Name: expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow-derived dendritic cells and macrophages
Uploaded: 2018-10-30T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tsjekkiske Science Foundation (GACR) (prosjektnummer 16-07425S), av Charles University Grant Agency (GAUK) (prosjektnummeret 923116) og av institusjonelle finansiering fra Institutt for molekylær genetikk, Academy of Sciences i tsjekkiske Republikken (RVO 68378050).

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av ekspert komiteen for velferd av forsøksdyr av Institutt for molekylær genetikk og Academy of Sciences i Tsjekkia.
1. forberedelse av reagenser
<ol><li>Forberede ammonium-klor-kalium (ACK) bufferen. Legge til 4.145 g NH4Cl og 0,5 g KHCO3 500 mL ddH2O, og legge til 100 µL av 0,5 M ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) og filter-sterilisere.</li>
	<li>Forberede polyethylenimine (PEI) løsning. Legge til 0,1 g...

<ol>
	<li>Moghaddam, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity,+polarization+and+function+in+health+and+disease.">Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease.</a> Journal of Cellular Physiology. , (2018).</li><li>Qian, C., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+the+regulation+of+immunity+and+inflammation.">Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation.</a> Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).</li><li>Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function:+from+mechanisms+to+disease.">Neutrophil function: from mechanisms to disease.</a> Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).</li><li>Kondo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+and+myeloid+lineage+commitment+in+multipotent+hematopoietic+progenitors.">Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors.</a> Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).</li><li>Andrews, T., Sullivan, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+in+patients+with+inherited+defects+in+phagocytic+function.">Infections in patients with inherited defects in phagocytic function.</a> Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).</li><li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+biology+in+development,+homeostasis+and+disease.">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li><li>Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+factor+in+L-cell+conditioned+medium+capable+of+stimulating+colony+formation+by+mouse+marrow+cells+in+culture.">Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture.</a> Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).</li><li>Scheicher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+GM-CSF+induces+in+vitro+differentiation+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow.">Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).</li><li>Stanley, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+colony-stimulating+factor,+CSF-1.">The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1.</a> Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).</li><li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow.">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).</li><li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor.">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li><li>Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+non-equivalence+of+murine+(monocyte-)+macrophage+cells+in+biomaterial+and+inflammatory+models.">Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).</li><li>Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein:+a+perspective.">Green fluorescent protein: a perspective.</a> Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+In+Vivo+Imaging+Using+Fluorescent+Proteins.">Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).</li><li>Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+fluorescent+proteins.">Flow cytometry of fluorescent proteins.</a> Methods. 57 (3), 318-330 (2012).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+exogenous+genes+in+macrophages:+obstacles+and+opportunities.">The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities.</a> Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).</li><li>Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tolerance+induction+in+major+histocompatibility+complex+class+II-restricted+T+cells+specific+for+a+blood-borne+self-antigen.">Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen.</a> Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).</li><li>Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Characterization+of+the+New+Osteoclast+Progenitor+with+Macrophage+Phenotypes+Being+Able+to+Differentiate+into+Mature+Osteoclasts.">Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).</li><li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pCL+vector+system:+rapid+production+of+helper-free,+high-titer,+recombinant+retroviruses.">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).</li><li>Janssen, E., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptor+proteins+in+lymphocyte+activation.">Adaptor proteins in lymphocyte activation.</a> Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).</li><li>Ferguson, P. J., Laxer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+discoveries+in+CRMO:+IL-1beta,+the+neutrophil,+and+the+microbiome+implicated+in+disease+pathogenesis+in+Pstpip2-deficient+mice.">New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).</li><li>Holleman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+outcome+predictor+in+acute+leukemia+1+(OPAL1)+gene+is+not+an+independent+prognostic+factor+in+patients+treated+according+to+COALL+or+St+Jude+protocols.">Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols.</a> Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).</li><li>Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+Differentiation+of+Murine+Myeloid+Precursor+32D/G-CSF-R+Cells.">Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).</li><li>Kralova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transmembrane+Adaptor+Protein+SCIMP+Facilitates+Sustained+Dectin-1+Signaling+in+Dendritic+Cells.">The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).</li><li>Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960 (2014).</li><li>Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protocol+for+efficient+transfection+of+dendritic+cells+without+cell+maturation.">Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766 (2011).</li><li>Siegert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+siRNA+into+mouse+bone+marrow-derived+macrophages+and+dendritic+cells.">Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery:+Potential+Applications+for+Gene+and+Cell-Based+Therapies+in+the+New+Era+of+Personalized+Medicine.">Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine.</a> Genes &amp; Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li><li>Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+progress+in+gene+delivery+technology+based+on+chemical+methods+and+nano-carriers.">Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers.</a> Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).</li><li>Muruve, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome+recognizes+cytosolic+microbial+and+host+DNA+and+triggers+an+innate+immune+response.">The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response.</a> Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).</li><li>Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+humoral+immune+responses+to+viral+antigens+create+barriers+to+lung-directed+gene+therapy+with+recombinant+adenoviruses.">Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses.</a> Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).</li><li>Tallone, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+adenovirus+gene+delivery.">A mouse model for adenovirus gene delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).</li><li>Milone, M. C., O'Doherty, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+use+of+lentiviral+vectors.">Clinical use of lentiviral vectors.</a> Leukemia. , (2018).</li><li>McTaggart, S., Al-Rubeai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+vectors+for+human+gene+delivery.">Retroviral vectors for human gene delivery.</a> Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transience+of+transient+overexpression.">The transience of transient overexpression.</a> Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).</li></ol>

