Name: expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow-derived dendritic cells and macrophages
Uploaded: 2018-10-30T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pela Checa Science Foundation (GACR) (número do projeto 16-07425S), por Charles University Grant agência (SAUNG) (número do projeto 923116) e pelo financiamento institucional do Instituto de Genética Molecular, Academia de Ciências da República Checa República (RVO 68378050).

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comité de peritos sobre o bem-estar de animais experimentais do Instituto de Genética Molecular e pela Academia de Ciências da República Checa.
1. preparação do reagente
<ol><li>Prepare o tampão de amônio-cloreto-potássio (ACK). Adicionar 4,145 g de NH4Cl e 0,5 g de KHCO3 a 500 mL de DDQ2O, em seguida, adicionar 100 µ l de 0,5 M o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e filtro-esterilizar.</li...

<ol>
	<li>Moghaddam, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity,+polarization+and+function+in+health+and+disease.">Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease.</a> Journal of Cellular Physiology. , (2018).</li><li>Qian, C., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+the+regulation+of+immunity+and+inflammation.">Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation.</a> Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).</li><li>Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function:+from+mechanisms+to+disease.">Neutrophil function: from mechanisms to disease.</a> Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).</li><li>Kondo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+and+myeloid+lineage+commitment+in+multipotent+hematopoietic+progenitors.">Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors.</a> Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).</li><li>Andrews, T., Sullivan, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+in+patients+with+inherited+defects+in+phagocytic+function.">Infections in patients with inherited defects in phagocytic function.</a> Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).</li><li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+biology+in+development,+homeostasis+and+disease.">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li><li>Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+factor+in+L-cell+conditioned+medium+capable+of+stimulating+colony+formation+by+mouse+marrow+cells+in+culture.">Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture.</a> Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).</li><li>Scheicher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+GM-CSF+induces+in+vitro+differentiation+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow.">Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).</li><li>Stanley, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+colony-stimulating+factor,+CSF-1.">The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1.</a> Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).</li><li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow.">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).</li><li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor.">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li><li>Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+non-equivalence+of+murine+(monocyte-)+macrophage+cells+in+biomaterial+and+inflammatory+models.">Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).</li><li>Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein:+a+perspective.">Green fluorescent protein: a perspective.</a> Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+In+Vivo+Imaging+Using+Fluorescent+Proteins.">Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).</li><li>Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+fluorescent+proteins.">Flow cytometry of fluorescent proteins.</a> Methods. 57 (3), 318-330 (2012).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+exogenous+genes+in+macrophages:+obstacles+and+opportunities.">The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities.</a> Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).</li><li>Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tolerance+induction+in+major+histocompatibility+complex+class+II-restricted+T+cells+specific+for+a+blood-borne+self-antigen.">Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen.</a> Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).</li><li>Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Characterization+of+the+New+Osteoclast+Progenitor+with+Macrophage+Phenotypes+Being+Able+to+Differentiate+into+Mature+Osteoclasts.">Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).</li><li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pCL+vector+system:+rapid+production+of+helper-free,+high-titer,+recombinant+retroviruses.">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).</li><li>Janssen, E., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptor+proteins+in+lymphocyte+activation.">Adaptor proteins in lymphocyte activation.</a> Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).</li><li>Ferguson, P. J., Laxer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+discoveries+in+CRMO:+IL-1beta,+the+neutrophil,+and+the+microbiome+implicated+in+disease+pathogenesis+in+Pstpip2-deficient+mice.">New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).</li><li>Holleman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+outcome+predictor+in+acute+leukemia+1+(OPAL1)+gene+is+not+an+independent+prognostic+factor+in+patients+treated+according+to+COALL+or+St+Jude+protocols.">Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols.</a> Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).</li><li>Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+Differentiation+of+Murine+Myeloid+Precursor+32D/G-CSF-R+Cells.">Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).</li><li>Kralova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transmembrane+Adaptor+Protein+SCIMP+Facilitates+Sustained+Dectin-1+Signaling+in+Dendritic+Cells.">The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).</li><li>Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960 (2014).</li><li>Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protocol+for+efficient+transfection+of+dendritic+cells+without+cell+maturation.">Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766 (2011).</li><li>Siegert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+siRNA+into+mouse+bone+marrow-derived+macrophages+and+dendritic+cells.">Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery:+Potential+Applications+for+Gene+and+Cell-Based+Therapies+in+the+New+Era+of+Personalized+Medicine.">Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine.</a> Genes &amp; Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li><li>Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+progress+in+gene+delivery+technology+based+on+chemical+methods+and+nano-carriers.">Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers.</a> Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).</li><li>Muruve, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome+recognizes+cytosolic+microbial+and+host+DNA+and+triggers+an+innate+immune+response.">The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response.</a> Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).</li><li>Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+humoral+immune+responses+to+viral+antigens+create+barriers+to+lung-directed+gene+therapy+with+recombinant+adenoviruses.">Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses.</a> Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).</li><li>Tallone, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+adenovirus+gene+delivery.">A mouse model for adenovirus gene delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).</li><li>Milone, M. C., O'Doherty, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+use+of+lentiviral+vectors.">Clinical use of lentiviral vectors.</a> Leukemia. , (2018).</li><li>McTaggart, S., Al-Rubeai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+vectors+for+human+gene+delivery.">Retroviral vectors for human gene delivery.</a> Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transience+of+transient+overexpression.">The transience of transient overexpression.</a> Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).</li></ol>

