Name: expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow-derived dendritic cells and macrophages
Uploaded: 2018-10-30T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door Tsjechische Science Foundation (GACR) (projectnummer 16-07425S), door Charles Universiteit Grant Agentschap (GAUK) (projectnummer 923116) en door de institutionele financiering van het Instituut voor moleculaire genetica, Academie van Wetenschappen van de Tsjechische Republiek (RVO 68378050).

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door het Comité van deskundigen voor het welzijn van de proefdieren van het Instituut voor moleculaire genetica en door de Academie van Wetenschappen van de Tsjechische Republiek.
1. reagens voorbereiding
<ol><li>De buffer van ammonium-chloride-kalium (ACK) voor te bereiden. Voeg 4.145 g NH4Cl en 0,5 g voor KHCO3 tot 500 mL van ddH2O, dan Voeg 100 µL van 0.5 M ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing...

<ol>
	<li>Moghaddam, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity,+polarization+and+function+in+health+and+disease.">Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease.</a> Journal of Cellular Physiology. , (2018).</li><li>Qian, C., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+the+regulation+of+immunity+and+inflammation.">Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation.</a> Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).</li><li>Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function:+from+mechanisms+to+disease.">Neutrophil function: from mechanisms to disease.</a> Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).</li><li>Kondo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+and+myeloid+lineage+commitment+in+multipotent+hematopoietic+progenitors.">Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors.</a> Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).</li><li>Andrews, T., Sullivan, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+in+patients+with+inherited+defects+in+phagocytic+function.">Infections in patients with inherited defects in phagocytic function.</a> Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).</li><li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+biology+in+development,+homeostasis+and+disease.">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li><li>Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+factor+in+L-cell+conditioned+medium+capable+of+stimulating+colony+formation+by+mouse+marrow+cells+in+culture.">Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture.</a> Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).</li><li>Scheicher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+GM-CSF+induces+in+vitro+differentiation+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow.">Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).</li><li>Stanley, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+colony-stimulating+factor,+CSF-1.">The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1.</a> Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).</li><li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow.">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).</li><li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor.">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li><li>Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+non-equivalence+of+murine+(monocyte-)+macrophage+cells+in+biomaterial+and+inflammatory+models.">Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).</li><li>Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein:+a+perspective.">Green fluorescent protein: a perspective.</a> Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+In+Vivo+Imaging+Using+Fluorescent+Proteins.">Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).</li><li>Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+fluorescent+proteins.">Flow cytometry of fluorescent proteins.</a> Methods. 57 (3), 318-330 (2012).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+exogenous+genes+in+macrophages:+obstacles+and+opportunities.">The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities.</a> Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).</li><li>Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tolerance+induction+in+major+histocompatibility+complex+class+II-restricted+T+cells+specific+for+a+blood-borne+self-antigen.">Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen.</a> Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).</li><li>Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Characterization+of+the+New+Osteoclast+Progenitor+with+Macrophage+Phenotypes+Being+Able+to+Differentiate+into+Mature+Osteoclasts.">Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).</li><li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pCL+vector+system:+rapid+production+of+helper-free,+high-titer,+recombinant+retroviruses.">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).</li><li>Janssen, E., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptor+proteins+in+lymphocyte+activation.">Adaptor proteins in lymphocyte activation.</a> Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).</li><li>Ferguson, P. J., Laxer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+discoveries+in+CRMO:+IL-1beta,+the+neutrophil,+and+the+microbiome+implicated+in+disease+pathogenesis+in+Pstpip2-deficient+mice.">New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).</li><li>Holleman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+outcome+predictor+in+acute+leukemia+1+(OPAL1)+gene+is+not+an+independent+prognostic+factor+in+patients+treated+according+to+COALL+or+St+Jude+protocols.">Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols.</a> Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).</li><li>Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+Differentiation+of+Murine+Myeloid+Precursor+32D/G-CSF-R+Cells.">Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).</li><li>Kralova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transmembrane+Adaptor+Protein+SCIMP+Facilitates+Sustained+Dectin-1+Signaling+in+Dendritic+Cells.">The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).</li><li>Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960 (2014).</li><li>Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protocol+for+efficient+transfection+of+dendritic+cells+without+cell+maturation.">Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766 (2011).</li><li>Siegert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+siRNA+into+mouse+bone+marrow-derived+macrophages+and+dendritic+cells.">Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery:+Potential+Applications+for+Gene+and+Cell-Based+Therapies+in+the+New+Era+of+Personalized+Medicine.">Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine.</a> Genes &amp; Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li><li>Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+progress+in+gene+delivery+technology+based+on+chemical+methods+and+nano-carriers.">Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers.</a> Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).</li><li>Muruve, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome+recognizes+cytosolic+microbial+and+host+DNA+and+triggers+an+innate+immune+response.">The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response.</a> Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).</li><li>Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+humoral+immune+responses+to+viral+antigens+create+barriers+to+lung-directed+gene+therapy+with+recombinant+adenoviruses.">Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses.</a> Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).</li><li>Tallone, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+adenovirus+gene+delivery.">A mouse model for adenovirus gene delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).</li><li>Milone, M. C., O'Doherty, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+use+of+lentiviral+vectors.">Clinical use of lentiviral vectors.</a> Leukemia. , (2018).</li><li>McTaggart, S., Al-Rubeai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+vectors+for+human+gene+delivery.">Retroviral vectors for human gene delivery.</a> Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transience+of+transient+overexpression.">The transience of transient overexpression.</a> Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).</li></ol>