Uttrykket protein interesse for målcellene er et viktig skritt i mange typer biologiske studier. Differensiert makrofager og dendrittiske celler er vanskelig å transfect av standard transfection og retroviral signaltransduksjon teknikker. Omgåelsen transfection av disse differensierte celler med retroviral signaltransduksjon av benmarg progenitors, etterfulgt av differensiering når de allerede bærer den ønskede konstruksjonen er et kritisk steg gir uttrykk for ektopisk cDNAs i disse celletyper. Et eksempel på vell...

Myeloide celler representerer en uunnværlig del av våre forsvarsmekanismer mot patogener. De kan raskt eliminere mikrober, samt døende celler. Dessuten, er de også involvert i å regulere vev utvikling og reparasjon og opprettholde homeostase1,2,3. Alle myeloide celler skille fra vanlige myelogen progenitors i beinmargen. Deres differensiering inn mange funksjonelt og morphologically forskjellige undergrupper er i stor grad kontrollert av cytokiner og deres ulike kombinasjoner4. De mest intensivt studerte myelogen celle undergrupper inkluderer neutrophilic granulocytter, makrofager og dendrittiske celler. Feil i noen av disse befolkningene føre til potensielt livstruende konsekvenser og forårsake alvorlige dysfunksjoner av immunsystemet hos mennesker og mus1,2,3,5, 6.
I motsetning til neutrophilic granulocytter, dendrittiske celler og makrofager vev bosatt celler og sin overflod i immun organer er relativt lav. Som et resultat, er isolasjon og rensing av primære dendrittiske celler og makrofager for eksperimenter krever et stort antall av disse cellene dyrt og ofte umulig. For å løse dette problemet, er protokollene utviklet for å få store mengder homogen makrofager eller dendrittiske celler i vitro. Disse metodene er avhengig av differensieringen murine beinmargen celleområde i nærvær av cytokiner: macrophage koloni-stimulerende faktor (M-CSF) for makrofager og granulocytt-macrophage koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) eller Flt3 ligand for dendrittiske celler7,8,9,10,11,12. Celler generert av denne metoden er ofte beskrevet i litteraturen som benmarg avledet makrofager (BMDMs) og benmarg avledet dendrittiske celler (BMDCs). De har mer fysiologiske egenskaper til felles med primære makrofager eller dendrittiske celler enn med tilsvarende linjer. En annen stor fordel er muligheten for å få disse cellene danner genetisk endret mus13. Komparative studier mellom vill-type celler og celler avledet fra genmodifiserte mus er ofte avgjørende for avdekke romanen funksjoner av gener eller proteiner av interesse.
Analyse av subcellular lokalisering av proteiner i levende celler krever koblingen av en fluorescerende etikett til protein av interesse i vivo. Dette oppnås vanligvis ved å uttrykke genetisk kodet fusion konstruere består av en analysert protein kombinert (ofte via en kort linker) til et fluorescerende protein (f.eks., grønn fluorescerende protein (GFP))14,15 , 16. uttrykk for fluorescently merket proteiner i dendrittiske celler og makrofager er utfordrende. Disse cellene er generelt vanskelig å transfect standard hva prosedyrer og effektiviteten pleier å være svært lav. Videre til hva er forbigående, den genererer mobilnettet stress og oppnådd intensiteten av fluorescens kanskje ikke tilstrekkelig for mikroskopi17. For å oppnå en rimelig andel av disse cellene med et tilstrekkelig nivå av transgene uttrykk, infeksjon av benmarg progenitor celler med retroviral har vektorer og deres påfølgende differensiering inn BMDMs eller BMDCs blitt en svært effektiv tilnærming. Det lov for analyse av proteiner myelogen opprinnelse i deres eget mobilnettet miljø, både stabilt eller i prosesser som er kritiske for immunforsvaret som fagocytose, immunologiske synapse formasjon eller overføring. Her beskriver vi en protokoll som tillater stabil uttrykk for fluorescently merket proteiner av interesse i murine benmarg avledet makrofager og dendrittiske celler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>15028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>10270</td>
			<td>For media suplementation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Lachema, Brno, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>BB Pharma AS, Prague, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PENICILIN G 1,0 DRASELN&#193; SOL&#39; BIOTIKA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>S9137</td>
			<td>Streptomycin sulfate salt powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Dr. Kulich Pharma, Hradec Kr&#225;lov&#233;, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, linear, MW 25,000</td>
			<td>Polyscience, Warrington, PA, USA</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>101212</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>123110</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>117310</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)</td>
			<td>315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>H1398</td>
			<td>flow cytometry analysis use at 1-2 &#181;g/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow-derived dendritic cells and macrophages

