><li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor.">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li><li>Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+non-equivalence+of+murine+(monocyte-)+macrophage+cells+in+biomaterial+and+inflammatory+models.">Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).</li><li>Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein:+a+perspective.">Green fluorescent protein: a perspective.</a> Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+In+Vivo+Imaging+Using+Fluorescent+Proteins.">Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).</li><li>Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+fluorescent+proteins.">Flow cytometry of fluorescent proteins.</a> Methods. 57 (3), 318-330 (2012).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+exogenous+genes+in+macrophages:+obstacles+and+opportunities.">The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities.</a> Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).</li><li>Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tolerance+induction+in+major+histocompatibility+complex+class+II-restricted+T+cells+specific+for+a+blood-borne+self-antigen.">Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen.</a> Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).</li><li>Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Characterization+of+the+New+Osteoclast+Progenitor+with+Macrophage+Phenotypes+Being+Able+to+Differentiate+into+Mature+Osteoclasts.">Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).</li><li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pCL+vector+system:+rapid+production+of+helper-free,+high-titer,+recombinant+retroviruses.">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).</li><li>Janssen, E., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptor+proteins+in+lymphocyte+activation.">Adaptor proteins in lymphocyte activation.</a> Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).</li><li>Ferguson, P. J., Laxer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+discoveries+in+CRMO:+IL-1beta,+the+neutrophil,+and+the+microbiome+implicated+in+disease+pathogenesis+in+Pstpip2-deficient+mice.">New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).</li><li>Holleman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+outcome+predictor+in+acute+leukemia+1+(OPAL1)+gene+is+not+an+independent+prognostic+factor+in+patients+treated+according+to+COALL+or+St+Jude+protocols.">Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols.</a> Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).</li><li>Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+Differentiation+of+Murine+Myeloid+Precursor+32D/G-CSF-R+Cells.">Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).</li><li>Kralova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transmembrane+Adaptor+Protein+SCIMP+Facilitates+Sustained+Dectin-1+Signaling+in+Dendritic+Cells.">The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).</li><li>Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960 (2014).</li><li>Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protocol+for+efficient+transfection+of+dendritic+cells+without+cell+maturation.">Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766 (2011).</li><li>Siegert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+siRNA+into+mouse+bone+marrow-derived+macrophages+and+dendritic+cells.">Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery:+Potential+Applications+for+Gene+and+Cell-Based+Therapies+in+the+New+Era+of+Personalized+Medicine.">Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine.</a> Genes &amp; Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li><li>Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+progress+in+gene+delivery+technology+based+on+chemical+methods+and+nano-carriers.">Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers.</a> Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).</li><li>Muruve, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome+recognizes+cytosolic+microbial+and+host+DNA+and+triggers+an+innate+immune+response.">The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response.</a> Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).</li><li>Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+humoral+immune+responses+to+viral+antigens+create+barriers+to+lung-directed+gene+therapy+with+recombinant+adenoviruses.">Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses.</a> Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).</li><li>Tallone, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+adenovirus+gene+delivery.">A mouse model for adenovirus gene delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).</li><li>Milone, M. C., O'Doherty, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+use+of+lentiviral+vectors.">Clinical use of lentiviral vectors.</a> Leukemia. , (2018).</li><li>McTaggart, S., Al-Rubeai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+vectors+for+human+gene+delivery.">Retroviral vectors for human gene delivery.</a> Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transience+of+transient+overexpression.">The transience of transient overexpression.</a> Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).</li></ol>

التعبير عن بروتين فائدة في الخلايا الهدف خطوة رئيسية في العديد من أنواع الدراسات البيولوجية. الضامة متمايزة والخلايا الجذعية من الصعب أن ترانسفيكت من تعداء القياسية وتقنيات توصيل النسخ العكسي. تجاوز تعداء هذه الخلايا المتمايزة بتوصيل النسخ العكسي من فروعه نخاع العظام، تليها التمايز عند...