A expressão da proteína de interesse em células-alvo é uma etapa chave em muitos tipos de estudos biológicos. Diferenciada de macrófagos e células dendríticas são difíceis de transfect por transfecção padrão e técnicas de transdução retroviral. Ignorando o transfeccao dessas células diferenciadas com retroviral transdução da medula óssea progenitores, seguido de diferenciação, quando eles já carregam a construção desejada, é um passo crítico, permitindo a expressão dos cDNAs ectópica nestes t...

Células mieloides representam uma parte indispensável dos nossos mecanismos de defesa contra patógenos. Eles são capazes de eliminar rapidamente os micróbios, bem como células morrendo. Além disso, também estão envolvidos na regulação da reparação e desenvolvimento do tecido e na manutenção da homeostase1,2,3. Todas as células mieloides diferenciarem dos progenitores mieloides comuns na medula óssea. Sua diferenciação em vários subconjuntos funcionalmente e morfologicamente distintos é em grande medida controlada por citocinas e suas várias combinações de4. Os subconjuntos de células mieloides mais intensivamente estudadas incluem neutrofílico granulócitos, macrófagos e células dendríticas. Defeitos em qualquer dessas populações levam a consequências potencialmente fatais e causa graves disfunções do sistema imunológico em humanos e ratos1,2,3,5, 6.
Ao contrário de neutrofílico granulócitos, macrófagos e células dendríticas são células residentes do tecido e sua abundância em órgãos imunes é relativamente baixa. Como resultado, o isolamento e purificação de primárias células dendríticas e macrófagos para experimentos que exigem um grande número dessas células é caro e muitas vezes impossível. Para resolver este problema, foram desenvolvidos protocolos para obter grandes quantidades de homogêneos macrófagos ou células dendríticas em vitro. Essas abordagens baseiam-se a diferenciação das células da medula murino na presença de citocinas: macrófago colônia-estimulando fator (M-CSF) por macrófagos e fator colônia-estimulando de granulócitos macrófagos (GM-CSF) ou Flt3 ligante para células dendríticas7,8,9,10,11,12. As células geradas por esse método são comumente descritas na literatura como medula óssea derivada de macrófagos (BMDMs) e medula óssea derivadas de células dendríticas (BMDCs). Eles têm propriedades fisiológicas mais em comum com o primários macrófagos ou células dendríticas do que com linhas de célula correspondente. Outra grande vantagem é a possibilidade de obter estes formam células geneticamente modificadas ratos13. Comparativo de estudos entre o selvagem-tipo pilhas e células derivadas de camundongos geneticamente modificados são muitas vezes críticas para descobrindo novas funções dos genes ou proteínas de interesse.
Análise de Localização subcellular das proteínas nas células vivas requer o acoplamento de uma etiqueta fluorescente à proteína do interesse na vivo. Isto é conseguido mais comumente expressando a construção de fusão geneticamente codificado, composta por uma proteína analisada acoplada (geralmente através de um curto vinculador) a uma proteína fluorescente (EG., verde proteína fluorescente (GFP))14,15 , 16. a expressão de proteínas fluorescente etiquetadas em células dendríticas ou macrófagos é um desafio. Estas células são geralmente difíceis de transfect por procedimentos de transfeccao padrão e as eficiências tendem a ser muito baixa. Além disso, o transfection é transitório, ele gera estresse celular e alcançou a intensidade de fluorescência pode não ser suficiente para microscopia17. A fim de obter uma fração razoável destas células, com um nível suficiente de expressão do transgene, a infecção de células progenitoras de medula óssea com retroviral vetores e sua posterior diferenciação em BMDMs ou BMDCs tornou-se um muito eficiente abordagem. Isso permitiu a análise das proteínas de origem mieloide em seu ambiente nativo de celular, em um estado estável ou durante os processos que são críticos para a resposta imune, tais como a fagocitose, formação de sinapse imunológica ou migração. Aqui, descrevemos um protocolo que permite a expressão estável de proteínas fluorescente etiquetadas um interesse de murino medula óssea derivada de macrófagos e células dendríticas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>15028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>10270</td>
			<td>For media suplementation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Lachema, Brno, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>BB Pharma AS, Prague, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PENICILIN G 1,0 DRASELN&#193; SOL&#39; BIOTIKA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>S9137</td>
			<td>Streptomycin sulfate salt powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Dr. Kulich Pharma, Hradec Kr&#225;lov&#233;, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, linear, MW 25,000</td>
			<td>Polyscience, Warrington, PA, USA</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>101212</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>123110</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>117310</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)</td>
			<td>315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>H1398</td>
			<td>flow cytometry analysis use at 1-2 &#181;g/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow-derived dendritic cells and macrophages

