Name: expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow-derived dendritic cells and macrophages
Uploaded: 2018-10-30T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tjekkiske Science Foundation (GACR) (projektnummer 16-07425S), af Charles University Grant agentur (GAUK) (projektnummer 923116) og af institutionel finansiering fra Institut for molekylær genetik, Academy of Sciences i tjekkiske Republik (RVO 68378050).

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af Expert Committee på velfærd af forsøgsdyr af Institut for Molekylær Genetik og Academy of Sciences i Tjekkiet.
1. reagens
<ol><li>Forberede ammonium-chlorid-kalium (ACK) buffer. Tilføje 4.145 g af NH4Cl og 0,5 g KHCO3 til 500 mL af Hedeselskabet2O, derefter tilsættes 100 µL af 0,5 M ethylendiamintetra syre (EDTA) og filter-sterilisere.</li>
	<li>Forberede polyethylenimine (PEI) løsning. Tilsættes 0,1 g...

<ol>
	<li>Moghaddam, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity,+polarization+and+function+in+health+and+disease.">Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease.</a> Journal of Cellular Physiology. , (2018).</li><li>Qian, C., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+the+regulation+of+immunity+and+inflammation.">Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation.</a> Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).</li><li>Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function:+from+mechanisms+to+disease.">Neutrophil function: from mechanisms to disease.</a> Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).</li><li>Kondo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+and+myeloid+lineage+commitment+in+multipotent+hematopoietic+progenitors.">Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors.</a> Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).</li><li>Andrews, T., Sullivan, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+in+patients+with+inherited+defects+in+phagocytic+function.">Infections in patients with inherited defects in phagocytic function.</a> Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).</li><li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+biology+in+development,+homeostasis+and+disease.">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li><li>Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+factor+in+L-cell+conditioned+medium+capable+of+stimulating+colony+formation+by+mouse+marrow+cells+in+culture.">Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture.</a> Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).</li><li>Scheicher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+GM-CSF+induces+in+vitro+differentiation+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow.">Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).</li><li>Stanley, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+colony-stimulating+factor,+CSF-1.">The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1.</a> Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).</li><li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow.">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).</li><li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor.">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li><li>Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+non-equivalence+of+murine+(monocyte-)+macrophage+cells+in+biomaterial+and+inflammatory+models.">Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).</li><li>Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein:+a+perspective.">Green fluorescent protein: a perspective.</a> Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+In+Vivo+Imaging+Using+Fluorescent+Proteins.">Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).</li><li>Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+fluorescent+proteins.">Flow cytometry of fluorescent proteins.</a> Methods. 57 (3), 318-330 (2012).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+exogenous+genes+in+macrophages:+obstacles+and+opportunities.">The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities.</a> Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).</li><li>Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tolerance+induction+in+major+histocompatibility+complex+class+II-restricted+T+cells+specific+for+a+blood-borne+self-antigen.">Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen.</a> Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).</li><li>Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Characterization+of+the+New+Osteoclast+Progenitor+with+Macrophage+Phenotypes+Being+Able+to+Differentiate+into+Mature+Osteoclasts.">Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).</li><li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pCL+vector+system:+rapid+production+of+helper-free,+high-titer,+recombinant+retroviruses.">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).</li><li>Janssen, E., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptor+proteins+in+lymphocyte+activation.">Adaptor proteins in lymphocyte activation.</a> Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).</li><li>Ferguson, P. J., Laxer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+discoveries+in+CRMO:+IL-1beta,+the+neutrophil,+and+the+microbiome+implicated+in+disease+pathogenesis+in+Pstpip2-deficient+mice.">New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).</li><li>Holleman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+outcome+predictor+in+acute+leukemia+1+(OPAL1)+gene+is+not+an+independent+prognostic+factor+in+patients+treated+according+to+COALL+or+St+Jude+protocols.">Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols.</a> Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).</li><li>Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+Differentiation+of+Murine+Myeloid+Precursor+32D/G-CSF-R+Cells.">Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).</li><li>Kralova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transmembrane+Adaptor+Protein+SCIMP+Facilitates+Sustained+Dectin-1+Signaling+in+Dendritic+Cells.">The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).</li><li>Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960 (2014).</li><li>Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protocol+for+efficient+transfection+of+dendritic+cells+without+cell+maturation.">Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766 (2011).</li><li>Siegert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+siRNA+into+mouse+bone+marrow-derived+macrophages+and+dendritic+cells.">Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery:+Potential+Applications+for+Gene+and+Cell-Based+Therapies+in+the+New+Era+of+Personalized+Medicine.">Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine.</a> Genes &amp; Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li><li>Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+progress+in+gene+delivery+technology+based+on+chemical+methods+and+nano-carriers.">Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers.</a> Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).</li><li>Muruve, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome+recognizes+cytosolic+microbial+and+host+DNA+and+triggers+an+innate+immune+response.">The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response.</a> Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).</li><li>Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+humoral+immune+responses+to+viral+antigens+create+barriers+to+lung-directed+gene+therapy+with+recombinant+adenoviruses.">Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses.</a> Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).</li><li>Tallone, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+adenovirus+gene+delivery.">A mouse model for adenovirus gene delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).</li><li>Milone, M. C., O'Doherty, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+use+of+lentiviral+vectors.">Clinical use of lentiviral vectors.</a> Leukemia. , (2018).</li><li>McTaggart, S., Al-Rubeai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+vectors+for+human+gene+delivery.">Retroviral vectors for human gene delivery.</a> Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transience+of+transient+overexpression.">The transience of transient overexpression.</a> Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).</li></ol>

