Name: expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow-derived dendritic cells and macrophages
Uploaded: 2018-10-30T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הצ'כית המדע קרן (GACR) (פרויקט מספר 16-07425S), על ידי צ'ארלס אוניברסיטת גרנט סוכנות (גאוק) (מספר הפרוייקט 923116) ועל -ידי מוסדיים מימון מן המכון של הגנטיקה המולקולרית, האקדמיה למדעים הצ'כי הרפובליקה (RVO 68378050).

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי ועדת מומחים הרווחה של חיות ניסוי המכון לגנטיקה מולקולרית על ידי האקדמיה למדעים של הרפובליקה הצ'כית.
1. מגיב הכנה
<ol><li>הכנת המאגר אמוניום כלוריד-אשלגן (ACK). להוסיף 4.145 g של NH4קלרנית ו- 0.5 גר' KHCO3 עד 500 מ"ל של ddH2O, ולאחר מכן להוסיף 1...

<ol>
	<li>Moghaddam, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity,+polarization+and+function+in+health+and+disease.">Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease.</a> Journal of Cellular Physiology. , (2018).</li><li>Qian, C., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+the+regulation+of+immunity+and+inflammation.">Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation.</a> Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).</li><li>Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function:+from+mechanisms+to+disease.">Neutrophil function: from mechanisms to disease.</a> Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).</li><li>Kondo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+and+myeloid+lineage+commitment+in+multipotent+hematopoietic+progenitors.">Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors.</a> Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).</li><li>Andrews, T., Sullivan, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+in+patients+with+inherited+defects+in+phagocytic+function.">Infections in patients with inherited defects in phagocytic function.</a> Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).</li><li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+biology+in+development,+homeostasis+and+disease.">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li><li>Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+factor+in+L-cell+conditioned+medium+capable+of+stimulating+colony+formation+by+mouse+marrow+cells+in+culture.">Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture.</a> Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).</li><li>Scheicher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+GM-CSF+induces+in+vitro+differentiation+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow.">Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).</li><li>Stanley, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+colony-stimulating+factor,+CSF-1.">The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1.</a> Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).</li><li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow.">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).</li><li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor.">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li><li>Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+non-equivalence+of+murine+(monocyte-)+macrophage+cells+in+biomaterial+and+inflammatory+models.">Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).</li><li>Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein:+a+perspective.">Green fluorescent protein: a perspective.</a> Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+In+Vivo+Imaging+Using+Fluorescent+Proteins.">Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).</li><li>Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+fluorescent+proteins.">Flow cytometry of fluorescent proteins.</a> Methods. 57 (3), 318-330 (2012).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+exogenous+genes+in+macrophages:+obstacles+and+opportunities.">The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities.</a> Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).</li><li>Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tolerance+induction+in+major+histocompatibility+complex+class+II-restricted+T+cells+specific+for+a+blood-borne+self-antigen.">Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen.