Name: expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow-derived dendritic cells and macrophages
Uploaded: 2018-10-30T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von tschechischen Science Foundation (GACR) (Projekt Nr. 16-07425S), von Charles University Grant Agency (GAUK) (Projekt-Nr. 923116) und durch die institutionelle Förderung vom Institut für molekulare Genetik, Akademie der Wissenschaften der Tschechischen Republik unterstützt. Republik (RVO 68378050).

Alle hier beschriebene Methoden wurden durch den Sachverständigenausschuss für die Wohlfahrt der Versuchstiere des Instituts für molekulare Genetik und der Akademie der Wissenschaften der Tschechischen Republik zugelassen.
(1) Reagenz Vorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie den Puffer Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK). 500 mL DdH2O, fügen Sie 4,145 g NH4Cl und 0,5 g KHCO3 hinzu dann fügen Sie 100 µL 0,5 M Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA hinzu) und sterili...

<ol>
	<li>Moghaddam, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity,+polarization+and+function+in+health+and+disease.">Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease.</a> Journal of Cellular Physiology. , (2018).</li><li>Qian, C., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+the+regulation+of+immunity+and+inflammation.">Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation.</a> Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).</li><li>Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function:+from+mechanisms+to+disease.">Neutrophil function: from mechanisms to disease.</a> Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).</li><li>Kondo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+and+myeloid+lineage+commitment+in+multipotent+hematopoietic+progenitors.">Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors.</a> Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).</li><li>Andrews, T., Sullivan, K. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+factor+in+L-cell+conditioned+medium+capable+of+stimulating+colony+formation+by+mouse+marrow+cells+in+culture.">Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture.</a> Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).</li><li>Scheicher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+GM-CSF+induces+in+vitro+differentiation+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow.">Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).</li><li>Stanley, E. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow.">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).</li><li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor.">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li><li>Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+non-equivalence+of+murine+(monocyte-)+macrophage+cells+in+biomaterial+and+inflammatory+models.">Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).</li><li>Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein:+a+perspective.">Green fluorescent protein: a perspective.</a> Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+In+Vivo+Imaging+Using+Fluorescent+Proteins.">Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).</li><li>Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+fluorescent+proteins.">Flow cytometry of fluorescent proteins.</a> Methods. 57 (3), 318-330 (2012).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+discoveries+in+CRMO:+IL-1beta,+the+neutrophil,+and+the+microbiome+implicated+in+disease+pathogenesis+in+Pstpip2-deficient+mice.">New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).</li><li>Holleman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+outcome+predictor+in+acute+leukemia+1+(OPAL1)+gene+is+not+an+independent+prognostic+factor+in+patients+treated+according+to+COALL+or+St+Jude+protocols.">Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols.</a> Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).</li><li>Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+Differentiation+of+Murine+Myeloid+Precursor+32D/G-CSF-R+Cells.">Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).</li><li>Kralova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transmembrane+Adaptor+Protein+SCIMP+Facilitates+Sustained+Dectin-1+Signaling+in+Dendritic+Cells.">The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).</li><li>Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960 (2014).</li><li>Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protocol+for+efficient+transfection+of+dendritic+cells+without+cell+maturation.">Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766 (2011).</li><li>Siegert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+siRNA+into+mouse+bone+marrow-derived+macrophages+and+dendritic+cells.">Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery:+Potential+Applications+for+Gene+and+Cell-Based+Therapies+in+the+New+Era+of+Personalized+Medicine.">Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine.</a> Genes &amp; Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li><li>Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+progress+in+gene+delivery+technology+based+on+chemical+methods+and+nano-carriers.">Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers.</a> Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).</li><li>Muruve, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome+recognizes+cytosolic+microbial+and+host+DNA+and+triggers+an+innate+immune+response.">The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response.</a> Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).</li><li>Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+humoral+immune+responses+to+viral+antigens+create+barriers+to+lung-directed+gene+therapy+with+recombinant+adenoviruses.">Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses.</a> Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).</li><li>Tallone, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+adenovirus+gene+delivery.">A mouse model for adenovirus gene delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).</li><li>Milone, M. C., O'Doherty, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+use+of+lentiviral+vectors.">Clinical use of lentiviral vectors.</a> Leukemia. , (2018).</li><li>McTaggart, S., Al-Rubeai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+vectors+for+human+gene+delivery.">Retroviral vectors for human gene delivery.</a> Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transience+of+transient+overexpression.">The transience of transient overexpression.</a> Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).</li></ol>