وتمثل الخلايا النقوي جزءا لا يتجزأ من آليات الدفاع لدينا ضد مسببات الأمراض. فقادرة على سرعة القضاء على الميكروبات، فضلا عن خلايا الموت. وباﻹضافة إلى ذلك، كما أنها تشارك في تنظيم التنمية الأنسجة وإصلاح والحفاظ على التوازن1،،من23. كافة الخلايا النقوي تفرق من فروعه النقوي الشائعة في نخاع العظام. على التمايز إلى عدة مجموعات فرعية متميزة وظيفيا وشكليا إلى حد كبير تسيطر عليها السيتوكينات وعلى تركيبات مختلفة4. وتشمل المجموعات الأكثر كثافة درس الخلية النقوي المحببة بالعدلات والضامة والخلايا الجذعية. عيوب في أي من هؤلاء السكان يؤدي إلى عواقب تهدد الحياة وسبب الخلل الشديد في الجهاز المناعي لدى البشر والفئران1،2،،من35، 6.
خلافا بالعدلات المحببة، الخلايا الجذعية والضامة خلايا الأنسجة المقيمين وعلى وفرة في أجهزة المناعة منخفضة نسبيا. نتيجة لذلك إلى العزلة وتنقية الخلايا الجذعية الأولية والضامة للتجارب التي تتطلب عددا كبيرا من هذه الخلايا مكلفة وغالباً ما يكون من المستحيل. لحل هذه المشكلة، وضعت بروتوكولات للحصول على كميات كبيرة من الضامة متجانسة أو الخلايا الجذعية في المختبر. تستند هذه النهج على التفريق بين خلايا نخاع العظام موريني حضور السيتوكينات: بلعم محفزة لمستعمرة عامل (م-CSF) الضامة وعامل تحفيز مستعمرة بلعم المحببات (GM-CSF) أو يجند Flt3 ل الخلايا الجذعية7،،من89،10،،من1112. ويرد عادة الخلايا التي تم إنشاؤها بواسطة هذا الأسلوب في الأدب نخاع العظام المستمدة الضامة (بمدمس)، ونخاع العظام المستمدة من الخلايا الجذعية (بمدكس). لديهم المزيد من الخصائص الفسيولوجية مشتركة مع الابتدائي الضامة أو الخلايا الجذعية من خطوط الخلايا المناظرة. ميزة رئيسية أخرى إمكانية الحصول على هذه شكل خلايا وراثيا تعديل الفئران13. الدراسات المقارنة بين البرية من نوع الخلايا والخلايا المشتقة من الفئران المعدلة وراثيا غالباً ما تكون حاسمة بالنسبة لوظائف الرواية الكشف عن الجينات أو البروتينات للفائدة.
تحليل التعريب سوبسيلولار للبروتينات في الخلايا الحية يتطلب اقتران تسمية الفلورسنت للبروتين من الفائدة في فيفو. الأكثر شيوعاً ويتحقق ذلك بالإعراب عن بناء الانصهار وراثيا المرمزة تتألف من البروتين تم تحليلها الاقتران (غالباً عن طريق رابط قصيرة) إلى بروتين فلوري (مثلاً.، أخضر نيون البروتين (بروتينات فلورية خضراء))14،15 , 16-التعبير عن كلمات فلوريسسينتلي البروتينات في الخلايا الجذعية أو الضامة التحدي. هذه الخلايا عموما من الصعب ترانسفيكت بالإجراءات القياسية تعداء وأوجه الكفاءة التي تميل إلى أن تكون منخفضة جداً. وعلاوة على ذلك، تعداء عابر وأنه يولد الإجهاد الخلوية وكثافة المحققة من الأسفار قد لا تكون كافية للفحص المجهري17. من أجل الحصول على جزء معقول من هذه الخلايا مع مستوى كاف من التعبير التحوير، وعدوى الخلايا السلف نخاع العظام مع النسخ العكسي أصبحت هذه التفرقة اللاحقة إلى بمدمس أو بمدكس ومتجهات فعالة جداً النهج. وقد أتاح تحليل البروتينات النقوي المنشأ في بيئتها الخلوية الأصلية، سواء في حالة مستقرة أو أثناء العمليات التي تعتبر حاسمة بالنسبة للاستجابة المناعية مثل البلعمه، وتشكيل المشبك المناعية أو الهجرة. هنا، يمكننا وصف بروتوكول يسمح لتعبير مستقر من البروتينات فلوريسسينتلي المعلمة الاهتمام بنخاع العظام موريني المستمدة الضامة، والخلايا الجذعية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>15028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>10270</td>
			<td>For media suplementation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Lachema, Brno, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>BB Pharma AS, Prague, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PENICILIN G 1,0 DRASELN&#193; SOL&#39; BIOTIKA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>S9137</td>
			<td>Streptomycin sulfate salt powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Dr. Kulich Pharma, Hradec Kr&#225;lov&#233;, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, linear, MW 25,000</td>
			<td>Polyscience, Warrington, PA, USA</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>101212</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>123110</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>117310</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)</td>
			<td>315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>H1398</td>
			<td>flow cytometry analysis use at 1-2 &#181;g/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow-derived dendritic cells and macrophages