</a> Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).</li><li>Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Characterization+of+the+New+Osteoclast+Progenitor+with+Macrophage+Phenotypes+Being+Able+to+Differentiate+into+Mature+Osteoclasts.">Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).</li><li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pCL+vector+system:+rapid+production+of+helper-free,+high-titer,+recombinant+retroviruses.">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).</li><li>Janssen, E., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptor+proteins+in+lymphocyte+activation.">Adaptor proteins in lymphocyte activation.</a> Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).</li><li>Ferguson, P. J., Laxer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+discoveries+in+CRMO:+IL-1beta,+the+neutrophil,+and+the+microbiome+implicated+in+disease+pathogenesis+in+Pstpip2-deficient+mice.">New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).</li><li>Holleman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+outcome+predictor+in+acute+leukemia+1+(OPAL1)+gene+is+not+an+independent+prognostic+factor+in+patients+treated+according+to+COALL+or+St+Jude+protocols.">Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols.</a> Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).</li><li>Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+Differentiation+of+Murine+Myeloid+Precursor+32D/G-CSF-R+Cells.">Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).</li><li>Kralova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transmembrane+Adaptor+Protein+SCIMP+Facilitates+Sustained+Dectin-1+Signaling+in+Dendritic+Cells.">The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).</li><li>Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960 (2014).</li><li>Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protocol+for+efficient+transfection+of+dendritic+cells+without+cell+maturation.">Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766 (2011).</li><li>Siegert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+siRNA+into+mouse+bone+marrow-derived+macrophages+and+dendritic+cells.">Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery:+Potential+Applications+for+Gene+and+Cell-Based+Therapies+in+the+New+Era+of+Personalized+Medicine.">Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine.</a> Genes &amp; Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li><li>Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+progress+in+gene+delivery+technology+based+on+chemical+methods+and+nano-carriers.">Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers.</a> Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).</li><li>Muruve, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome+recognizes+cytosolic+microbial+and+host+DNA+and+triggers+an+innate+immune+response.">The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response.</a> Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).</li><li>Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+humoral+immune+responses+to+viral+antigens+create+barriers+to+lung-directed+gene+therapy+with+recombinant+adenoviruses.">Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses.</a> Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).</li><li>Tallone, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+adenovirus+gene+delivery.">A mouse model for adenovirus gene delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).</li><li>Milone, M. C., O'Doherty, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+use+of+lentiviral+vectors.">Clinical use of lentiviral vectors.</a> Leukemia. , (2018).</li><li>McTaggart, S., Al-Rubeai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+vectors+for+human+gene+delivery.">Retroviral vectors for human gene delivery.</a> Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transience+of+transient+overexpression.">The transience of transient overexpression.</a> Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).</li></ol>