Der Ausdruck des Proteins des Interesses an Zielzellen ist ein wichtiger Schritt in vielen Arten von biologischen Studien. Differenzierte Makrophagen und dendritischen Zellen sind schwer zu transfizieren standard Transfektion und retrovirale Transduktion Techniken. Unter Umgehung der Transfektion von diesen differenzierten Zellen mit retrovirale Transduktion von Knochenmark Vorläufern, gefolgt von Differenzierung, wenn sie bereits das gewünschte Konstrukt tragen ist ein entscheidender Schritt, so dass des Ausdrucks der...

Myeloische Zellen sind einen unverzichtbaren Bestandteil unserer Abwehrmechanismen gegen Krankheitserreger. Sie sind in der Lage, schnell Mikroben sowie sterbenden Zellen zu beseitigen. Darüber hinaus engagieren sie sich auch bei der Regulierung der Gewebeentwicklung und Reparatur und bei der Aufrechterhaltung der Homöostase1,2,3. Alle myeloische Zellen unterscheiden sich von gemeinsamen myeloischen Vorläuferzellen im Knochenmark. Ihre Differenzierung in vielen funktionell und morphologisch unterschiedlichen Teilmengen ist zu einem großen Teil durch Zytokine und ihre verschiedenen Kombinationen4gesteuert. Die am intensivsten untersuchten myeloische Zelle Teilmengen sind Neutrophile Granulozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen. Mängel in keinem dieser Populationen führen zu potenziell lebensbedrohliche Konsequenzen und Ursache schweren Funktionsstörungen des Immunsystems bei Menschen und Mäusen1,2,3,5, 6.
Im Gegensatz zu Neutrophile Granulozyten dendritische Zellen und Makrophagen resident Gewebezellen und ihre Fülle im Immunsystem Organe ist relativ gering. Infolgedessen ist die Isolierung und Reinigung der primären dendritische Zellen und Makrophagen für Experimente erfordern eine große Anzahl dieser Zellen teuer und oft unmöglich. Um dieses Problem zu lösen, wurden Protokolle entwickelt, um große Mengen von homogenen Makrophagen oder dendritische Zellen in Vitrozu erhalten. Diese Ansätze basieren auf die Differenzierung der murinen Knochenmarkzellen in Anwesenheit von Zytokinen: Makrophagen Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) für Makrophagen und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) oder Flt3 Ligand für Dendritische Zellen7,8,9,10,11,12. Zellen, die von dieser Methode generiert werden häufig in der Literatur beschrieben, wie Knochenmark Makrophagen (BMDMs) und Knochenmark dendritische Zellen (BMDCs abgeleitet). Sie haben mehr physiologische Eigenschaften gemeinsam mit primären Makrophagen oder dendritische Zellen als mit entsprechenden Zell-Linien. Ein weiterer großer Vorteil ist die Möglichkeit, diese Zellen bilden genetisch veränderter Mäuse13. Vergleichende Studien zwischen Wildtyp Zellen und Zellen aus genetisch veränderten Mäusen sind oft entscheidend für die Aufdeckung neuer Funktionen von Genen oder Proteinen von Interesse.
Analyse der subzellulären Lokalisierung der Proteine in lebenden Zellen erfordert die Kopplung eines fluoreszierenden Labels an das Protein des Interesses in Vivo. Dies geschieht am häufigsten durch genetisch codierte Fusion Konstrukt bestehend aus einer analysierten Protein (oft über einen kurzen Linker) gekoppelt an ein fluoreszierendes Protein zum Ausdruck zu bringen (zB., grün fluoreszierenden Proteins (GFP))14,15 , 16. der Ausdruck Eindringmittel tagged Proteine in dendritischen Zellen oder Makrophagen ist anspruchsvoll. Diese Zellen sind in der Regel schwer zu transfizieren standard Transfektion Verfahren und die Wirkungsgrade sind in der Regel sehr gering. Darüber hinaus die Transfektion ist flüchtig, es erzeugt zellulären Stresses und erreichten Intensität der Fluoreszenz ist möglicherweise nicht ausreichend für Mikroskopie17. Erlangung einen angemessenen Bruchteil dieser Zellen mit ein ausreichendes Maß an Transgene Ausdruck, die Infektion des Knochenmarks Vorläuferzellen mit retroviralen ist Vektoren und ihre anschließende Differenzierung in BMDMs oder BMDCs eine sehr effiziente geworden Ansatz. Es darf für die Analyse der Proteine myeloischen Ursprungs in ihrer natürlichen zellulären Umgebung, in einem stabilen Zustand oder bei Prozessen, die für die Immunantwort wie Phagozytose, immunologische Synapse Bildung oder Migration entscheidend sind. Hier beschreiben wir ein Protokoll, stabile Expression Eindringmittel tagged Proteine des Interesses an murine Knochenmark abgeleitet Makrophagen und dendritischen Zellen ermöglicht.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>15028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>10270</td>
			<td>For media suplementation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Lachema, Brno, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>BB Pharma AS, Prague, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PENICILIN G 1,0 DRASELN&#193; SOL&#39; BIOTIKA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>S9137</td>
			<td>Streptomycin sulfate salt powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Dr. Kulich Pharma, Hradec Kr&#225;lov&#233;, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, linear, MW 25,000</td>
			<td>Polyscience, Warrington, PA, USA</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>101212</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>123110</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>117310</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)</td>
			<td>315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>H1398</td>
			<td>flow cytometry analysis use at 1-2 &#181;g/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow-derived dendritic cells and macrophages

