Name: expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow-derived dendritic cells and macrophages
Uploaded: 2018-10-30T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages at JoVE.com

이 작품으로 체코 과학 재단 (GACR) (프로젝트 번호 16-07425S)에 의해 찰스 대학 부여 기관 (GAUK) (프로젝트 번호 923116) 및 기관 자금에서 연구소의 분자 유전학, 체코의 과학 아카데미에 의해 지원 되었다 공화국 (RVO 68378050)입니다.

여기에 설명 된 모든 방법은 복지의 실험 동물에 분자 유전학 연구소의 전문가 위원회에 의해 및 체코 공화국의 과학 아카데미에 의해 승인 되었습니다가지고.
1. 시 약 준비
<ol><li>염화 염화 칼륨 (ACK) 버퍼를 준비 합니다. DdH2O의 500 mL를 NH4Cl의 4.145 g 및 0.5 g KHCO3 를 추가 다음 0.5 M ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 100 µ L을 추가 하 고 필터를 소독.</li>
	<li>P...

<ol>
	<li>Moghaddam, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity,+polarization+and+function+in+health+and+disease.">Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease.</a> Journal of Cellular Physiology. , (2018).</li><li>Qian, C., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+the+regulation+of+immunity+and+inflammation.">Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation.</a> Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).</li><li>Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function:+from+mechanisms+to+disease.">Neutrophil function: from mechanisms to disease.</a> Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).</li><li>Kondo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+and+myeloid+lineage+commitment+in+multipotent+hematopoietic+progenitors.">Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors.</a> Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).</li><li>Andrews, T., Sullivan, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+in+patients+with+inherited+defects+in+phagocytic+function.">Infections in patients with inherited defects in phagocytic function.</a> Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).</li><li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+biology+in+development,+homeostasis+and+disease.">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li><li>Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+factor+in+L-cell+conditioned+medium+capable+of+stimulating+colony+formation+by+mouse+marrow+cells+in+culture.">Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture.</a> Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).</li><li>Scheicher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+GM-CSF+induces+in+vitro+differentiation+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow.">Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).</li><li>Stanley, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+colony-stimulating+factor,+CSF-1.">The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1.</a> Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).</li><li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow.">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).</li><li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor.">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li><li>Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+non-equivalence+of+murine+(monocyte-)+macrophage+cells+in+biomaterial+and+inflammatory+models.">Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).</li><li>Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein:+a+perspective.">Green fluorescent protein: a perspective.</a> Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+In+Vivo+Imaging+Using+Fluorescent+Proteins.">Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).</li><li>Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+fluorescent+proteins.">Flow cytometry of fluorescent proteins.</a> Methods. 57 (3), 318-330 (2012).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+exogenous+genes+in+macrophages:+obstacles+and+opportunities.">The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities.</a> Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).</li><li>Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tolerance+induction+in+major+histocompatibility+complex+class+II-restricted+T+cells+specific+for+a+blood-borne+self-antigen.">Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen.</a> Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).</li><li>Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Characterization+of+the+New+Osteoclast+Progenitor+with+Macrophage+Phenotypes+Being+Able+to+Differentiate+into+Mature+Osteoclasts.">Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).</li><li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pCL+vector+system:+rapid+production+of+helper-free,+high-titer,+recombinant+retroviruses.">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).</li><li>Janssen, E., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptor+proteins+in+lymphocyte+activation.">Adaptor proteins in lymphocyte activation.</a> Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).</li><li>Ferguson, P. J., Laxer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+discoveries+in+CRMO:+IL-1beta,+the+neutrophil,+and+the+microbiome+implicated+in+disease+pathogenesis+in+Pstpip2-deficient+mice.">New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).</li><li>Holleman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+outcome+predictor+in+acute+leukemia+1+(OPAL1)+gene+is+not+an+independent+prognostic+factor+in+patients+treated+according+to+COALL+or+St+Jude+protocols.">Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols.</a> Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).</li><li>Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+Differentiation+of+Murine+Myeloid+Precursor+32D/G-CSF-R+Cells.">Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).</li><li>Kralova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transmembrane+Adaptor+Protein+SCIMP+Facilitates+Sustained+Dectin-1+Signaling+in+Dendritic+Cells.">The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).</li><li>Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960 (2014).</li><li>Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protocol+for+efficient+transfection+of+dendritic+cells+without+cell+maturation.">Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766 (2011).</li><li>Siegert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+siRNA+into+mouse+bone+marrow-derived+macrophages+and+dendritic+cells.">Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery:+Potential+Applications+for+Gene+and+Cell-Based+Therapies+in+the+New+Era+of+Personalized+Medicine.">Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine.</a> Genes &amp; Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li><li>Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+progress+in+gene+delivery+technology+based+on+chemical+methods+and+nano-carriers.">Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers.</a> Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).</li><li>Muruve, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome+recognizes+cytosolic+microbial+and+host+DNA+and+triggers+an+innate+immune+response.">The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response.</a> Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).</li><li>Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+humoral+immune+responses+to+viral+antigens+create+barriers+to+lung-directed+gene+therapy+with+recombinant+adenoviruses.">Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses.</a> Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).</li><li>Tallone, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+adenovirus+gene+delivery.">A mouse model for adenovirus gene delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).</li><li>Milone, M. C., O'Doherty, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+use+of+lentiviral+vectors.">Clinical use of lentiviral vectors.</a> Leukemia. , (2018).</li><li>McTaggart, S., Al-Rubeai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+vectors+for+human+gene+delivery.">Retroviral vectors for human gene delivery.</a> Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transience+of+transient+overexpression.">The transience of transient overexpression.</a> Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).</li></ol>