Dendrittiske celler og makrofager er avgjørende celler som danner den første linjen i forsvaret mot patogener. De kan også spille viktige roller i initiering av en adaptiv immunrespons. Eksperimentelt arbeid med disse cellene er ganske utfordrende. Sin overflod i organer og vev er relativt lav. Som et resultat kan ikke de bli isolert i stort antall. De er også vanskelig å transfect med cDNA konstruksjoner. I murine modellen, kan disse problemene være delvis overvunnet av i vitro differensiering fra benmargen progenitors i nærvær av M-CSF for makrofager eller GM-CSF for dendrittiske celler. På denne måten er det mulig å få store mengder av disse cellene fra svært få dyr. Videre kan benmarg progenitors være transduced med retroviral vektorer bærer cDNA konstruksjoner i tidlige stadier av dyrking før deres differensiering inn benmarg avledet dendrittiske celler og makrofager. Dermed kan retroviral signaltransduksjon etterfulgt av differensiering i vitro brukes til å uttrykke ulike cDNA konstruksjoner i disse cellene. Muligheten til å uttrykke ektopisk proteiner betydelig utvider utvalget av eksperimenter som kan utføres på disse cellene, inkludert levende celle imaging fluorescerende proteiner, tandem renselser for interactome analyser, struktur-funksjon analyser, overvåking av cellulære funksjoner med biosensors og mange andre. I denne artikkelen beskriver vi en detaljert protokoll for retroviral signaltransduksjon murine benmarg avledet dendrittiske celler og makrofager med vektorer koding for fluorescently-merket proteiner. På eksempel på to adapter proteiner, OPAL1 og PSTPIP2, viser vi den praktiske anvendelsen i flowcytometri og mikroskopi. Vi diskuterer også fordeler og begrensninger av denne tilnærmingen.

Signalnettverk adapter proteiner er vanligvis små proteiner uten noen enzymatisk aktivitet. De har ulike samspill domener eller motiver, som megle binding til andre proteiner involvert i signaltransduksjon, inkludert tyrosin kinaser, phosphatases, ubiquitin ligases og andre21. Demonstrasjon av funksjonaliteten til denne protokollen ble myelogen celle adaptere PSTPIP2 og OPAL1 valgt. PSTPIP2 er også preget protein er involvert i regulering av betennelsesreaksjon<s...