הביטוי של חלבונים עניין בתאי המטרה היא צעד מפתח בסוגים רבים של מחקרים ביולוגיים. תאים דנדריטים מאקרופאגים הבדיל קשים transfect על ידי תרביות תאים סטנדרטית וטכניקות retroviral התמרה חושית. דילוג על תרביות תאים תאים אלה עם retroviral התמרה חושית של אבות מח עצם, ואחריו בידול כאשר הם נושאים כבר הבונה הרצוי, ...

התאים מיאלואידית מייצגים חלק חיוני של מנגנוני ההגנה שלנו נגד פתוגנים. הם מסוגלים לחסל במהירות חיידקים, וכן תאים גוסס. בנוסף, הם גם מעורבים בוויסות התפתחות רקמת ותיקון ושמירה על הומאוסטזיס1,2,3. כל התאים מיאלואידית להבדיל אבות מיאלואידית נפוצים במח העצם. בידול שלהם לערכות מורפולוגית ושאיכות ברורים רבים היא במידה רבה נשלט על ידי ציטוקינים, שילובים שונים שלהם4. תת-קבוצות התאים מיאלואידית ביותר כוללים גרנולוציטים neutrophilic, המקרופאגים, תאים דנדריטים. פגמים בכל אוכלוסיות אלה להוביל להשלכות מסכני גורם חמור בתפקוד של מערכת החיסון אצל בני אדם ו עכברים1,2,3,5, 6.
בניגוד neutrophilic גרנולוציטים, התאים הדנדריטים ומקרופגים רקמת תאים תושב, שלהם שפע באיברים החיסון הוא נמוך יחסית. כתוצאה מכך, בידוד של טיהור של תאים דנדריטים ראשיים ו מקרופאגים לניסויים הדורשים מספר גדול של תאים אלה הוא יקר ולא לעיתים קרובות בלתי אפשרי. כדי לפתור בעיה זו, פרוטוקולים פותחו כדי לקבל כמויות גדולות של מקרופאגים הומוגני או תאים דנדריטים בתוך חוץ גופית. גישות אלה מבוססים על הבידול בתאי מח עצם מאתר בנוכחות ציטוקינים: מקרופאג המושבה-מגרה פקטור (M-CSF) עבור מקרופאגים, גורם מגרה המושבה גרנולוציט-מקרופאג (GM-CSF) או Flt3 ליגנד עבור תאים דנדריטים7,8,9,10,11,12. התאים שנוצר על ידי שיטה זו מתוארים בדרך כלל בספרות מקרופאגים (BMDMs) נגזר מח עצם, מח עצם נגזר תאים דנדריטים (BMDCs). יש להם עוד מאפיינים פיזיולוגיים במשותף עם מקרופאגים הראשי או תאים דנדריטים מאשר עם שורות תאים המתאימים. יתרון מרכזי נוסף הוא האפשרות לקבל טופס תאים אלה גנטית שונה עכברים13. לימודי השוואתי בין פראי-סוג תאים, התאים נגזר עכברים מהונדסים לעיתים קרובות הם קריטיים עבור פונקציות הרומן שיגורי של גנים או חלבונים עניין.
ניתוח של לוקליזציה subcellular של חלבונים בתאים חיים מחייב את צימוד של תווית פלורסנט החלבון של עניין אין ויוו. זו מושגת בדרך כלל על ידי הבעת לבנות פיוז'ן מקודדים גנטית מורכב של חלבונים שנותחה מצמידים (לעיתים קרובות באמצעות מקשר קצר) כדי חלבון פלואורסצנטי (למשל., ירוק (GFP) חלבון פלואורסצנטי)14,15 , 16. הביטוי של חלבונים מתויגות fluorescently תאים דנדריטים או מקרופאגים הוא מאתגר. תאים אלה הם בדרך כלל קשה transfect שגרות תקנים סטנדרטיים, היעילות נוטים להיות נמוכה מאוד. יתר על כן, תרביות תאים הוא חולף, זה יוצר מתח סלולארית, מושגת עוצמת קרינה פלואורסצנטית לא יהיה מספיק עבור מיקרוסקופ17. על מנת לקבל שבר סביר של תאים אלה לרמה מספקת של ביטוי transgene, הזיהום של מח העצם ובתאים עם retroviral וקטורים ובידול עוקבות שלהם לתוך BMDMs או BMDCs הפך להיות מאוד יעיל הגישה. זה איפשר לניתוח של החלבונים ממוצא מיאלואידית בסביבתם יליד הסלולר, הן במצב יציב, או במהלך התהליכים הם קריטיים עבור התגובה החיסונית כגון phagocytosis, היווצרות סינפסה אימונולוגי או העברה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול המאפשר ביטוי יציב של חלבונים מתויגות fluorescently עניין ב מאתר מח עצם נגזר מאקרופאגים תאים דנדריטים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>15028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>10270</td>
			<td>For media suplementation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Lachema, Brno, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>BB Pharma AS, Prague, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PENICILIN G 1,0 DRASELN&#193; SOL&#39; BIOTIKA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>S9137</td>
			<td>Streptomycin sulfate salt powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Dr. Kulich Pharma, Hradec Kr&#225;lov&#233;, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, linear, MW 25,000</td>
			<td>Polyscience, Warrington, PA, USA</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>101212</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>123110</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>117310</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)</td>
			<td>315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>H1398</td>
			<td>flow cytometry analysis use at 1-2 &#181;g/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow-derived dendritic cells and macrophages