Udtryk for protein af interesse i target-cellerne er et vigtigt skridt i mange typer af biologiske undersøgelser. Differentierede makrofager og dendritiske celler er vanskeligt at transfect af standard Transfektion og retroviral transduktion teknikker. Omgåelse Transfektion af disse differentierede celler med retroviral transduktion af knoglemarven progenitorceller, efterfulgt af differentiering, når de allerede bærer det ønskede konstruktion, er et kritisk skridt giver udtryk for ekstrauterin cDNAs i disse celletyp...

Myeloide celler udgør en uundværlig del af vores forsvarsmekanismer mod patogener. De er i stand til hurtigt fjerne mikrober, samt døende celler. Derudover er de også involveret i regulering af udvikling af væv og reparation og opretholde homeostase1,2,3. Alle myeloide celler differentiere fra fælles myeloide stamceller i knoglemarven. Deres differentiering i mange funktionelt og morfologisk særskilt undersæt er i vid udstrækning kontrolleret af cytokiner og deres forskellige kombinationer af4. De mest intensivt undersøgt myeloide celle subsets omfatter neutrophilic granulocytter, makrofager og dendritiske celler. Fejl i nogen af disse befolkningsgrupper føre til potentielt livstruende konsekvenser og forårsage alvorlige dysfunktioner af immunsystemet hos mennesker og mus1,2,3,5, 6.
I modsætning til neutrophilic granulocytter, dendritiske celler og makrofager er bosiddende celler, væv og deres overflod i immun organer er relativt lavt. Som et resultat, er isolering og oprensning af primære dendritiske celler og makrofager for eksperimenter der kræver et stort antal af disse celler dyre og ofte umuligt. For at løse dette problem, er protokoller blevet udviklet for at opnå store mængder af homogen makrofager og dendritiske celler in vitro. Disse tilgange er baseret på differentiering af murine knoglemarv celler i overværelse af cytokiner: makrofag koloni-stimulerende faktor (M-CSF) til makrofager og granulocyt-makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) eller Flt3 ligand for dendritiske celler7,8,9,10,11,12. Celler genereret af denne metode er almindeligt beskrevet i litteraturen som knoglemarven afledt makrofager (BMDMs) og knoglemarv afledt dendritiske celler (BMDCs). De har flere fysiologiske egenskaber primære makrofager og dendritiske celler end med tilsvarende cellelinjer. En anden stor fordel er muligheden for at opnå disse celler form genetisk modificerede mus13. Sammenlignende studier mellem wild-type celler og celler, der stammer fra genmodificerede mus er ofte afgørende for afsløring roman funktioner af gener eller proteiner af interesse.
Analyse af subcellulært lokalisering af proteiner i levende celler kræver kobling af en fluorescerende etiket til protein af interesse i vivo. Dette sker oftest ved at udtrykke genetisk kodet fusion konstruktion består af en analyseret protein koblet (ofte via en kort linker) til en fluorescerende proteiner (fx., grøn fluorescerende proteiner (NGL))14,15 , 16. udtrykket af fluorescently mærket proteiner i dendritiske celler eller makrofager er udfordrende. Disse celler er generelt vanskeligt at transfect af standard Transfektion procedurer og effektivitetsgevinsterne tendens til at være meget lav. Desuden, Transfektion er forbigående, det genererer cellulært stress og opnåede intensiteten af fluorescens kan ikke være tilstrækkeligt for mikroskopi17. For at opnå en rimelig brøkdel af disse celler med en tilstrækkelig grad af transgenet udtryk, infektion af knoglemarv stamceller med retroviral er vektorer og deres efterfølgende differentiering af BMDMs eller BMDCs blevet en meget effektiv tilgang. Det er tilladt for analyse af proteiner af myeloide oprindelse i deres native cellulære miljø, både i en stabil tilstand eller i processer, der er kritiske for immunrespons fagocytose, immunologiske synapse dannelse eller migration. Her, beskriver vi en protokol, der giver mulighed for stabile udtryk af fluorescently mærket proteiner af interesse i murine knoglemarv afledt makrofager og dendritiske celler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>15028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>10270</td>
			<td>For media suplementation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Lachema, Brno, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>BB Pharma AS, Prague, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PENICILIN G 1,0 DRASELN&#193; SOL&#39; BIOTIKA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>S9137</td>
			<td>Streptomycin sulfate salt powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Dr. Kulich Pharma, Hradec Kr&#225;lov&#233;, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, linear, MW 25,000</td>
			<td>Polyscience, Warrington, PA, USA</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>101212</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>123110</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>117310</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)</td>
			<td>315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>H1398</td>
			<td>flow cytometry analysis use at 1-2 &#181;g/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow-derived dendritic cells and macrophages