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages at JoVE.com

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Uttrykk for fluorescerende Fusion proteiner i Murine Ben margtransplantasjon-avledet dendrittiske celler og makrofager

I denne artikkelen gir vi en detaljert protokoll for uttrykket av fluorescerende fusion proteiner i murine benmarg avledet dendrittiske celler og makrofager. Metoden er basert på signaltransduksjon av benmarg progenitors med retroviral konstruksjoner etterfulgt av differensiering i makrofager og dendrittiske celler i vitro.

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen makrofag og dendrittisk cellebiologi om subcellulær lokalisering og dynamikken til ulike proteiner i disse celletypene. De viktigste fordelene med denne teknikken er at den er relativt enkel, billig, og viser en bedre effektivitet og stabilitet av uttrykk enn de fleste andre tilgjengelige metoder. Å demonstrere prosedyren vil være Jarmila Kralova, en gradstudent fra laboratoriet mitt.For å produsere retroviruset, plate en encellede suspensjon av Platinum Eco-emballasjeceller i en 10 centimeter petriskål og dyrke cellene i 15 milliliter av DMEM, supplert med 10% fosterbovin serum, eller FBS, til kulturen er 50 til 60% confluent. Neste dag, legge til 20 mikrogram av retroviral konstruksjon av interesse og 10 mikrogram PCL øko-emballasje vektor til 1 milliliter DMEM uten serum, med mild blanding. Tilsett 75 mikroliter PEI i 1 milliliter DMEM uten serum og antibiotika til et annet rør i fem minutters inkubasjon ved romtemperatur, og bland innholdet i begge rørene sammen for ytterligere 10 minutters inkubasjon ved romtemperatur.Deretter erstatter du forsiktig mediet på Platinum Eco-cellene med 8 milliliter frisk 37 grader Celsius DMEM supplert med 2% FBS og legger forsiktig transfection blandingen i dråper til platen. Etter en 4 timers inkubasjon ved 37 grader Celsius, erstatt supernatent med 10 milliliter på 37 grader Celsius DMEM, supplert med 10% FBS for en 24 timers inkubasjon ved 37 grader Celsius. Neste dag, bruk en 5 milliliter pipette for å overføre den økotropiske retrovirale partikkelholdige supernatent til en 15 milliliter sentrifuge rør og fjerne rusk og inneholder celler ved sentrifugering.I mellomtiden legger du til 10 milliliter på 37 grader Celsius DMEM pluss 10% FBS til kulturretten for ytterligere 24 timers inkubasjon ved 37 grader Celsius og samle en andre runde med virale partikler som nettopp demonstrert. For å høste benmargen, i en vevskulturhette, bruk pinsett og saks for å fjerne huden og en del av musklene fra baklemmer og forsiktig løsne acetabulum fra hofteleddet uten å bryte lårbenet. Klipp potene på ankelleddene og spray beinene med 70% etanol.Fjern deretter resten av muskelen med et papirhåndkle og legg beinene i en 5 centimeter petriskål av PBS supplert med 2% FBS. Deretter bøyer du kneleddet på hvert beinsett og forsiktig skille beinene med saks. Bruk saksen til å fjerne omtrent en til to millimeter av hver epifyse av ett bein og bruk en to eller fem milliliter sprøyte utstyrt med en 30 gauge nål lastet med fersk PBS pluss FBS for å skylle benmargen fra begge ender av benet inn i en 15 milliliter sentrifuge rør.Når margen er samlet inn fra hvert av beinene, pellet beincellene ved sentrifugering og re-suspendere pellet i 2,5 milliliter rødblodcellelysbuffer i to til tre minutter ved romtemperatur. Etter lysing filtrerer du cellene gjennom en 100 mikrometercellesil i et nytt 15 milliliter sentrifugerør og gjenoppretter fastheten med 12 milliliter PBS pluss FBS. Re-suspendere pellet i DMEM, supplert med 10% FBS og antibiotika for telling og plate fem til 10 ganger 10 til sjette benmargceller i en 10 centimeter, ikke-vev kultur behandlet petriskål i 10 milliliter DMEM supplert med serum og makrofag koloni