대상 셀에 관심사의 단백질의 표정은 다양 한 생물 학적 연구에에서 중요 한 단계. 차별화 된 대 식 세포와 수지상 세포는 표준 transfection retroviral 변환 기법에 의해 transfect 어렵다. 이러한 소성 cDNAs의 식을 수 있도록 중요 한 단계는 골 수 창시자, 그들은 이미 원하는 구문을 수행할 때 차별화 뒤 retroviral 변환으로 이러한 차별화 된 세포의 transfection를 무시 셀 유형입니다. 이 방법의 성공적인 사용?...

골수성 세포는 병원 체에 대 한 우리의 방어 메커니즘의 필수적인 부분을 나타냅니다. 그들은 죽어가는 세포 뿐 아니라 미생물, 빠르게 제거 수 있습니다. 또한, 그들은 또한 관련 규제 조직 개발 및 수리 및 항상성1,2,3를 유지. 모든 골수성 세포는 골 수에서 일반적인 골수성 창시자에서 차별화. 많은 기능 및 형태학 상으로 가지 하위 집합으로 그들의 차별화는 cytokines와 그들의 다양 한 조합4제어 대부분입니다. 가장 집중적으로 공부 골수성 세포 하위 집합 neutrophilic granulocytes, 대 식 세포와 수지상 세포를 포함합니다. 이러한 인구 중 결함 잠재적으로 생명을 위협 문제 원인의 인간과 쥐,12,3,5, 의 면역 체계의 심각한 장애를 일으킬 6.
Neutrophilic granulocytes, 달리 수지상 세포와 대 식 세포는 조직 거주 세포 그리고 면역 기관에 그들의 풍부는 상대적으로 낮은. 그 결과, 분리와 기본 수지상 세포와이 세포의 많은 수를 요구 하는 실험에 대 한 세포의 정화 이며 비싼 종종 불가능. 이 문제를 해결 하려면 프로토콜 동종 대 식 세포 나 수지상 세포 생체 외의 다량을 얻기 위해 개발 되었습니다. Cytokines의 존재 murine 골 수 세포의 분화를 기반으로하는 이러한 접근: 대 식 세포 그리고 granulocyte-대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF) 또는 Flt3 리간드에 대 한 대 식 세포 콜로 니 자극 요소 (M-CSF) 수지상 세포7,8,9,10,,1112. 이 메서드에 의해 생성 된 셀 일반적으로 문학에서 골 수 유래 세포 (BMDMs) 및 골 수 유래 수지상 세포 (BMDCs)으로 설명 합니다. 그들은 주 대 식 세포 또는 해당 셀 라인 보다 수지상 세포와 더 많은 생리 적 속성을 있다. 또 다른 주요 장점은 유전자 이러한 세포 형태를 얻기의 가능성 수정 마우스13입니다. 야생-타입 셀 간의 비교 연구 하 고 유전자 변형된 생쥐에서 파생 된 세포는 유전자의 잠복 소설 기능 또는 관심사의 단백질에 대 한 중요 한.
살아있는 세포에 있는 단백질의 subcellular 지 방화의 분석 vivo에서관심사의 단백질에 형광 라벨의 결합을 필요합니다. 이것은 가장 일반적으로 유전자 인코딩된 퓨전 구문 형광 단백질을 (종종 짧은 링커)을 통해 결합 하는 분석 된 단백질의 구성으로 표현 하 여 달성 (예., 녹색 형광 단백질 (GFP))14,15 , 16. 수지상 세포 나 대 식 세포에 붙일 태그가 단백질의 식을 도전 이다. 이 세포는 일반적으로 표준 transfection 절차에 의해 transfect 어렵다 고 효율성 매우 낮은 경향이. 또한,는 transfection는 일시적, 그것은 세포 스트레스를 생성 하 고 달성된 강도의 형광 현미경 검사 법17에 대 한 충분 한 되지 않을 수도 있습니다. Transgene 식 retroviral 골 조상 세포의 감염의 충분 한 수준으로 이러한 셀의 합리적인 부분을 얻기 위해 벡터와 BMDMs 또는 BMDCs에 그들의 후속 차별화 되고있다 매우 효율적 접근입니다. 그것은 그들의 원래 세포 환경 안정 된 상태에서 또는 먹어서, 면역학 시 냅 스 형성 또는 마이그레이션 같은 면역 반응에 대 한 중요 한 프로세스 동안 골수성 근원의 단백질의 분석에 대 한 허용 했다. 여기, 우리 파생 murine 골 수 세포와 수지상 세포에 붙일 태그가 단백질의 안정적인 식 수 있는 프로토콜을 설명 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>15028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>10270</td>
			<td>For media suplementation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Lachema, Brno, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>BB Pharma AS, Prague, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PENICILIN G 1,0 DRASELN&#193; SOL&#39; BIOTIKA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>S9137</td>
			<td>Streptomycin sulfate salt powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Dr. Kulich Pharma, Hradec Kr&#225;lov&#233;, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, linear, MW 25,000</td>
			<td>Polyscience, Warrington, PA, USA</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>101212</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>123110</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>117310</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)</td>
			<td>315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>H1398</td>
			<td>flow cytometry analysis use at 1-2 &#181;g/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow-derived dendritic cells and macrophages