De uitdrukking van de proteïne van belang in de doelcellen is een belangrijke stap in vele soorten biologische studies. Gedifferentieerde macrofagen en dendritische cellen zijn moeilijk te transfect door standaard transfectie en retrovirale transductie technieken. Het omzeilen van de transfectie van deze gedifferentieerde cellen met retrovirale transductie van beenmerg progenitorcellen, gevolgd door differentiatie wanneer ze al de gewenste constructie dragen, is een cruciale stap waardoor de expressie van ectopische cDN...

Myeloïde cellen vormen een onmisbaar onderdeel van onze afweermechanismen tegen ziekteverwekkers. Ze kunnen snel elimineren microben, evenals de stervende cellen. Daarnaast zijn zij ook betrokken bij de regulering van weefsel ontwikkeling en reparatie en ter handhaving van de homeostase1,2,3. Alle myeloïde cellen onderscheiden van gemeenschappelijke myeloïde voorlopercellen in het beenmerg. Hun differentiatie in vele functioneel en morfologisch verschillende subsets is voor een groot deel gecontroleerd door cytokines en hun verschillende combinaties4. De meest intensief bestudeerde myeloïde cel subsets omvatten neutrofiele granulocyten, macrofagen en dendritische cellen. Defecten in om het even welk van deze bevolkingsgroepen leiden tot potentieel levensbedreigende gevolgen en oorzaak ernstige stoornissen van het immuunsysteem bij de mens en muizen1,2,3,5, 6.
In tegenstelling tot de neutrofiele granulocyten, dendritische cellen en macrofagen zijn verblijfplaats weefselcellen en hun overvloed in immuun organen is relatief laag. Dientengevolge, is de isolatie en zuivering van primaire dendritische cellen en macrofagen voor experimenten waarbij een groot aantal van deze cellen duur en vaak onmogelijk. U kunt dit probleem oplossen, zijn protocollen ontwikkeld voor het verkrijgen van grote hoeveelheden van homogene macrofagen en dendritische cellen in vitro. Deze benaderingen zijn gebaseerd op de differentiatie van lymfkliertest beenmergcellen in aanwezigheid van cytokines: macrofaag kolonie-stimulerende factor (M-CSF) voor macrofagen en granulocyt-macrofaag kolonie-stimulerende factor (GM-CSF) of Flt3 ligand voor dendritische cellen7,8,9,10,11,12. Cellen die zijn gegenereerd door deze methode worden vaak beschreven in de literatuur als beenmerg afgeleid macrofagen (BMDMs) en het beenmerg-dendritische cellen (BMDCs afgeleide). Ze hebben meer fysiologische eigenschappen gemeen met primaire macrofagen of dendritische cellen dan met bijbehorende cellijnen. Een ander groot voordeel is de mogelijkheid van het verkrijgen van deze cellen vormen genetisch gemodificeerde muizen13. Vergelijkende studies tussen wild-type cellen en cellen die zijn afgeleid van genetisch gemodificeerde muizen zijn vaak essentieel voor het blootleggen van de nieuwe functies van genen of eiwitten van belang.
Analyse van subcellular localisatie van proteÃ¯nen in levende cellen vereist de koppeling van een fluorescerende label om de proteïne van belang in vivo. Dit wordt meestal bereikt door het uiten van genetisch gecodeerde fusion constructie bestaat uit een geanalyseerde eiwit gekoppelde (vaak via een korte linker) aan een fluorescente proteïne (bv., groen fluorescente proteïne (GFP))14,15 , 16. de expressie van fluorescently tagged eiwitten in dendritische cellen of macrofagen is een uitdaging. Deze cellen zijn over het algemeen moeilijk te transfect door standaard transfectie procedures en de efficiencyeffecten zijn meestal zeer laag. Bovendien, de transfectie van voorbijgaande aard is, genereert het cellulaire stress en bereikte intensiteit van de fluorescentie misschien niet voldoende voor microscopie17. Met het oog op een redelijke breuk van deze cellen met een voldoende niveau van transgenic expressie, de infectie van het beenmerg voorlopercellen met retrovirale vectoren en hun latere differentiatie in BMDMs of BMDCs is uitgegroeid tot een zeer efficiënt aanpak. Het is toegestaan voor de analyse van de eiwitten van myeloïde oorsprong in hun inheemse cellulaire omgeving, zowel in een stabiele toestand of tijdens processen die essentieel zijn voor de immuunrespons zoals fagocytose, immunologische synapse formatie of migratie. Hier beschrijven we een protocol waarmee stabiele expressie van fluorescently tagged proteïnen van belang in lymfkliertest beenmerg afgeleid macrofagen en dendritische cellen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>15028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>10270</td>
			<td>For media suplementation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Lachema, Brno, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>BB Pharma AS, Prague, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PENICILIN G 1,0 DRASELN&#193; SOL&#39; BIOTIKA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>S9137</td>
			<td>Streptomycin sulfate salt powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Dr. Kulich Pharma, Hradec Kr&#225;lov&#233;, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, linear, MW 25,000</td>
			<td>Polyscience, Warrington, PA, USA</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>101212</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>123110</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>117310</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)</td>
			<td>315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>H1398</td>
			<td>flow cytometry analysis use at 1-2 &#181;g/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow-derived dendritic cells and macrophages