תאים דנדריטי macrophages מכריע התאים היוצרים את השורה הראשונה של הגנה מפני פתוגנים בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. הם גם לשחק תפקידים חשובים אתחול של תגובה חיסונית אדפטיבית. עבודה ניסיונית עם תאים אלה הוא מאתגר למדי. שפע שלהם איברים ורקמות הוא נמוך יחסית. כתוצאה מכך, הם לא יכולים להיות מבודדים במספרים גדולים. הם גם שקשה transfect עם cDNA בונה. במודל מאתר, הבעיות הללו ניתן חלקית להתגבר על ידי במבחנה בידול של מח העצם אבות בנוכחות M-CSF עבור מקרופאגים או GM-CSF עבור תאים דנדריטים. בדרך זו, זה ניתן לקבל כמויות גדולות של תאים אלה מבעלי חיים מעט מאוד. יתר על כן, אבות מח העצם יכול להיות transduced עם וקטורים retroviral נושאת cDNA בונה בשלבים המוקדמים של טיפוח לפני שלהם התמיינות תאי דנדריטי מח עצם נגזר ואת macrophages. לפיכך, התמרה חושית retroviral ואחריו בידול במבחנה ניתן לבטא מבנים שונים cDNA בתאים אלה. היכולת לבטא באופן משמעותי חלבונים חוץ רחמי מרחיבה את טווח ניסויים שניתן לבצע על תאים אלה, כולל תא חי הדמיה של חלבונים פלורסנט, טנדם purifications עבור interactome ניתוחים, ניתוח מבנה פונקציה, ניטור של פונקציות הסלולר עם ביולוגיים ועוד רבים אחרים. במאמר זה, אנו מתארים עבור התמרה חושית retroviral של תאים דנדריטים מאתר מח עצם נגזר ו מקרופאגים פרוטוקול מפורט עם וקטורים קידוד חלבונים מתויג fluorescently. על הדוגמה של שני חלבונים מתאם, OPAL1, PSTPIP2, נדגים את היישום המעשי cytometry זרימה, מיקרוסקופ. נדון גם את היתרונות ואת המגבלות של גישה זו.

איתות מתאם חלבונים הם חלבונים קטנים בדרך כלל ללא כל פעילות אנזימטיות. ברשותם בתחומים שונים של אינטראקציה או מוטיבים, אשר לתווך קשירה לחלבונים אחרים המעורבים אותות, כולל טירוזין kinases, phosphatases, ligases אוביקוויטין ואחרים21. עבור ההדגמה של הפונקציונליות של פרוטוקול ...

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages at JoVE.com

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

ביטוי של חלבונים פיוז'ן פלואורסצנט תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם מאתר ו מקרופאגים

במאמר זה, אנו מספקים שפרוטוקול מפורט עבור הביטוי של פיוז'ן פלורסנט חלבונים במח העצם מאתר נגזר התאים הדנדריטים ומקרופגים. השיטה מבוססת על התמרה חושית של מח העצם אבות עם בונה retroviral ואחריו בידול לתוך מקרופאגים, הדנדריטים תאים במבחנה.