수지상 세포와 대 식 세포는 병원 체에 대 한 방어의 첫 번째 라인을 형성 하는 중요 한 세포 이다. 그들은 또한 적합 한 면역 반응의 개시에 중요 한 역할을 재생합니다. 이러한 세포와 실험 작업은 오히려 도전적 이다. 그들의 풍부한 장기와 조직에 상대적으로 낮습니다. 결과적으로, 그들은 큰 숫자에서 고립 될 수 없습니다. 그들은 또한 transfect cDNA 구문으로 어렵다입니다. Murine 모델에서 이러한 문제는 골 수 세포에 대 한 M-CSF 또는 수지상 세포에 대 한 GM-CSF의 창시자에서 생체 외에서 분화에 의해 부분적으로 극복할 수 있습니다. 이 방법에서는, 아주 몇몇 동물에서 이러한 셀의 대용량을 얻을 수입니다. 또한, 골 창시자 retroviral 벡터 들고 이전에 파생 하는 골 수 수지상 세포와 대 식 세포로의 분화 재배의 초기 단계 동안에 cDNA 구문으로 불리고 있습니다. 따라서, 이러한 셀에 다양 한 cDNA 구문 표현 하 retroviral 변환 뒤에 체 외에서 분화를 사용할 수 있습니다. 라이브 셀 이미징 형광 단백질, 탠덤 담긴 위하여 분석, 구조-기능 분석, 대 한의 포함 하 여 이러한 셀에 수행할 수 있는 실험의 범위를 확장 하는 실질적으로 소성 단백질을 표현 하는 능력 모니터링 바이오 센서와 다른 많은 세포질 기능. 이 문서에서는, 우리 붙일 태그가 단백질 코딩 벡터와 retroviral 변환 파생 murine 골 수 수지상 세포와 대 식 세포에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 두 어댑터 단백질, OPAL1 및 PSTPIP2, 예를에 우리 cytometry에 현미경의 실용적인 응용 프로그램을 보여 줍니다. 우리는 또한 장점 및이 방법의 한계를 설명.

신호 어댑터 단백질은 어떤 효소 활동 없이 일반적으로 작은 단백질. 그들은 다양 한 상호 도메인을 소유 또는21tyrosine kinases, 가수분해, 유비퀴틴 ligases 등 신호 변환에 관련 된 주제, 다른 단백질 바인딩 중재. 이 프로토콜의 기능의 데모에 대 한 PSTPIP2 및 OPAL1 골수성 세포 어댑터 선정 됐다. PSTPIP2 잘 특징이 단백질 염증 반응을22의 규칙?...

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Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Murine 골 수 유래 수지상 세포와 대 식 세포에 형광 성 융해 단백질의 표정

이 문서에서는, 우리는 murine 골에 형광 성 융해 단백질의 표정에 대 한 자세한 프로토콜 파생 수지상 세포와 대 식 세포 제공 합니다. 메서드를 기반으로 골 수의 변환에 창시자 retroviral 구문 뒤에 대 식 세포로 분화 및 수지상 세포 생체 외에서.