Dendritiske celler og makrofager er afgørende celler, der danner den første linje i forsvar mod patogener. De også spille en vigtig rolle i iværksættelsen af en adaptiv immunrespons. Eksperimentelt arbejde med disse celler er temmelig udfordrende. Deres overflod i organer og væv er relativt lavt. Som et resultat, kan ikke de være isoleret i stort tal. De er også svært at transfect med cDNA konstruktioner. I murine modellen, kan disse problemer løses delvist af in vitro- differentiering fra knoglemarven stamfaderen M-CSF for makrofager eller GM-CSF for dendritiske celler. På denne måde er det muligt at opnå store mængder af disse celler fra meget få dyr. Derudover kan knoglemarv stamceller være transduced med retroviral vektorer transporterer cDNA konstruktioner i tidlige stadier af dyrkning før deres differentiering i knoglemarven afledt dendritiske celler og makrofager. Retroviral transduktion efterfulgt af differentiering i vitro kan således bruges til at udtrykke forskellige cDNA konstruktioner i disse celler. Evnen til at udtrykke ektopisk proteiner betydeligt udvider rækken af eksperimenter, der kan udføres på disse celler, herunder levende celle billeddannelse af fluorescerende proteiner, tandem purifications interactome analyser, struktur-funktion analyser, overvågning af cellulære funktioner med biosensorer og mange andre. I denne artikel vil beskrive vi en detaljeret protokol til retroviral transduktion af murine knoglemarv afledt dendritiske celler og makrofager med vektorer, der koder for fluorescently markeret proteiner. På eksemplet med to adapter proteiner, OPAL1 og PSTPIP2, vise vi sin praktiske anvendelse i flowcytometri og mikroskopi. Vi diskuterer også fordele og begrænsninger ved denne fremgangsmåde.

Signaling adapter proteiner er normalt små proteiner uden nogen enzymatisk aktivitet. De besidder forskellige interaktion domæner eller motiver, der mægle binding til andre proteiner involveret i signaltransduktion, herunder tyrosin kinaser, fosfataser og ubiquitin ligases21. Til demonstration af funktionaliteten af denne protokol blev myeloide celler adaptere PSTPIP2 og OPAL1 udvalgt. PSTPIP2 er et godt karakteriseret protein involveret i reguleringen af inflam...