Macrófagos e células dendríticas são células cruciais que formam a primeira linha de defesa contra patógenos. Eles também desempenham papéis importantes no início de uma resposta imune adaptável. Trabalho experimental com estas células é bastante desafiador. Sua abundância em órgãos e tecidos é relativamente baixa. Como resultado, eles não podem ser isolados em grandes números. Eles também são difíceis de transfect com construções de cDNA. No modelo murino, estes problemas podem ser parcialmente superados por diferenciação em vitro de progenitores da medula óssea na presença de macrófagos de M-CSF ou GM-CSF para células dendríticas. Desta forma, é possível obter grandes quantidades dessas células de poucos animais. Além disso, os progenitores da medula óssea podem ser transfectadas com vetores retrovirais carregando do cDNA construções durante as fases iniciais de cultivo antes da sua diferenciação em células dendríticas derivada de medula óssea e macrófagos. Assim, a transdução retroviral seguida de diferenciação em vitro pode ser usada para expressar várias construções de cDNA nestas células. A habilidade de expressar proteínas ectópica substancialmente amplia a gama de experiências que podem ser executadas nessas células, incluindo a imagem de célula viva de proteínas fluorescentes, purificações em tandem para interactome análises, análises de estrutura-função, monitoramento de funções celulares com biosensores e muitos outros. Neste artigo, descrevemos um protocolo detalhado para retroviral transdução de murino medula óssea derivada de células dendríticas e macrófagos com vetores que codifica para proteínas fluorescente-etiquetadas. O exemplo de duas proteínas do adaptador, OPAL1 e PSTPIP2, vamos demonstrar sua aplicação prática em citometria de fluxo e microscopia. Também discutimos as vantagens e as limitações desta abordagem.

Sinalização de adaptador de proteínas é geralmente pequenas proteínas sem qualquer atividade enzimática. Eles possuem vários domínios de interação ou motivos, que mediam a ligação a outras proteínas envolveram na transdução de sinal, incluindo tirosina quinases, fosfatases, ubiquitina ligases e outros21. Para a demonstração da funcionalidade do presente protocolo, adaptadores de células mieloides, PSTPIP2 e OPAL1 foram selecionados. PSTPIP2 é uma...