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

이 방법은 이러한 세포 유형에 있는 각종 단백질의 세포 소소화 및 역학에 관하여 대식세포 및 수지상 세포 생물학의 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 비교적 간단하고 저렴하며 사용 가능한 대부분의 다른 방법보다 표현의 효율성과 안정성을 입증한다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원 생 인 Jarmila Kralova가 될 것입니다.레트로바이러스를 생산하기 위해, 10센티미터 페트리 접시에 플래티넘 에코 패키징 세포의 단일 세포 현탁액을 플레이트와 DMEM의 15 밀리리터에서 세포를 육성하고, 배양이 50 내지 60%의 컨실루물이 될 때까지 10%의 태아 소 혈청 또는 FBS로 보충한다. 다음 날, 관심의 레트로 바이러스 구조의 20 마이크로 그램과 부드러운 혼합과 함께 세럼없이 DMEM의 1 밀리리터에 PCL 에코 패키징 벡터의 10 마이크로 그램을 추가합니다. 실온에서 5분 동안 두 번째 튜브에 세럼과 항생제없이 DMEM의 1 밀리리터에 75 마이크로리터의 PEI를 추가하고 실온에서 추가로 10 분 배양을 위해 두 튜브의 내용을 혼합합니다.다음으로, 플래티넘 에코 셀의 배지를 2%의 FBS로 보충한 신선한 섭씨 37도의 8밀리리터로 조심스럽게 교체하고, 플레이트에 낙하하여 경질 혼합물을 조심스럽게 첨가한다. 섭씨 37도에서 4시간 배양 후, 수퍼네티드를 섭씨 37도의 10밀리리터로 대체하고, 섭씨 37도에서 24시간 배양시 10%의 FBS를 보충합니다. 다음 날, 5 밀리리터 파이펫을 사용하여 에코트로픽 레트로바이러스 입자 함유 슈퍼나텐트를 15밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 원심분리에 의한 이물질을 제거하고 세포를 포함한다.한편, 섭씨 37도의 밀리리터 10밀리리터와 10%의 FBS를 문화 요리에 추가하여 섭씨 37도에서 24시간 배양을 더하고, 방금 입증된 바와 같이 두 번째 바이러스 성 입자를 수집합니다. 골수를 수확하려면 조직 배양 후드에서 핀셋과 가위를 사용하여 뒷다리에서 근육의 피부와 부분을 제거하고 대퇴골을 깨지 않고 엉덩이 관절에서 아세타부를 조심스럽게 제거하십시오. 발목 관절에서 발을 자르고 뼈를 70 %에탄올로 스프레이하십시오.그런 다음 종이 타월로 근육의 나머지 부분을 제거하고 2 % FBS로 보충 된 PBS의 5 센티미터 페트리 접시에 뼈를 놓습니다. 다음으로 각 뼈 세트의 무릎 관절을 구부리고 뼈를 가위로 조심스럽게 분리합니다. 가위를 사용하여 한 뼈의 각 표피의 약 1 ~2 밀리미터를 제거하고 신선한 PBS 플러스 FBS가장착 된 2 개 또는 5 밀리리터 주사기를 사용하여 뼈의 양쪽 끝에서 골수를 15 밀리리터 원심분리기로 플러시하십시오.골수가 각 뼈로부터 수집되었을 때, 원심분리에 의해 뼈 세포를 펠릿과 실온에서 2~3분 동안 적혈구 용해 버퍼의 2.5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 용해 후, 새로운 15 밀리리터 원심 분리기 튜브로 100 마이크로 미터 세포 여과기를 통해 세포를 필터링하고 PBS 플러스 FBS의 12 밀리리터와 끈기를 복원합니다. DMEM에서 펠릿을 다시 중단, 계산 및 10 센티미터에서 여섯 번째 골수 세포에 5 ~ 10 배 10 배 10 배, 비 조직 배양 처리 페트리 접시에 10 혈청 및 대식세포 식민지 자극 계수, 또는 MCSF에 펠릿을 다시 중단.문화의 5 일째에, 조심스럽게 세포 배양 접시를 기울이고 접시의 가장자리 근처 표면에서 매체의 약 5 밀리리터를 제외한 모든 제거. 그런 다음 FBS 및 MCSF로 보충된 신선한 섭씨 37도 의 20 밀리리터를 접시에 추가하고 세포를 세포 배양 인큐베이터로 되돌려 보입니다. 세포를 수확하려면 6~7일째에 모든 배지 및 부동 세포를 제거하고 37도 의 PBS로 배양을 세척한다.조직 배양인인큐베이터에서 섭씨 37도에서 3~5분간 5밀리리터와 PBS의 5밀리리터를 부착하고 5밀리리터 파이펫을 사용하여 플레이트 바닥에서 분리된 세포를 부드럽게 플러시합니다. 그런 다음 신선한 PBS의 25 밀리리터를 포함하는 50 밀리리터 원심분리기 튜브로 세포를 전송합니다. 