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומים של מקרופאג וביולוגיה של תאים דנדריטיים על לוקליזציה תת-תאית ודינמיקה של חלבונים שונים בסוגי תאים אלה. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא פשוטה יחסית, זולה, ומדגימה יעילות ויציבות ביטוי טובות יותר מרוב השיטות הזמינות האחרות. הפגנת ההליך תהיה ג'רמילה קרלובה, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי.כדי לייצר את הרטרווירוס, צלחת השעיה חד-תאית של תאי אריזה אקולוגית פלטינה בצלחת פטרי 10 ס"מ ולטפח את התאים ב 15 מיליליטר של DMEM, בתוספת 10% סרום בקר עוברי, או FBS, עד התרבות היא 50 עד 60% confluent. למחרת, להוסיף 20 מיקרוגרם של המבנה רטרו-ויראלי של עניין ו 10 מיקרוגרם של וקטור אריזה אקולוגית PCL ל 1 מיליליטר של DMEM ללא סרום, עם ערבוב עדין. הוסף 75 microliters של PEI ב 1 מיליליטר של DMEM ללא סרום ואנטיביוטיקה לצינור השני עבור דגירה חמש דקות בטמפרטורת החדר, ומערבבים את התוכן של שני הצינורות יחד עבור דגירה נוספת 10 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, החליפו בזהירות את המדיום בתאי פלטינום אקו ב-8 מיליליטר של DMEM טרי של 37 מעלות צלזיוס בתוספת 2%FBS והוסיפו בזהירות את תערובת ההטרנספיה בטיפות לצלחת. לאחר דגירה של 4 שעות ב-37 מעלות צלזיוס, החליפו את העל-טבעי ב-10 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס DMEM, בתוספת 10% FBS עבור דגירה של 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס. למחרת, להשתמש פיפטה 5 מיליליטר כדי להעביר את החלקיק רטרו-ויראלי ecotropic המכיל על טבעי לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר ולהסיר את הפסולת המכיל תאים על ידי צנטריפוגה.בינתיים, הוסיפו 10 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס DMEM ועוד 10% FBS לצלחת התרבות לעוד דגירה של 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ואספו סיבוב שני של חלקיקים נגיפיים כפי שהודגם זה הרגע. כדי לקצור את מח העצם, במכסה המנוע של תרבות הרקמה, השתמש בפינצטה ומספריים כדי להסיר את העור וחלק מהשרירים מהגפיים האחוריות ולנתק בזהירות את האצטבולום ממפרק הירך מבלי לשבור את עצם הירך. חותכים את הכפות במפרקי הקרסול ומרססים את העצמות עם 70% אתנול.לאחר מכן להסיר את שאר השריר עם מגבת נייר ומניחים את העצמות בצלחת פטרי 5 ס"מ של PBS בתוספת 2%FBS. לאחר מכן, לכופף את מפרק הברך של כל סט עצם בזהירות להפריד את העצמות עם מספריים. השתמש במספריים כדי להסיר על אחד עד שני מילימטרים של כל epiphysis של עצם אחת ולהשתמש מזרק שניים או חמישה מיליליטר מצויד מחט 30 מד טעון עם PBS טרי בתוספת FBS כדי לשטוף את מח העצם משני קצות העצם לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר.כאשר מח העצם נאסף מכל אחת מהעצמות, גלולה תאי העצם על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות את גלולה ב 2.5 מיליליטר של חיץ תמוגה תא דם אדום במשך שתיים עד שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר lysing, לסנן את התאים דרך מסננת תאים 100 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר חדש ולשחזר את העקשנות עם 12 מיליליטר של PBS בתוספת FBS. להשעות מחדש את גלולה ב DMEM, בתוספת 10%FBS ואנטיביוטיקה לספירה צלחת חמש עד 10 פעמים 10 לתאי מח העצם השישי ב 10 ס"מ, תרבות שאינה רקמה מטופלים צלחת פטרי ב 10 מיליליטר של DMEM בתוספת סרום ומושבת מקרופאג מגרה גורם, או MCSF.ביום החמישי לתרבות, להטות בזהירות את צלחת תרבות התא ולהסיר את כל אבל כ 5 מיליליטר של מדיום מפני השטח ליד קצה המנה. לאחר מכן הוסיפו 20 מיליליטר של מדיום טרי של 37 מעלות צלזיוס בתוספת FBS ו- MCSF לצלחת והחזירו את התאים לחממת תרבות התאים. כדי לקצור את התאים, ביום שש עד שבע, להסיר את כל התאים הבינוניים וצפים ולשטוף את התרבות עם 37 מעלות צלזיוס PBS.