Dendritische Zellen und Makrophagen sind wichtige Zellen, die die erste Linie der Verteidigung gegen Krankheitserreger bilden. Sie spielen auch eine wichtige Rolle bei der Initiierung einer adaptiven Immunantwort. Experimenteller Arbeit mit diesen Zellen ist sehr anspruchsvoll. Ihre Fülle in Organen und Geweben ist relativ gering. Infolgedessen können nicht sie in großer Zahl isoliert werden. Sie sind auch schwer zu transfizieren mit cDNA-Konstrukten. Im Mausmodell können diese Probleme teilweise durch in Vitro Differenzierung von Knochenmark Vorläufern im Beisein von M-CSF für Makrophagen oder GM-CSF für dendritische Zellen überwunden werden. Auf diese Weise ist es möglich, große Mengen dieser Zellen von sehr wenigen Tieren zu erhalten. Darüber hinaus können Knochenmark Stammväter mit retroviralen Vektoren tragen cDNA-Konstrukte in frühen Phasen des Anbaus vor deren Differenzierung in Knochenmark abgeleitet dendritische Zellen und Makrophagen ausgestrahlt werden. So kann retrovirale Transduktion gefolgt von in-vitro- Differenzierung verwendet werden, verschiedene cDNA-Konstrukte in diesen Zellen zum Ausdruck bringen. Die Fähigkeit, ektopische Proteine deutlich auszudrücken reicht das Verbreitungsgebiet von Experimenten, die auf diese Zellen, einschließlich live Cell Imaging von fluoreszierenden Proteinen, Tandem Reinigungen für Interaktom Analysen, Struktur-Funktionsanalyse durchgeführt werden können, Überwachung der Zellfunktionen mit Biosensoren und viele andere. In diesem Artikel beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für retrovirale Transduktion von murinen Knochenmark abgeleitet dendritischen Zellen und Makrophagen mit Vektoren für Gewebekulturen getaggt Proteine codieren. Am Beispiel von zwei Adapter-Proteine, OPAL1 und PSTPIP2, zeigen wir die praktische Anwendung in Durchflusszytometrie und Mikroskopie. Wir diskutieren auch die Vorzüge und Grenzen dieses Ansatzes.