골수 유래 항원 제시 세포에서 EGFP 태그 단백질 발현을 유도하기 위해, 세포 분화 프로토콜의 시작 부분에서, 골수 세포를 DMEM 플러스 FBS 및 항생제 의 밀리리터 당 6세포당 2~5배 10배로 희석시키고, 적절한 상이한 사이토킨으로 보충하였다.세포 배양 인큐베이터에서 4~6시간 후, 폴리브레인으로 보충된 수집된 바이러스의 첫 번째 라운드의 밀리리터 2개를 추가하고 세포 배양배기에서 원심분리및 4시간 배양에 의해 세포 배양을 트랜스듀스한다. 전이 기간이 끝나면, 각 웰에서 비부착 세포를 개별 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 원심분리에 의해 세포를 수집한다. 세포의 더 큰 양이 필요한 경우, 세포는 여러 우물에서 동일한 단점으로 감염될 수 있으며 분화 전에 풀로 만들 수 있습니다.그런 다음 적절한 분화 사이토카인으로 보충된 배양 배지의 10밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 튜브당 10센티미터 비조직 배양처리페트리 접시에 세포를 플레이트, 6~8일 배양에 대해 단지 입증하였다. 슈퍼네이트를 함유한 제2 바이러스의 수집 후 혈류 세포측정에 의한 플래티넘 에코 경화의 효능에 대한 평가는 PSTPIP2-EGFP의 평균 회전 효율이 62%, OPAL1-EGFP의 경우 53%의 평균 경전 효율을 나타낸다. 레트로바이러스 트랜스듀션은 두 배양에서 세포의 90% 이상을 가진 골수 유래 세포의 분화 상태에 영향을 미치지 않으며, 둘 중 어느 바이러스와도 의전후 각각의 마커에 대한 양성을 입증한다.그리고 분화 된 세포의 두 가지 유형에 대해 관찰 된 적절한 특성 형태학적 변화가 있습니다. 참고, EGFP의 전반적인 발현은 레트로바이러스의 종류에 관계없이 골수 유래 수지상 세포 배양에서 하부되었다. 이 절차를 시도하는 동안, 실험을 위해 접시에서 세포를 제거하려는 경우 일반적으로 박테리아를 재배하는 데 사용되는 비 조직, 문화 치료 플라스틱 요리를 사용하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라, 다른 방법은 세포 이미징, 슈퍼 해상도 현미경 검사또는 현미경 검사법의 다른 유형은 수지상 세포 및 관심의 세포 단백질의 세포 소세포 국소화 및 역학에 대한 추가 질문에 대답하기 위해 사용될 수있다. 이 기술은 대식세포와 수지상 세포에 의해 표현된 단백질의 분포 그리고 간격 관계를 탐구하고 면역 반응 도중 이 단백질의 기능에 대한 우리의 이해를 발전시키기에서 면역학 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다. 바이러스 성 입자와 함께 작업하는 것은 매우 위험 할 수 있으며 에어로졸 생성을 최소화하고 보호 장비를 착용하고 라미나르 유동 후드를 사용하는 것과 같은 예방 조치는 항상이 절차를 수행하는 동안 취해야한다는 것을 잊지 마십시오.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

골수 엽 성의 전구 물질에서 골수양 돌기 세포의 문화

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

연구

생물학

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

골수의 생성은 2 광자 영상에서 사용하기 위해 Murine 돌기 세포를 유래

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

COS - 7 형광 라벨링는 라이브 셀 이미징에 대한 SNAP - 태그 퓨전 단백질 표현

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

유전자 발현 연구를 단순화하는 자동 셀 카운터를 사용하여 : Namalwa 셀에서 IL - 4 종속 유전자 발현의 siRNA의 최저

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

라이브 세포에 형광 단백질과 듀얼 프로브 광학 하이라이트 기능을 정화의 Photoconversion

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

파지 디스플레이 도서관에서 펩티드는 Mesenchymal 세포의 유전자 발현을 조절하고 Unicortical 뼈 결함에 Osteogenesis을 힘을 주다

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...