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Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Expressão de proteínas da fusão fluorescente em murino derivadas da medula óssea as células dendríticas e macrófagos

Neste artigo, nós fornecemos que um protocolo detalhado para a expressão de proteínas da fusão fluorescente em murino medula óssea derivada de macrófagos e células dendríticas. O método é baseado na transdução da medula óssea progenitores com construções retrovirais seguidas por diferenciação em macrófagos e dendríticas células em vitro.

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave nos campos da biologia celular macrófago e dendrítica sobre a localização subcelular e dinâmica de várias proteínas nesses tipos de células. As principais vantagens dessa técnica são que ela é relativamente simples, barata e demonstra uma melhor eficiência e estabilidade de expressão do que a maioria dos outros métodos disponíveis. Demonstrando o procedimento será Jarmila Kralova, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório.Para produzir o retrovírus, emplaque uma suspensão unicelular de células de embalagem Eco-platina em uma placa de petri de 10 centímetros e cultivar as células em 15 mililitros de DMEM, suplementados com 10% de soro bovino fetal, ou FBS, até que a cultura seja de 50 a 60% confluente. No dia seguinte, adicione 20 microgramas da construção retroviral de interesse e 10 microgramas de vetor de embalagem ecológica PCL a 1 mililitro de DMEM sem soro, com mistura suave. Adicione 75 microliters de PEI em 1 mililitro de DMEM sem soro e antibióticos a um segundo tubo para uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente, e misture o conteúdo de ambos os tubos para uma incubação adicional de 10 minutos à temperatura ambiente.Em seguida, substitua cuidadosamente o meio nas células Platinum Eco por 8 mililitros de DMEM frescos de 37 graus Celsius suplementados com 2%FBS e adicione cuidadosamente a mistura de transfecção em gotas à placa. Após uma incubação de 4 horas a 37 graus Celsius, substitua o supernatent por 10 mililitros de 37 graus Celsius DMEM, complementado com 10% de FBS para uma incubação de 24 horas a 37 graus Celsius. No dia seguinte, use uma pipeta de 5 mililitros para transferir o supernênatário retronacírico ecotrópico contendo partículas para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e remover os detritos e conter células por centrifugação.Enquanto isso, adicione 10 mililitros de 37 graus Celsius DMEM mais 10% FBS ao prato de cultura para outra incubação de 24 horas a 37 graus Celsius e colete uma segunda rodada de partículas virais como acabou de demonstrar. Para colher a medula óssea, em uma capa de cultura de tecido, use pinças e tesouras para remover a pele e parte dos músculos dos membros posteriores e desalojar cuidadosamente o acetábulo da articulação do quadril sem quebrar o fêmur. Corte as patas nas articulações do tornozelo e pulverize os ossos com 70% de etanol.Em seguida, remova o resto do músculo com uma toalha de papel e coloque os ossos em uma placa de petri de 5 centímetros de PBS complementada com 2%FBS. Em seguida, dobre a articulação do joelho de cada conjunto ósseo e separe cuidadosamente os ossos com uma tesoura. Use a tesoura para remover cerca de um a dois milímetros de cada epífise de um osso e use uma seringa de dois ou cinco mililitros equipada com uma agulha de calibre 30 carregada com PBS fresco mais FBS para lavar a medula óssea de ambas as extremidades do osso em um tubo de centrífugas de 15 mililitros.Quando a medula tiver sido coletada de cada um dos ossos, pelota as células ósseas por centrifugação e suspenda novamente a pelota em 2,5 mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos por dois a três minutos à temperatura ambiente. Após a lise, filtre as células através de um coador de células de 100 micrômetros em um novo tubo de centrífuga de 15 mililitros e restaure a tenacidade com 12 mililitros de PBS mais FBS. Suspenda novamente a pelota em DMEM, suplementada com 10% de FBS e antibióticos para contagem e placa de cinco a dez vezes 10 vezes 10 para a sexta células de medula óssea em uma placa de petri tratada de cultura não tecidual de 10 centímetros em 10 mililitros de DMEM complementados com fator estimulante de colônias de soro e macrofago, ou MCSF.No quinto dia de cultura, incline cuidadosamente o prato de cultura celular e remova todos, exceto aproximadamente 5 mililitros de meio da superfície perto da borda do prato. Em seguida, adicione 20 mililitros de meio fresco de 37 graus Celsius suplementados com FBS e MCSF ao prato e devolva as células à incubadora de cultura celular. Para