الخلايا الجذعية والضامة هي خلايا الحاسمة التي تشكل الخط الأول للدفاع ضد العوامل الممرضة. كما أنها تؤدي أدواراً هامة في بدء استجابة مناعية تكيفية. العمل التجريبي مع هذه الخلايا بدلاً من ذلك التحدي. كثرة في الأعضاء والأنسجة منخفضة نسبيا. كنتيجة لذلك، لا يمكن أن تكون معزولة بإعداد كبيرة. وأيضا صعوبة في ترانسفيكت مع بنيات كدنا. في طراز مورين، يمكن تجاوز هذه المشاكل جزئيا بالتمايز في المختبر من فروعه نخاع العظام بحضور م-CSF الضامة أو GM-CSF للخلايا الجذعية. وبهذه الطريقة، من الممكن الحصول على كميات كبيرة من هذه الخلايا من عدد قليل جداً من الحيوانات. وعلاوة على ذلك، يمكن أن ترانسدوسيد المتكفل نخاع العظام مع الفيروسات التراجعية ناقلات تحمل نيات كدنا خلال المراحل المبكرة لزراعة قبل على التمايز في الخلايا الجذعية نخاع العظام المشتقة والضامة. وهكذا، يمكن توصيل النسخ العكسي متبوعاً بتمايز في المختبر للتعبير عن مختلف بنيات كدنا في هذه الخلايا. القدرة على التعبير عن البروتينات خارج الرحم إلى حد كبير يمتد مجموعة التجارب التي يمكن إجراؤها على هذه الخلايا، بما في ذلك تصوير الخلايا الحية من البروتينات الفلورية، وتنقية جنبا إلى جنب لتحليلات إينتيراكتومي، تحليل بنية دالة، ورصد الوظائف الخلوية مع أجهزة استشعار العوامل البيولوجية، وغيرها الكثير. في هذه المقالة، نحن وصف بروتوكول مفصل لتوصيل النسخ العكسي للخلايا الجذعية نخاع العظام موريني المشتقة والضامة مع ناقلات الترميز لمعلم فلوريسسينتلي البروتينات. على سبيل المثال من اثنين من البروتينات محول، OPAL1 و PSTPIP2، علينا أن نظهر تطبيقه العملي في التدفق الخلوي والفحص المجهري. نحن أيضا مناقشة مزايا وقيود من هذا النهج.

مما يشير إلى محول البروتينات هي البروتينات الصغيرة عادة دون أي النشاط الأنزيمي. أنها تمتلك مختلف مجالات التفاعل أو زخارف، والتوسط الملزم للبروتينات الأخرى المتورطة في توصيل الإشارة، بما في ذلك تيروسين مؤنزم، فوسفاتاسيس، ليجاسيس أوبيكويتين وغيرها21. واختير...

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages at JoVE.com

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

تعبير البروتينات الفلورية الانصهار في مورين الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظم والضامة

في هذه المقالة، نحن نقدم بروتوكول مفصل للتعبير عن البروتينات الفلورية الانصهار في نخاع العظام مورين اشتقاق الخلايا الجذعية والضامة. ويستند الأسلوب في توصيل نخاع العظام المتكفل بنيات فيروسات النسخ العكسي متبوعاً بتمايز إلى الضامة والجذعيه الخلايا في المختبر.