Signalproteine Adapter sind in der Regel kleine Proteine ohne enzymatische Aktivität. Sie besitzen verschiedene Interaktion Domänen oder Motive, die Bindung an andere Proteine vermitteln beteiligt Signaltransduktion, einschließlich Tyrosin-Kinasen und Phosphatasen, Ubiquitin Ligases21. Für die Demonstration der Funktionalität dieses Protokolls wurden myeloid Zellen-Adapter PSTPIP2 und OPAL1 ausgewählt. PSTPIP2 ist ein gut charakterisierten Protein an der Regu...

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Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Ausdruck von fluoreszierenden Fusionsproteinen in murinen Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen und Makrophagen

In diesem Artikel liefern wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für den Ausdruck von fluoreszierenden Fusionsproteinen in murinen Knochenmark dendritische Zellen und Makrophagen abgeleitet. Die Methode basiert auf der Transduktion des Knochenmarks Stammväter mit retroviralen Konstrukten gefolgt von Differenzierung in Makrophagen und dendritischen Zellen in Vitro.

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in den Bereichen Makrophagen und dendritische Zellbiologie über die subzelluläre Lokalisierung und Dynamik verschiedener Proteine in diesen Zelltypen zu beantworten. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie relativ einfach und kostengünstig ist und eine bessere Effizienz und Stabilität der Expression als die meisten anderen verfügbaren Methoden zeigt. Demonstriert wird das Verfahren jarmila Kralova, eine Grad-Studentin aus meinem Labor.Um das Retrovirus herzustellen, platte eine einzellige Suspension von Platinum Eco-Verpackungszellen in einer 10-Zentimeter-Petrischale und kultivieren die Zellen in 15 Milliliter DMEM, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, oder FBS, bis die Kultur 50 bis 60% konfluent ist. Am nächsten Tag 20 Mikrogramm des retroviralen Konstrukts von Interesse und 10 Mikrogramm PCL-Öko-Verpackungsvektor zu 1 Milliliter DMEM ohne Serum, mit sanfter Mischung hinzufügen. Fügen Sie 75 Mikroliter PEI in 1 Milliliter DMEM ohne Serum und Antibiotika in ein zweites Rohr für eine fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur und mischen Sie den Inhalt beider Röhren für eine zusätzliche 10-minütige Inkubation bei Raumtemperatur.Als nächstes ersetzen Sie das Medium auf den Platinum Eco Zellen sorgfältig durch 8 Milliliter frisches 37 Grad Celsius DMEM, ergänzt durch 2%FBS, und fügen Sie die Transfektionsmischung vorsichtig in Tropfen auf die Platte. Nach einer 4-stündigen Inkubation bei 37 Grad Celsius, ersetzen Sie das Überstand durch 10 Milliliter 37 Grad Celsius DMEM, ergänzt durch 10%FBS für eine 24-Stunden-Inkubation bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag verwenden Sie eine 5 Milliliter Pipette, um das ökotrope retrovirale partikelhaltige Überstand auf ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr zu übertragen und die Trümmer zu entfernen und Zellen durch Zentrifugation zu enthalten.Fügen Sie derweil 10 Milliliter 37 Grad Celsius DMEM plus 10% FBS für eine weitere 24-Stündige Inkubation bei 37 Grad Celsius hinzu und sammeln Sie eine zweite Runde von Viruspartikeln, wie gerade gezeigt. Um das Knochenmark in einer Gewebekulturhaube zu ernten, verwenden Sie Pinzette und Schere, um die Haut und einen Teil der Muskeln von den Hinterbeinen zu entfernen und das Acetabulum vorsichtig