נתק את התאים החסידיים עם חמישה מיליליטר של 0.02%EDTA ו- PBS למשך שלוש עד חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרמת הרקמה ולהשתמש בפיפטה של חמישה מיליליטר כדי לשטוף בעדינות את התאים המנותקים מתחתית הלוח. ואז להעביר את התאים לצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר המכיל 25 מיליליטר של PBS טרי. כדי לגרום EGFP מתויג ביטוי חלבון במח העצם נגזר אנטיגן מציג תאים, בתחילת פרוטוקול בידול התא, לדלל את תאי מח העצם פעמיים עד חמש פעמים 10 לתאים השישי למיליליטר של DMEM בתוספת FBS ואנטיביוטיקה conentration צלחת התאים של מיליליטר אחד של בינוני ל הבאר, בתוספת ציטוקינים ההידול המתאים.לאחר ארבע עד שש שעות באינקובטור תרבות התא, להוסיף שני מיליליטר של הסיבוב הראשון של הנגיף שנאסף בתוספת פוליברן ולתמר את תרבות התא על ידי צנטריפוגה אינקובציה ארבע שעות באינקובטור תרבות התא. בסוף תקופת ההעתקה, להעביר את התאים הלא עקביים מכל באר לתוך צינורות צנטריפוגה בודדים 15 מיליליטר ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. אם יש צורך בכמות גדולה יותר של תאים, התאים יכולים להיות נגועים באותם חסרונות בארות מרובות ומאגר לפני ההידול.ואז להשעות מחדש את כדורי 10 מיליליטר של מדיום תרבות בתוספת ציטוקינים ההבחנה המתאימה צלחת התאים על אחד 10 ס"מ לא רקמה תרבות מטופלים צלחת פטרי לכל צינור, עבור תרבות שישה עד שמונה ימים שלהם, כפי שהודגם רק. הערכה של היעילות של פלטינום אקו transfection על ידי cytometry זרימה לאחר האוסף של הנגיף השני המכיל על טבעי מגלה יעילות transfection ממוצע של 62%עבור PSTPIP2-EGFP ו 53%עבור OPAL1-EGFP. התברות רטרו-ויראלית אינה משפיעה על מצב ההידול של תאי מח העצם המופקים עם יותר מ -90% מהתאים בשתי התרבויות המדגימים חיוביות עבור סמנים בהתאמה שלהם לאחר ההעתקה עם כל אחד מהווירוסים.ועם השינויים המורפולוגיים המתאימים והמאפיינים שנצפו עבור שני סוגי התאים המובחנים. שימו לב, הביטוי הכולל של EGFP היה נמוך יותר בתרבויות תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם בהשוואה לביטוי EGFP שמקורו במח העצם, ללא קשר לסוג הרטרווירוס. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש במנות פלסטיק שאינן רקמה, תרבות מטופלות המשמשות בדרך כלל לטיפוח חיידקים אם אתם מתכננים להסיר תאים מהצלחת לניסוי.בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות להדמיית תאים חיים, מיקרוסקופיה ברזולוציית-על או סוגים אחרים של מיקרוסקופיה כדי לענות על שאלות נוספות על לוקליזציה תת-תאית ודינמיקה של חלבונים דנדריטיים של תאים ומאקרופאגים מעניינים. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האימונולוגיה לחקור את ההפצה ואת היחסים המ spacial של חלבונים לידי ביטוי מקרופאגים ותאים דנדריטיים ולקדם את ההבנה שלנו של הפונקציה של חלבון אלה במהלך התגובות החיסונית. אל תשכח כי עבודה עם חלקיקים ויראליים יכול להיות מסוכן מאוד, כי אמצעי זהירות, כגון מינימליזציה של ייצור תרסיס, לובש ציוד מגן, ושימוש ברדס זרימה למינארית, תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

התרבות של תאים דנדריטים מיאלואידית מ מבשרי מח עצם

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

הדור של מח עצם נגזר תאים דנדריטים Murine לשימוש 2-פוטון הדמיה

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

תיוג פלורסנט של COS-7-SNAP הבעת תג חלבונים Fusion עבור דימות תא חי

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

שימוש מונה תא אוטומטי כדי לפשט את הביטוי מחקרים ג&#39;ין: siRNA מציאה הביטוי IL 4-Gene תלויים תאים Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Photoconversion של חלבונים מטוהרים פלורסנט ו Dual-בדיקה אופטי סימון בתאים חיים

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

פפטידים מהספרייה תצוגה phage לווסת את ביטוי הגנים בתאים mesenchymal ו להגביר Osteogenesis ב פגמים עצם Unicortical

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...