Name: expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow-derived dendritic cells and macrophages
Uploaded: 2018-10-30T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages at JoVE.com

Эта работа была поддержана на Чешской науки фонд (GACR) (проект № 16-07425S), Карлова университета гранта Агентства (ГАУК) (номер 923116 проекта) и институционального финансирования от Института молекулярной генетики, Академия наук Чешской Республики Республика (РВО 68378050).

Все методы, описанные здесь были утверждены Комитетом экспертов по благосостоянию экспериментальных животных Института молекулярной генетики и Академии наук Чешской Республики.
1. Реагент подготовка
<ol><li>Подготовьте аммония хлорид калия (ACK) буфера. Добавить 4.145 g NH4</...

<ol>
	<li>Moghaddam, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity,+polarization+and+function+in+health+and+disease.">Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease.</a> Journal of Cellular Physiology. , (2018).</li><li>Qian, C., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+the+regulation+of+immunity+and+inflammation.">Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation.</a> Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).</li><li>Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function:+from+mechanisms+to+disease.">Neutrophil function: from mechanisms to disease.</a> Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).</li><li>Kondo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+and+myeloid+lineage+commitment+in+multipotent+hematopoietic+progenitors.">Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors.</a> Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).</li><li>Andrews, T., Sullivan, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+in+patients+with+inherited+defects+in+phagocytic+function.">Infections in patients with inherited defects in phagocytic function.</a> Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).</li><li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+biology+in+development,+homeostasis+and+disease.">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li><li>Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+factor+in+L-cell+conditioned+medium+capable+of+stimulating+colony+formation+by+mouse+marrow+cells+in+culture.">Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture.</a> Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).</li><li>Scheicher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+GM-CSF+induces+in+vitro+differentiation+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow.">Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).</li><li>Stanley, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+colony-stimulating+factor,+CSF-1.">The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1.</a> Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).</li><li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow.">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).</li><li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor.">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li><li>Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+non-equivalence+of+murine+(monocyte-)+macrophage+cells+in+biomaterial+and+inflammatory+models.">Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).</li><li>Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein:+a+perspective.">Green fluorescent protein: a perspective.</a> Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+In+Vivo+Imaging+Using+Fluorescent+Proteins.">Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).</li><li>Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+fluorescent+proteins.">Flow cytometry of fluorescent proteins.</a> Methods. 57 (3), 318-330 (2012).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+exogenous+genes+in+macrophages:+obstacles+and+opportunities.">The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities.</a> Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).</li><li>Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tolerance+induction+in+major+histocompatibility+complex+class+II-restricted+T+cells+specific+for+a+blood-borne+self-antigen.">Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen.</a> Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).</li><li>Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Characterization+of+the+New+Osteoclast+Progenitor+with+Macrophage+Phenotypes+Being+Able+to+Differentiate+into+Mature+Osteoclasts.">Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).</li><li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pCL+vector+system:+rapid+production+of+helper-free,+high-titer,+recombinant+retroviruses.">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).</li><li>Janssen, E., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptor+proteins+in+lymphocyte+activation.">Adaptor proteins in lymphocyte activation.</a> Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).</li><li>Ferguson, P. J., Laxer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+discoveries+in+CRMO:+IL-1beta,+the+neutrophil,+and+the+microbiome+implicated+in+disease+pathogenesis+in+Pstpip2-deficient+mice.">New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).</li><li>Holleman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+outcome+predictor+in+acute+leukemia+1+(OPAL1)+gene+is+not+an+independent+prognostic+factor+in+patients+treated+according+to+COALL+or+St+Jude+protocols.">Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols.</a> Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).</li><li>Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+Differentiation+of+Murine+Myeloid+Precursor+32D/G-CSF-R+Cells.">Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).</li><li>Kralova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transmembrane+Adaptor+Protein+SCIMP+Facilitates+Sustained+Dectin-1+Signaling+in+Dendritic+Cells.">The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).</li><li>Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960 (2014).</li><li>Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protocol+for+efficient+transfection+of+dendritic+cells+without+cell+maturation.">Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766 (2011).</li><li>Siegert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+siRNA+into+mouse+bone+marrow-derived+macrophages+and+dendritic+cells.">Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery:+Potential+Applications+for+Gene+and+Cell-Based+Therapies+in+the+New+Era+of+Personalized+Medicine.">Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine.</a> Genes &amp; Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li><li>Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+progress+in+gene+delivery+technology+based+on+chemical+methods+and+nano-carriers.">Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers.</a> Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).</li><li>Muruve, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome+recognizes+cytosolic+microbial+and+host+DNA+and+triggers+an+innate+immune+response.">The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response.</a> Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).</li><li>Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+humoral+immune+responses+to+viral+antigens+create+barriers+to+lung-directed+gene+therapy+with+recombinant+adenoviruses.">Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses.</a> Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).</li><li>Tallone, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+adenovirus+gene+delivery.">A mouse model for adenovirus gene delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).</li><li>Milone, M. C., O'Doherty, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+use+of+lentiviral+vectors.">Clinical use of lentiviral vectors.</a> Leukemia. , (2018).</li><li>McTaggart, S., Al-Rubeai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+vectors+for+human+gene+delivery.">Retroviral vectors for human gene delivery.</a> Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transience+of+transient+overexpression.">The transience of transient overexpression.</a> Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).</li></ol>