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات علم الأحياء الضامة والخلايا المتجذّر حول التعريب شبه الخلوي وديناميات البروتينات المختلفة في أنواع الخلايا هذه. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنها بسيطة نسبيا، وغير مكلفة، ويظهر كفاءة أفضل واستقرار التعبير من غالبية الأساليب الأخرى المتاحة. إثبات الإجراء سيكون جارميلا كرالوفا، طالبة غراد من مختبري.لإنتاج الفيروس الرجعي، لوحة تعليق خلية واحدة من خلايا التعبئة والتغليف البيئية البلاتين في طبق بتري 10 سم وزراعة الخلايا في 15 ملليلتر من DMEM، تستكمل مع مصل الأبقار الجنين 10٪، أو FBS، حتى الثقافة هي 50 إلى 60٪ التقاء. في اليوم التالي، إضافة 20 ميكروغرام من بناء retroviral من الفائدة و 10 ميكروغرام من ناقل التعبئة البيئية PCL إلى 1 ملليلتر من DMEM دون المصل، مع خلط لطيف. إضافة 75 microliters من PEI في 1 ملليلتر من DMEM دون المصل والمضادات الحيوية إلى أنبوب ثان لمدة خمس دقائق حضانة في درجة حرارة الغرفة، وخلط محتويات كلا الأنابيب معا لاحتضان إضافية لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.بعد ذلك، بعناية استبدال المتوسطة على الخلايا البيئية البلاتينية مع 8 ملليلتر من 37 درجة مئوية جديدة DMEM تكملها 2٪ FBS وإضافة بعناية خليط transfection في قطرات إلى لوحة. بعد حضانة 4 ساعة في 37 درجة مئوية، استبدال supernatent مع 10 ملليلتر من 37 درجة مئوية DMEM، تكمل مع 10٪ FBS لاحتضان 24 ساعة في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، استخدم ماصة 5 ملليلتر لنقل جسيمات التغذية الرجعية المحتوية على الجسيمات الفائقة إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر وإزالة الحطام واحتواء الخلايا عن طريق الطرد المركزي.وفي الوقت نفسه، إضافة 10 ملليلتر من 37 درجة مئوية DMEM بالإضافة إلى 10٪ FBS إلى طبق الثقافة لاحتضان آخر 24 ساعة في 37 درجة مئوية وجمع جولة ثانية من الجسيمات الفيروسية كما أظهرت للتو. لحصاد نخاع العظم، في غطاء لثقافة الأنسجة، استخدم ملاقط ومقص لإزالة الجلد وجزء من العضلات من الأطراف الخلفية وإبعاد الاسيبولوم بعناية من مفصل الورك دون كسر عظم الفخذ. قطع الكفوف في مفاصل الكاحل ورش العظام مع 70٪ الإيثانول.ثم إزالة بقية العضلات بمنشفة ورقية ووضع العظام في طبق بتري 5 سم من برنامج تلفزيوني تكملها 2٪ FBS. بعد ذلك، ثني مفصل الركبة لكل مجموعة العظام وفصل بعناية العظام مع مقص. استخدام مقص لإزالة حوالي 1-2 ملليمتر من كل epiphysis من عظم واحد واستخدام حقنة ملليلتر اثنين أو خمسة مجهزة إبرة قياس 30 محملة برنامج تلفزيوني جديد بالإضافة إلى FBS لطرد نخاع العظام من طرفي العظم في أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر.عندما تم جمع النخاع من كل من العظام، بيليه خلايا العظام عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في 2.5 ملليلتر من خلايا الدم الحمراء العازلة لتحلل لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد التخبط، تصفية الخلايا من خلال مصفاة خلية ميكرومتر 100 في أنبوب جديد 15 ملليلتر الطرد المركزي واستعادة المثابرة مع 12 ملليلتر من برنامج تلفزيوني زائد FBS. إعادة تعليق بيليه في DMEM، تستكمل مع 10٪ FBS والمضادات الحيوية للعد وطبقة خمس إلى 10 مرات 10 إلى خلايا نخاع العظام السادسة في 10 سنتيمترا، غير الأنسجة ثقافة علاج طبق بيتري في 10 ملليلتر من DMEM تكملها مصل ومستعمرة الضامة عامل تحفيز، أو MCSF.في اليوم الخامس من الثقافة، إمالة بعناية طبق ثقافة الخلية وإزالة جميع ولكن ما يقرب من 5 ملليلتر من المتوسطة من السطح بالقرب من حافة الطبق. ثم إضافة 20 ملليلتر من 37 درجة مئوية جديدة المتوسطة تكملها FBS وMCSF إلى الطبق وإعادة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية. لحصاد الخلايا، في اليوم السادس إلى السابع، إزالة جميع الخلايا المتوسطة والعائمة وغسل الثقافة مع PBS 37 درجة مئوية.