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages at JoVE.com

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Udtryk for fluorescerende Fusion proteiner i Murine knoglemarv-afledte dendritiske celler og makrofager

I denne artikel vil give vi en detaljeret protokol for udtryk for fluorescerende fusion proteiner i murine knoglemarv afledt dendritiske celler og makrofager. Metoden er baseret på transduktion af knoglemarv stamceller med retroviral konstruktioner efterfulgt af differentiering af makrofager og dendritiske celler i vitro.

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål inden for makrofag og dendritisk cellebiologi om subcellulære lokalisering og dynamik af forskellige proteiner i disse celletyper. De største fordele ved denne teknik er, at den er forholdsvis enkel, billig og viser en bedre effektivitet og stabilitet i ytringsfriheden end de fleste andre tilgængelige metoder. Demonstration af proceduren vil være Jarmila Kralova, en grad studerende fra mit laboratorium.For at producere retrovirus, plade en enkelt-celle suspension af Platinum Eco-emballage celler i en 10 centimeter petriskål og dyrke cellerne i 15 milliliter DMEM, suppleret med 10% føtal kvæg serum, eller FBS, indtil kulturen er 50 til 60% sammenløb. Den næste dag tilsættes 20 mikrogram af den retrovirale konstruktion af interesse og 10 mikrogram PCL øko-emballage vektor til 1 milliliter DMEM uden serum, med blid blanding. Der tilsættes 75 mikroliter PEI i 1 ml DMEM uden serum og antibiotika til et andet rør i en fem minutters inkubation ved stuetemperatur, og indholdet af begge rør blandes sammen i yderligere 10 minutters inkubation ved stuetemperatur.Dernæst skal du forsigtigt erstatte mediet på Platinum Eco cellerne med 8 milliliter frisk 37 grader Celsius DMEM suppleret med 2% FBS og tilsæt forsigtigt transfektionsblandingen i dråber til pladen. Efter en 4 timers inkubation ved 37 grader Celsius, erstatte supernatent med 10 milliliter af 37 grader Celsius DMEM, suppleret med 10% FBS for en 24 timers inkubation ved 37 grader Celsius. Den næste dag, bruge en 5 milliliter pipette til at overføre økotropiske retroviral partikel-holdige supernatent til en 15 milliliter centrifuge rør og fjerne snavs og indeholder celler ved centrifugering.I mellemtiden tilføje 10 milliliter af 37 grader Celsius DMEM plus 10% FBS til kultur parabol for en anden 24 timers inkubation ved 37 grader Celsius og indsamle en anden runde af virale partikler som netop påvist. At høste knoglemarven, i et væv kultur hætte, bruge pincet og saks til at fjerne huden og en del af musklerne fra baglemmer og omhyggeligt løsne acetabulum fra hofteleddet uden at bryde lårbenet. Skær poterne ved ankelleddene og spray knoglerne med 70% ethanol.Fjern derefter resten af musklen med en køkkenrulle og læg knoglerne i en 5 centimeter petriskål af PBS suppleret med 2% FBS. Dernæst bøje knæleddet af hver knogle sæt og omhyggeligt adskille knoglerne med en saks. Brug saksen til at fjerne ca. en til to millimeter af hver epphysis af en knogle og brug en to eller fem millilitersprøjte udstyret med en 30 gauge nål fyldt med frisk PBS plus FBS til at skylle knoglemarven fra begge ender af knoglen i et 15 milliliter centrifugerør.Når marven er indsamlet fra hver af knoglerne, pellet knoglecellerne ved centrifugering og re-suspendere pellet i 2,5 milliliter røde blodlegemer lysis buffer i to til tre minutter ved stuetemperatur. Efter lysning filtreres cellerne gennem en 100 mikrometercelles si i et nyt 15 millilitercentrifugerør, og vedholdenheden genoprettes med 12 milliliter PBS plus FBS. Re-suspendere pellet i DMEM, suppleret med 10% FBS og antibiotika til optælling og plade fem til 10 gange 10 til den sjette knoglemarvsceller i en 10 centimeter, ikke-væv kultur behandlet petriskål i 10 milliliter DMEM suppleret med serum og makrofag koloni stimulerende