Выражение протеина интереса к клеткам-мишеням является ключевым шагом во многих видах биологических исследований. Трудно transfect стандартных transfection и антиретровирусным трансдукции методы дифференцированной макрофаги и дендритные клетки. Обход трансфекции этих дифференцированных кле...

Миелоидных клеток являются неотъемлемой частью наших защитных механизмов против патогенов. Они способны быстро ликвидировать микробы, а также умирающие клетки. Кроме того они участвуют также в регулировании развития тканей и ремонта и в поддержании гомеостаза1,2,3. Все миелоидных клеток отличить от общих миелоидного предшественники костного мозга. В значительной степени контролируется цитокинов и их различные комбинации4является их дифференциация во многих морфологически и функционально различных подмножеств. Наиболее интенсивно изучали подмножеств миелоидных клеток включают нейтрофильных гранулоцитов, макрофаги и дендритные клетки. Дефекты в любой из этих групп населения приводят к потенциально угрожающих жизни последствий и причиной тяжелой дисфункции иммунной системы в организме человека и мышей1,2,3,5, 6.
В отличие от нейтрофильных гранулоцитов дендритные клетки и макрофаги-резидентов клетки тканей и их обилие в иммунных органов является относительно низким. В результате изоляция и очищение первичных дендритные клетки и макрофаги для экспериментов требующих большое количество этих клеток является дорогостоящей и зачастую невозможно. Для решения этой проблемы, были разработаны протоколы для получения большого количества однородных макрофаги и дендритные клетки в пробирке. Эти подходы основаны на дифференциацию клеток костного мозга мышиных присутствии цитокинов: макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF) для макрофагов и гранулоцитарно макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) или Flt3 лигандом для дендритные клетки7,8,9,10,,1112. Клетки, созданный этим методом часто описаны в литературе, как костного производные макрофагов (BMDMs) и костного мозга, полученных дендритных клеток (BMDCs). Они имеют больше физиологические свойства общего первичного макрофаги или дендритные клетки чем с соответствующими клеточных линий. Другим большим преимуществом является возможность получения эти формы клетки генетически измененных мышей13. Сравнительные исследования между одичал тип клеток и клеток, полученных из генетически измененных мышей часто имеют решающее значение для раскрытия новых функций генов или протеинов интереса.
Анализ локализация внутриклеточных белков в живых клетках требует муфта флуоресцентные метки к протеину интереса в естественных условиях. Чаще всего это достигается путем выражения генетически закодированный фьюжн конструкция состоит из анализируемых белков, сочетании (часто через короткий компоновщика) к флуоресцентный белок (например., Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП))14,15 , 16. выражение дневно тегами белков в дендритные клетки и макрофаги является сложной задачей. Эти клетки обычно трудно transfect трансфекции стандартных процедур и эффективности, как правило, очень низкая. Кроме того transfection является временным, он генерирует клеточного стресса и достигнутые интенсивность флуоресценции не может быть достаточным для микроскопии17. Для того, чтобы получить разумную долю этих клеток с достаточным уровнем экспрессии трансген, инфекции прогениторных клеток костного мозга с антиретровирусной векторов и их последующее дифференцировку в BMDMs или BMDCs стал весьма эффективным подход. Это позволило для анализа белков миелоидного происхождения в их родной среде сотовой, так в стабильном состоянии, или в ходе процессов, которые являются критическими для иммунного ответа как фагоцитоз, иммунологические синапса формирования или миграции. Здесь мы описываем протокол, который обеспечивает стабильное выражение дневно тегами протеинов интереса в мышиных костного мозга, полученных макрофаги и дендритные клетки.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>15028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>10270</td>
			<td>For media suplementation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Lachema, Brno, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>BB Pharma AS, Prague, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PENICILIN G 1,0 DRASELN&#193; SOL&#39; BIOTIKA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>S9137</td>
			<td>Streptomycin sulfate salt powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Dr. Kulich Pharma, Hradec Kr&#225;lov&#233;, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, linear, MW 25,000</td>
			<td>Polyscience, Warrington, PA, USA</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>101212</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>123110</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>117310</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)</td>
			<td>315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>H1398</td>
			<td>flow cytometry analysis use at 1-2 &#181;g/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow-derived dendritic cells and macrophages