Dendritische cellen en macrofagen zijn cruciale cellen die de eerste lijn van verdediging tegen ziekteverwekkers vormen. Zij spelen ook belangrijke rollen in de inleiding van een adaptieve immuunrespons. Experimenteel werk met deze cellen is nogal uitdagend. Hun overvloed in organen en weefsels is relatief laag. Dientengevolge, kunnen niet zij worden afgezonderd in grote aantallen. Ze zijn ook moeilijk te transfect met cDNA constructies. In het lymfkliertest model, kunnen deze problemen ten dele worden overwonnen door in vitro differentiatie van beenmerg progenitoren in aanwezigheid van M-CSF voor macrofagen of GM-CSF voor dendritische cellen. Op deze manier is het mogelijk om grote hoeveelheden van deze cellen te verkrijgen uit de weinige dieren. Bovendien kunnen het beenmerg progenitoren worden transduced met de retrovirale vectoren uitvoering van cDNA constructies tijdens de vroege stadia van de teelt voorafgaand aan hun differentiatie in het beenmerg-afgeleide dendritische cellen en macrofagen. Dus, kan de retrovirale transductie gevolgd door differentiatie in vitro wil verschillende cDNA constructies in deze cellen worden gebruikt. De mogelijkheid om uit te drukken ectopische eiwitten aanzienlijk vergroot het bereik van experimenten die kunnen worden uitgevoerd op deze cellen, met inbegrip van de levende cel beeldvorming van fluorescente proteïnen, tandem zuivering voor interactome analyses, structuur-functie-analyses, bewaking van cellulaire functies met biosensoren en vele anderen. In dit artikel beschrijven we een gedetailleerd protocol voor retrovirale transductie van lymfkliertest beenmerg afgeleide dendritische cellen en macrofagen met vectoren codering voor fluorescently-gelabelde proteïnen. Op het voorbeeld van twee adaptor eiwitten, OPAL1 en PSTPIP2, we laten zien op de praktische toepassing ervan in de stroom cytometry en microscopie. Ook bespreken we de voordelen en beperkingen van deze aanpak.

Signalering adaptor eiwitten zijn meestal kleine eiwitten zonder een enzymatische activiteit. Ze bezitten verschillende interactie domeinen of motieven, die binding met andere eiwitten bemiddelen die betrokken zijn bij signaaltransductie, met inbegrip van tyrosine kinases, fosfatasen genaamd, ubiquitin ligases e.a.21. Voor de demonstratie van de functionaliteit van dit protocol werden myeloïde cel adapters PSTPIP2 en OPAL1 geselecteerd. PSTPIP2 is een goed gekarak...