فصل الخلايا المرتبطة مع خمسة ملليلتر من 0.02٪EDTA وBBS لمدة ثلاث إلى خمس دقائق في 37 درجة مئوية في حاضنة ثقافة الأنسجة واستخدام ماصة خمسة ملليلتر لطرد بلطف الخلايا المفككة من أسفل لوحة. ثم نقل الخلايا إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 50 ملليلتر يحتوي على 25 ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد. للحث EGFP تمييز تعبير البروتين في نخاع العظم مستضد مشتقة تقدم الخلايا, في بداية بروتوكول تمايز الخلية, تمييع خلايا نخاع العظام إلى 2-5 مرات 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر من DMEM بالإضافة إلى FBS والمضادات الحيوية conentration وطبق الخلايا من ملليلتر واحد من المتوسط في بئر, تستكمل مع السيتوكين التمايز المناسب.بعد أربع إلى ست ساعات في حاضنة ثقافة الخلية، إضافة ملليلتر من الجولة الأولى من الفيروس الذي تم جمعه تكملتها مع البوليبرين وtransduce ثقافات الخلية عن طريق الطرد المركزي واحتضان أربع ساعات في الحاضنة ثقافة الخلية. وفي نهاية فترة النقل، تنقل الخلايا غير المُضَع من كل بئر إلى أنابيب فردية للطرد المركزي يبلغ 15 ملليلتر، وتجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. إذا كانت هناك حاجة إلى كمية أكبر من الخلايا، يمكن أن تكون الخلايا مصابة بنفس النتوءات في آبار متعددة وتجمع قبل التمايز.ثم إعادة تعليق الكريات في 10 ملليلتر من المتوسطة الثقافة تكمل مع السيتوكين التمايز المناسب وطبق الخلايا على واحد 10 سنتيمتر غير ثقافة الأنسجة تعامل بتري طبق في أنبوب، لثقافة ستة إلى ثمانية أيام، كما أظهرت للتو. تقييم فعالية البلاتين Eco transfection بواسطة تدفق cytometry بعد جمع الفيروس الثاني الذي يحتوي على supernatent يكشف عن متوسط كفاءة transfection من 62 ٪ لSPIP2 - EGFP و 53 ٪ لOPAL1 - EGFP. لا يؤثر نقل الفيروس الرجعي على حالة التمايز للخلايا المشتقة من نخاع العظم مع أكثر من 90٪ من الخلايا في كلتا الثقافتين مما يدل على الإيجابية لعلامات كل منها بعد الحمل مع أي من الفيروسين.ومع المناسبة، التغيرات المورفولوجية المميزة التي لوحظت لكلا النوعين من الخلايا المتمايزة. ملاحظة, التعبير الكلي من EGFP كان أقل في نخاع العظام المشتقة الثقافات الخلية المتجنّدة مقارنة مع نخاع العظم مشتقة التعبير EGFP، بغض النظر عن نوع الفيروس الرجعي. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر لاستخدام غير الأنسجة، والثقافة يعامل الأطباق البلاستيكية التي تستخدم عادة لزراعة البكتيريا إذا كنت تخطط لإزالة الخلايا من الطبق للتجربة.بعد هذا الإجراء، يمكن استخدام أساليب أخرى التصوير الحي للخلايا، والمجهر الفائق الدقة أو أنواع أخرى من المجهر للإجابة على أسئلة إضافية حول التعريب شبه الخلوي وديناميات بروتينات الخلايا المتجخرة والكبرية ذات الأهمية. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال المناعة في استكشاف توزيع والعلاقات الزباقية للبروتينات التي تعبر عنها الضامة والخلايا التشعبية وفي تعزيز فهمنا لوظيفة هذه البروتينات أثناء الاستجابات المناعية. لا تنس أن العمل مع الجسيمات الفيروسية يمكن أن تكون خطرة للغاية، وأنه ينبغي دائما اتخاذ الاحتياطات، مثل الحد الأدنى من توليد الهباء الجوي، وارتداء معدات واقية، واستخدام غطاء محرك تدفق لامينر، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

ثقافة الخلايا الجذعية من الدم النخاعي السلائف نخاع العظم

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

جيل من نخاع عظام الفئران الخلايا الجذعية المشتقة للاستخدام في 2 الفوتون التصوير

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

الفلورسنت وصفها من COS - 7 تعرب عن البروتينات الانصهار SNAP - شعارا لتصوير الخلايا الحية

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

باستخدام خلية مكافحة الآلي لتبسيط دراسات التعبير الجيني : ضربة قاضية سيرنا من IL - 4 التعبير الجيني في الخلايا التابعة Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Photoconversion منقى من البروتينات ونيون المزدوجة التحقيق تسليط الضوء البصري في الخلايا الحية

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

الببتيدات من مكتبة عرض بالعاثية تعدل التعبير الجيني في خلايا اللحمة المتوسطة وتحفيز تكون العظم في عيوب العظام Unicortical

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...