aus dem Hüftgelenk zu entfernen, ohne den Oberschenkelknochen zu brechen. Schneiden Sie die Pfoten an den Sprunggelenken und sprühen Sie die Knochen mit 70% Ethanol.Dann entfernen Sie den Rest des Muskels mit einem Papiertuch und legen Sie die Knochen in eine 5 Zentimeter Petrischale von PBS mit 2%FBS ergänzt. Als nächstes biegen Sie das Kniegelenk jedes Knochensatzes und trennen Sie die Knochen vorsichtig mit einer Schere. Verwenden Sie die Schere, um etwa ein bis zwei Millimeter jeder Epiphyse eines Knochens zu entfernen und verwenden Sie eine Zwei- oder Fünf-Milliliter-Spritze, die mit einer 30-Spur-Nadel ausgestattet ist, die mit frischem PBS plus FBS beladen ist, um das Knochenmark von beiden Enden des Knochens in ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr zu spülen.Wenn das Mark von jedem der Knochen gesammelt wurde, pellet die Knochenzellen durch Zentrifugation und setzt das Pellet in 2,5 Milliliter roter Blutkörperchen LysePuffer für zwei bis drei Minuten bei Raumtemperatur wieder auf. Filtern Sie die Zellen nach dem Lysing durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb in ein neues 15-Milliliter-Zentrifugenrohr und stellen Sie die Hartnäckigkeit mit 12 Milliliter PBS plus FBS wieder her. Setzen Sie das Pellet in DMEM wieder aus, ergänzt mit 10%FBS und Antibiotika zum Zählen und Platten fünf bis zehn mal 10 bis zu den sechsten Knochenmarkzellen in einem 10 Zentimeter, nicht-Gewebe-Kultur behandelt Petrischale in 10 Milliliter DMEM ergänzt mit Serum und Makrophagen Kolonie stimulierenden Faktor, oder MCSF.Am fünften Tag der Kultur, vorsichtig kippen sie die Zellkulturschale und entfernen Sie alle bis auf etwa 5 Milliliter Medium von der Oberfläche in der Nähe des Rands der Schale. Dann fügen Sie 20 Milliliter frisches 37 Grad Celsius Medium mit FBS und MCSF ergänzt in die Schale und geben Sie die Zellen an die Zellkultur Inkubator. Um die Zellen zu ernten, am Tag sechs bis sieben, entfernen Sie alle mittleren und schwimmenden Zellen und waschen Sie die Kultur mit 37 Grad Celsius PBS.Lösen Sie die anhaftenden Zellen mit fünf Millilitern 0,02%EDTA und PBS für drei bis fünf Minuten bei 37 Grad Celsius im Inkubator der Gewebekultur und verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Pipette, um die dissoziierten Zellen vorsichtig vom Plattenboden zu spülen. Dann übertragen Sie die Zellen in ein 50 Milliliter Zentrifugenrohr mit 25 Millilitern frischer PBS. Um die EGFP-markierte Proteinexpression in Knochenmark abgeleiteten Antigen-Prägnozellen zu induzieren, verdünnen Sie zu Beginn des Zelldifferenzierungsprotokolls die Knochenmarkzellen auf zwei bis fünf Mal 10 bis sechs milliliter DMEM plus FBS und Antibiotika-Konentration und platten die Zellen von einem Milliliter Medium pro Brunnen, ergänzt durch die entsprechende Differenzierung Cytokin.Nach vier bis sechs Stunden im Zellkultur-Inkubator zwei Milliliter der ersten Runde des gesammelten Virus hinzufügen, ergänzt durch Polybren, und transduce die Zellkulturen durch Zentrifugation und eine vierstündige Inkubation im Zellkultur-Inkubator. Übertragen Sie am Ende der Transduktionsperiode die nicht haftenden Zellen von jedem Bohrkörper in einzelne 15-Milliliter-Zentrifugenröhren und sammeln die Zellen durch Zentrifugation. Wenn eine größere Anzahl von Zellen benötigt wird, können die Zellen mit dem gleichen Einzieher in mehreren Brunnen infiziert und vor der Differenzierung gepoolt