colher as células, no sexto ao sétimo dia, remova todas as células médias e flutuantes e lave a cultura com PBS de 37 graus Celsius.Retire as células aderentes com cinco mililitros de 0,02% EDTA e PBS por três a cinco minutos a 37 graus Celsius na incubadora de cultura tecidual e use uma pipeta de cinco mililitros para lavar suavemente as células dissociadas do fundo da placa. Em seguida, transfira as células para um tubo centrífuga de 50 mililitros contendo 25 mililitros de PBS fresco. Para induzir a expressão proteica marcada pela EGFP em células de presente de medula óssea, no início do protocolo de diferenciação celular, diluir as células de medula óssea a uma de dois a cinco vezes 10 para as sextas células por mililitros de DMEM mais FBS e antibióticos conentrção e placa das células de um mililitro de médio por poço, complementados com a diferenciação apropriada citocina.Após quatro a seis horas na incubadora de cultura celular, adicione dois mililitros da primeira rodada de vírus coletados complementados com polibreno e transduza as culturas celulares por centrifugação e uma incubação de quatro horas na incubadora de cultura celular. Ao final do período de transdução, transfira as células nãoadherentes de cada poço para tubos individuais de centrífugas de 15 mililitros e colete as células por centrifugação. Se for necessária uma maior quantidade de células, as células podem ser infectadas com o mesmo constrato em vários poços e agrupadas antes da diferenciação.Em seguida, suspenda novamente as pelotas em 10 mililitros de cultura de meio suplementado com a diferenciação adequada citocina e emplaque as células em uma placa de petri tratada por tubo de 10 centímetros, para sua cultura de seis a oito dias, como apenas demonstrado. A avaliação da eficácia da transfecção Platinum Eco por citometria de fluxo após a coleta do segundo vírus contendo supernêgente revela uma eficiência média de transfecção de 62% para PSTPIP2-EGFP e 53% para OPAL1-EGFP. A transdução retroviral não afeta o status de diferenciação das células derivadas da medula óssea com mais de 90% das células em ambas as culturas demonstrando positividade para seus respectivos marcadores após a transdução com qualquer vírus.E com as mudanças morfológicas apropriadas e características observadas para ambos os tipos de células diferenciadas. Note-se que a expressão geral do EGFP foi menor nas culturas de células dendríticas derivadas da medula óssea em comparação com a expressão do macrófago derivado da medula óssea EGFP, independentemente do tipo de retrovírus. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar pratos plásticos não tecidos, cultura tratada que são tipicamente usados para cultivar bactérias se você planeja remover células do prato para experimentar.Após esse procedimento, outros métodos de imagem celular viva, microscopia de super resolução ou outros tipos de microscopia podem ser empregados para responder a perguntas adicionais sobre a localização subcelular e dinâmica de células dendríticas e proteínas macrófagos de interesse. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da imunologia na exploração da distribuição e relações espaçais de proteínas expressas por macrófagos e células dendríticas e em promover nossa compreensão da função dessas proteínas durante as respostas imunológicas. Não se esqueça que trabalhar com partículas virais pode ser extremamente perigoso e que precauções, como a geração mínima de aerossol, o uso de equipamentos de proteção e o uso de uma capa de fluxo laminar, devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Cultura de células dendríticas mielóides a partir de precursores da medula óssea

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Biologia

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Geração de Medula Óssea Derivado Células Dendríticas murino para uso em dois fótons de imagem

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Labeling fluorescentes de COS-7 expressando as proteínas SNAP tag-Fusion para imagens de células vivas

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Usando um contador de células automatizadas para simplificar Estudos da Expressão Gênica: Knockdown siRNA de Expressão IL-4 Gene Dependente em células NAMALWA

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Fotoconversão de proteínas purificadas fluorescentes e Dual-sonda Destacando Optical em células vivas

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

Peptídeos de Phage Biblioteca Mostrar modular a expressão de genes em células mesenquimais e potenciar a osteogênese em defeitos ósseos unicorticais

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...