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages at JoVE.com

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Expressie van fluorescerende Fusion eiwitten in lymfkliertest beenmerg-afgeleide dendritische cellen en macrofagen

In dit artikel geven wij dat een gedetailleerd protocol voor de expressie van fluorescerende fusion eiwitten in lymfkliertest beenmerg-afgeleide dendritische cellen en macrofagen. De methode is gebaseerd op de transductie van het beenmerg progenitoren met retrovirale constructies gevolgd door differentiatie in macrofagen en dendritische cellen in vitro.

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van macrofaag en dendritische celbiologie over de subcellulaire lokalisatie en dynamiek van verschillende eiwitten in deze celtypen. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het relatief eenvoudig, goedkoop, en toont een betere efficiëntie en stabiliteit van de expressie dan de meerderheid van de andere beschikbare methoden. Het aantonen van de procedure zal Jarmila Kralova zijn, een student uit mijn laboratorium.Voor de productie van het retrovirus, plaat een eencellige suspensie van Platinum Eco-verpakkingscellen in een 10 centimeter petrischaal en cultiveren van de cellen in 15 milliliter DMEM, aangevuld met 10%foetale runderserum, of FBS, totdat de cultuur is 50 tot 60%confluent. De volgende dag, voeg 20 microgram van de retrovirale constructie van belang en 10 microgram van PCL eco-verpakking vector tot 1 milliliter DMEM zonder serum, met zachte mengen. Voeg 75 microliter PEI in 1 milliliter DMEM zonder serum en antibiotica toe aan een tweede buis voor een incubatie van vijf minuten bij kamertemperatuur, en meng de inhoud van beide buizen samen voor een extra incubatie van 10 minuten bij kamertemperatuur.Vervang vervolgens voorzichtig het medium op de Platinum Eco-cellen door 8 milliliter verse 37 graden Celsius DMEM aangevuld met 2%FBS en voeg voorzichtig het transfectiemengsel in druppels toe aan de plaat. Na een 4 uur durende incubatie bij 37 graden Celsius, vervang de supernatent met 10 milliliter van 37 graden Celsius DMEM, aangevuld met 10%FBS voor een 24-uurs incubatie bij 37 graden Celsius. De volgende dag, gebruik maken van een 5 milliliter pipet om de ecotrope retrovirale deeltjes-bevattende supernatent overbrengen naar een 15 milliliter centrifuge buis en verwijder het puin en met cellen door centrifugatie.Voeg ondertussen 10 milliliter van 37 graden Celsius DMEM plus 10%FBS toe aan het kweekschotel voor nog eens 24 uur incubatie bij 37 graden Celsius en verzamel een tweede ronde virale deeltjes zoals net aangetoond. Om het beenmerg te oogsten, in een weefselkweekkap, gebruik je een pincet en een schaar om de huid en een deel van de spieren uit de achterste ledematen te verwijderen en het acetabulum voorzichtig uit het heupgewricht te verjagen zonder het dijbeen te breken. Snijd de poten aan de enkelgewrichten en spray de botten met 70%ethanol.Verwijder vervolgens de rest van de spier met een papieren handdoek en plaats de botten in een 5 centimeter petrischaaltje PBS aangevuld met 2%FBS. Buig vervolgens het kniegewricht van elke botset en scheid de botten zorgvuldig met een schaar. Gebruik de schaar te verwijderen ongeveer een tot twee millimeter van elke epifyse van een bot en gebruik een twee of vijf milliliter spuit uitgerust met een 30-meter naald geladen met verse PBS plus FBS om het beenmerg spoelen van beide uiteinden van het bot in een 15 milliliter centrifuge buis.Wanneer het merg is verzameld uit elk van de botten, pellet de botcellen door centrifugatie en opnieuw opschorten de pellet in 2,5 milliliter van rode bloedcel lyse buffer gedurende twee tot drie minuten bij kamertemperatuur. Na lysing, filter de cellen door een 100 micrometer celzeef in een nieuwe 15 milliliter centrifugebuis en herstel de vasthoudendheid met 12 milliliter PBS plus FBS. Re-suspend de pellet in DMEM, aangevuld met 10%FBS en antibiotica voor het tellen en plaat vijf tot 10 keer 10 tot de zesde beenmergcellen in een 10 centimeter, niet-weefsel cultuur behandeld petrischaal in 10 milliliter DMEM aangevuld met serum en macrofaag kolonie stimulerende factor, of MCSF.Op dag vijf van de cultuur, voorzichtig kantelen de cel cultuur schotel en verwijder alle, maar ongeveer 5 milliliter medium van het oppervlak in de buurt van de rand van de schotel. Voeg vervolgens 20 milliliter vers 37 graden Celsius medium aangevuld met FBS en MCSF toe aan de schotel en breng de cellen terug naar de celkweek incubator. Om de cellen te oogsten, op dag zes tot zeven, verwijder alle middelgrote en drijvende cellen en was de cultuur