werden.Dann setzen Sie die Pellets in 10 Milliliter Kulturmedium mit der entsprechenden Differenzierung Cytokin ergänzt und die Zellen auf eine 10 Zentimeter Non-Gewebe-Kultur behandelt Petrischale pro Tube, für ihre sechs bis acht Tage Kultur, wie gerade gezeigt. Die Bewertung der Wirksamkeit der Platin-Eco-Transfektion durch Durchflusszytometrie nach der Entnahme des zweiten Virus, das überlautende Viren enthält, zeigt eine mittlere Transfektionseffizienz von 62 % für PSTPIP2-EGFP und 53 % für OPAL1-EGFP. Die retrovirale Transduktion hat keinen Einfluss auf den Differenzierungsstatus der knochenmarkabgeleiteten Zellen, wobei mehr als 90 % der Zellen in beiden Kulturen nach der Transduktion mit beiden Viren Positivität für ihre jeweiligen Marker aufweisen.Und mit den entsprechenden, charakteristischen morphologischen Veränderungen, die für beide Arten von differenzierten Zellen beobachtet wurden. Bemerkenswert ist, dass die Gesamtexpression von EGFP in knochenmarkabgeleiteten dendritischen Zellkulturen niedriger war als die von Knochenmark abgeleitete Makrophagen-EGFP-Expression, unabhängig von der Art des Retrovirus. Beim Versuch dieses Verfahrens, Es ist wichtig, daran zu denken, nicht Gewebe zu verwenden, Kultur behandelt Kunststoffgeschirr, die in der Regel für die Kultivierung von Bakterien verwendet werden, wenn Sie planen, Zellen aus der Schale für Experimente zu entfernen.Nach diesem Verfahren können andere Methoden der Live-Zell-Bildgebung, der Superauflösungsmikroskopie oder anderer Arten von Mikroskopie eingesetzt werden, um zusätzliche Fragen zur subzellulären Lokalisierung und Dynamik von dendritischen Zell- und Makrophagenproteinen zu beantworten. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Immunologie bei der Erforschung der Verteilung und der räumlichen Beziehungen von Proteinen, die durch Makrophagen und dendritische Zellen exprimiert werden, und bei der Förderung unseres Verständnisses der Funktion dieses Proteins während der Immunantworten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit viralen Partikeln extrem gefährlich sein kann und dass Vorsichtsmaßnahmen, wie die minimale Aerosolerzeugung, das Tragen von Schutzausrüstung und die Verwendung einer laminaren Durchflusshaube, immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden sollten.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Kultur myeloide dendritische Zellen aus dem Knochenmark Vorstufen

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Forschung

Biologie

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Generierung von Knochenmark murinen dendritischen Zellen für den Einsatz in 2-Photonen-Imaging

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Fluoreszenzmarkierung von COS-7 mit dem Ausdruck SNAP-tag-Fusionsproteinen für das Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Verwendung eines automatisierten Cell Counter zu Genexpressionsstudien Simplify: siRNA Knockdown von IL-4 abhängige Genexpression in Namalwalzellen

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Photokonversion von gereinigtem fluoreszierende Proteine ​​und Dual-Sonde Optische Hervorhebung in lebenden Zellen

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

Peptide aus Phage Display Bibliothek Genexpression modulieren in mesenchymalen Zellen und potenzieren Osteogenesis in unikortikale Knochendefekten

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...