stimulerende faktor, eller MCSF.På dag fem av kulturen, forsiktig vippe cellekultur parabolen og fjerne alle, men ca 5 milliliter av medium fra overflaten nær kanten av parabolen. Deretter legger du til 20 milliliter friskt 37 grader Celsius medium supplert med FBS og MCSF til parabolen og returnerer cellene til cellekulturinkubatoren. For å høste cellene, på dag seks til syv, fjern alle middels og flytende celler og vask kulturen med 37 grader Celsius PBS.Løsne de tilknyttede cellene med fem milliliter på 0,02% EDTA og PBS i tre til fem minutter ved 37 grader Celsius i vevkulturinkubatoren og bruk en fem milliliter pipette for å forsiktig skylle de dissosierte cellene fra platebunnen. Deretter overfører cellene til et 50 milliliter sentrifugerør som inneholder 25 milliliter frisk PBS. For å indusere EGFP tagget protein uttrykk i benmarg avledet antigen presentere celler, i begynnelsen av celle differensiering protokollen, fortynne benmargsceller til en to til fem ganger 10 til sjette celler per milliliter av DMEM pluss FBS og antibiotika conentration og plate cellene i en milliliter medium per brønn, supplert med riktig differensiering cytokin.Etter fire til seks timer i cellekulturinkubatoren, legg til to milliliter av den første runden av samlet virus supplert med polybrene og transdusere cellekulturene ved sentrifugering og en fire timers inkubasjon i cellekulturinkubatoren. På slutten av transduksjonsperioden overfører du de ikke-adelle cellene fra hver brønn til individuelle 15 milliliter sentrifugerør og samler cellene ved sentrifugering. Hvis større mengde celler er nødvendig, kan cellene bli smittet med samme constract i flere brønner og samlet før differensiering.Deretter re-suspendere pellets i 10 milliliter kultur medium supplert med riktig differensiering cytokin og plate cellene på en 10 centimeter ikke vev kultur behandlet petriskål per rør, for deres seks til åtte dagers kultur, som nettopp demonstrert. Evaluering av effekten av Platinum Eco transfection av flow cytometri etter innsamling av det andre viruset som inneholder supernatent avslører en gjennomsnittlig transfection effektivitet på 62%for PSTPIP2-EGFP og 53% for OPAL1-EGFP. Retroviral transduksjon påvirker ikke differensieringsstatusen til benmargen avledet celler med mer enn 90% av cellene i begge kulturer som viser positivitet for sine respektive markører etter transduksjon med begge virusene.Og med de riktige, karakteristiske morfologiske endringene observert for begge typer differensierte celler. Det generelle uttrykket for EGFP var i benmargavledet dendrittiske cellekulturer sammenlignet med benmargsavledet makrofag EGFP-uttrykk, uavhengig av type retrovirus. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å bruke ikke-vev, kulturbehandlet plast retter som vanligvis brukes til å dyrke bakterier hvis du planlegger å fjerne celler fra parabolen for eksperiment.Etter denne prosedyren kan andre metoder levende celleavbildning, superoppløsningsmikroskopi eller andre typer mikroskopi brukes til å svare på flere spørsmål om subcellulær lokalisering og dynamikken i dendrittiske celle- og makrofagproteiner av interesse. Denne teknikken banet vei for forskere i immunologifeltet i å utforske fordelingen og spacial relasjoner av proteiner uttrykt av makrofager og dendrittiske celler og i å fremme vår forståelse av funksjonen til disse proteinene under immunrespons. Ikke glem at arbeid med viruspartikler kan være ekstremt farlig, og at forholdsregler, for eksempel minimalisering av aerosolgenerering, bruk av verneutstyr og bruk av en laminær strømningshette, alltid bør tas mens du utfører denne prosedyren.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grønn Fluorescent Protein-baserte Expression Screening av membran proteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...