faktor, eller MCSF.På kulturens dag fem vippes cellekulturskålen forsigtigt, og alle, men ca. 5 milliliter medium, fjernes fra overfladen nær skålens kant. Derefter tilsættes 20 milliliter frisk 37 grader Celsius medium suppleret med FBS og MCSF til skålen og returnere cellerne til cellekultur inkubator. At høste cellerne, på dag seks til syv, fjerne alle de mellemstore og flydende celler og vaske kulturen med 37 grader Celsius PBS.Afgiv de klæbende celler med fem milliliter 0,02% EDTA og PBS i tre til fem minutter ved 37 grader Celsius i vævskulturinkubatoren, og brug en fem milliliterpipette til forsigtigt at skylle de dissocierede celler fra pladebunden. Cellerne overføres derefter til et centrifugerør på 50 milliliter, der indeholder 25 milliliter frisk PBS. For at fremkalde EGF-mærkede proteinudtryk i knoglemarvbaserede antigen, der præsenterer celler, fortyndes knoglemarvscellerne i begyndelsen af celledifferentieringsprotokollen til en to til fem gange 10 til de sjette celler pr. milliliter DMEM plus FBS og antibiotisk konentration og pladecellerne af en milliliter medium pr. brønd suppleret med den passende differentieringscytokin.Efter fire til seks timer i cellekulturinkubatoren tilsættes to milliliter af den første runde af indsamlet virus suppleret med polybren og transducerer cellekulturerne ved centrifugering og fire timers inkubation i cellekulturkubvøsen. Ved afslutningen af transduktionsperioden overføres de ikke-vedhæftige celler fra hver brønd til individuelle 15 millilitercentrifugerør, og cellerne indsamles ved centrifugering. Hvis større mængde celler er nødvendig, cellerne kan være inficeret med den samme constract i flere brønde og samlet før differentiering.Derefter re-suspendere pellets i 10 milliliter af kultur medium suppleret med passende differentiering cytokin og plade cellerne på en 10 centimeter ikke væv kultur behandlet petriskål pr rør, for deres seks til otte dages kultur, som netop påvist. Evaluering af effekten af Platinum Eco transinfektion ved flowcytometri efter indsamling af den anden virus, der indeholder supernatent, afslører en gennemsnitlig transfektionseffektivitet på 62% for PSTPIP2-EGFP og 53% for OPAL1-EGFP. Retroviral transduktion påvirker ikke differentieringsstatus for de knoglemarvsafledte celler med mere end 90 % af cellerne i begge kulturer, der viser positivitet for deres respektive markører efter transduktion med enten virus.Og med de relevante, karakteristiske morfologiske ændringer observeret for begge typer af differentieret celle. Det generelle udtryk for EGFP var lavere i knoglemarvbaserede dendritiske cellekulturer sammenlignet med knoglemarvudledte makrofager EGFP-ekspression, uanset typen af retrovirus. Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske at bruge ikke væv, kulturbehandlede plastretter, der typisk bruges til at dyrke bakterier, hvis du planlægger at fjerne celler fra fadet til eksperiment.Efter denne procedure, andre metoder levende celle billeddannelse, super opløsning mikroskopi eller andre typer af mikroskopi kan anvendes til at besvare yderligere spørgsmål om sub-cellulære lokalisering og dynamik af dendritiske celle og makrofag proteiner af interesse. Denne teknik banede vejen for forskere inden for immunologi området i at udforske distribution og spacial relationer af proteiner udtrykt ved makrofager og dendritiske celler og i at fremme vores forståelse af funktionen af disse protein under immunrespons. Glem ikke, at arbejde med virale partikler kan være yderst farligt, og at forholdsregler, såsom minimalisering aerosol generation, iført beskyttelsesudstyr, og ved hjælp af en laminar flow hætte, bør altid tages, mens du udfører denne procedure.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grønt fluorescerende protein-baserede Expression Screening membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...