met 37 graden Celsius PBS.Maak de aanhangende cellen met vijf milliliter van 0,02%EDTA en PBS gedurende drie tot vijf minuten bij 37 graden Celsius in de weefselkweek incubator en gebruik een vijf milliliter pipet om de gescheiden cellen voorzichtig van de plaatbodem te spoelen. Breng de cellen vervolgens over naar een 50 milliliter centrifugebuis met 25 milliliter verse PBS. Om EGFP-gelabelde eiwitexpressie in door beenmerg afgeleide antigeencellen te induceren, verdunt u aan het begin van het celdifferentiatieprotocol de beenmergcellen tot twee tot vijf keer 10 tot de zesde cellen per milliliter DMEM plus FBS en antibioticaconentratie en bord de cellen van één milliliter medium per put, aangevuld met de juiste differentiatie cytokine.Voeg na vier tot zes uur in de celkweek incubator twee milliliter van de eerste ronde verzameld virus toe, aangevuld met polybrene en transduceer de celculturen door centrifugatie en een vier uur durende incubatie in de celkweek incubator. Breng aan het einde van de transductieperiode de niet-loodzwaarte cellen van elke bron over in individuele 15 milliliter centrifugebuizen en verzamel de cellen door middel van centrifugatie. Als grotere hoeveelheid cellen nodig is, kunnen de cellen worden geïnfecteerd met dezelfde constract in meerdere putten en gepoold vóór differentiatie.Dan opnieuw opschorten de pellets in 10 milliliter van cultuur medium aangevuld met de juiste differentiatie cytokine en plaat de cellen op een 10 centimeter niet-weefsel cultuur behandeld petrischaal per buis, voor hun zes tot acht dagen cultuur, zoals net aangetoond. Evaluatie van de werkzaamheid van Platinum Eco transfection door stroomcytometrie na de verzameling van het tweede virus dat supernatent bevat, toont een gemiddelde transfectie-efficiëntie aan van 62% voor PSTPIP2-EGFP en 53% voor OPAL1-EGFP. Retrovirale transductie heeft geen invloed op de differentiatiestatus van de beenmerg afgeleide cellen met meer dan 90% van de cellen in beide culturen die positiviteit aantonen voor hun respectieve markers na transductie met beide virussen.En met de juiste, karakteristieke morfologische veranderingen waargenomen voor beide soorten gedifferentieerde cel. De algemene expressie van EGFP was lager in beenmerggevormde dendritische celculturen in vergelijking met de uit beenmerg afgeleide macrofaag-EGFP-expressie, ongeacht het type retrovirus. Tijdens een poging deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om niet-weefsel te gebruiken, cultuur behandeld plastic gerechten die meestal worden gebruikt voor het cultiveren van bacteriën als u van plan bent om cellen te verwijderen uit de schotel voor experiment.Na deze procedure kunnen andere methoden live cell imaging, super resolutie microscopie of andere soorten microscopie worden gebruikt om aanvullende vragen te beantwoorden over de subcellulaire lokalisatie en dynamiek van dendritische cel en macrofaag eiwitten van belang. Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van immunologie bij het verkennen van de distributie en ruimtelijke relaties van eiwitten uitgedrukt door macrofagen en dendritische cellen en in het bevorderen van ons begrip van de functie van deze eiwitten tijdens immuunreacties. Vergeet niet dat het werken met virale deeltjes zeer gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het minimaliseren van aerosol generatie, het dragen van beschermende apparatuur, en het gebruik van een laminaire stroomkap, moet altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Cultuur van myeloïde dendritische cellen uit beenmerg precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Generatie van beenmerg afgeleide Murine dendritische cellen voor gebruik in twee-foton Imaging

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

De vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit Murine Bone Marrow voor Elektroporatie

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Fluorescerende Labeling van COS-7 tot expressie SNAP-tag fusieproteïnen voor live cell imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Met behulp van een geautomatiseerde cel Counter aan Gene Expression Studies Vereenvoudigen: siRNA Knockdown van IL-4 Afhankelijk van genexpressie in cellen Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Photoconversion van gezuiverde fluorescerende eiwitten en dual-probe optische markering in levende cellen

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

Peptiden van faag display bibliotheek Modulate genexpressie in mesenchymale cellen en versterken Osteogenesis in Unicortical Bone Gebreken

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...