Дендритные клетки и макрофаги являются важнейшим клетки, которые образуют первую линию обороны против патогенов. Они также играют важную роль в инициировании адаптивного иммунного ответа. Экспериментальная работа с этими клетками является довольно сложной задачей. Их численность в органах и тканях является относительно низким. В результате они не могут быть изолированы в больших количествах. Они также являются трудно transfect с cDNA конструкции. В мышиных модели в пробирке дифференциации от предшественники костного присутствии M-CSF для макрофаги или ГМ-КСФ для дендритных клеток можно частично преодолеть эти проблемы. Таким образом можно получить большое количество этих клеток от очень мало животных. Кроме того предшественники костного мозга может преобразованы с ретровирусной векторы нося cDNA конструкции ранних этапах выращивания до их дифференцировку в костного мозга, полученных дендритные клетки и макрофаги. Таким образом ретровиральных трансдукции следуют дифференциации в пробирке может использоваться выразить различные конструкции cDNA в эти клетки. Способность выразить внематочная белки существенно расширяет спектр экспериментов, которые могут быть выполнены на эти клетки, включая живой клетки изображения флуоресцентных белков, тандем очищения для interactome анализа, анализа структуры функция, мониторинг клеточных функций с биодатчики и многие другие. В этой статье мы описываем подробный протокол для антиретровирусного лечения трансдукции мышиных костного мозга, полученных дендритные клетки и макрофаги с векторами, кодирующих белки дневно тегами. На примере двух белков адаптер, OPAL1 и PSTPIP2, мы демонстрируем свое практическое применение в проточной цитометрии и микроскопии. Мы также обсудить преимущества и недостатки этого подхода.

Сигнальный адаптер белки, обычно маленькие белки без каких-либо ферментативную активность. Они обладают различные взаимодействия доменов или мотивы, которые посредником связывание с другими белками вовлечены в сигнальной трансдукции, включая тирозин киназ, фосфата?...

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages at JoVE.com

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Выражение флуоресцентные синтез белков в мышиных костного мозга-производные дендритные клетки и макрофаги

В этой статье мы предоставляем подробный протокол для выражения флуоресцентные синтез белков в мышиных костного мозга, полученных дендритные клетки и макрофаги. Метод основан на трансдукции костного прародителями с ретровирусной конструкции следуют дифференцировку в макрофаги и дендритные клетки в пробирке.

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области макрофагов и дендритной клеточной биологии о субклеточной локализации и динамике различных белков в этих типах клеток. Основные преимущества этого метода в том, что он относительно прост, недорог и демонстрирует лучшую эффективность и стабильность выражения, чем большинство других доступных методов. Демонстрацией процедуры будет Яремила Кралова, аспирантка моей лаборатории.Для производства ретровируса пластина одноклеточной подвески платиновых эко-упаковочных клеток в 10-сантиметровой чашке Петри и культивировать клетки в 15 миллилитров DMEM, дополненный 10%fetal быvine сыворотки, или FBS, пока культура от 50 до 60% слияние. На следующий день добавьте 20 микрограммов ретровирусной конструкции интереса и 10 микрограммов вектора эко-упаковки PCL в 1 миллилитр DMEM без сыворотки, с нежным смешиванием. Добавьте 75 микролитров PEI в 1 миллилитр DMEM без сыворотки и антибиотиков во вторую трубку в течение пяти минут инкубации при комнатной температуре, и смешать содержимое обеих труб вместе в течение дополнительных 10 минут инкубации при комнатной температуре.Далее, тщательно заменить среду на платиновых эко-клеток с 8 миллилитров свежих 37 градусов по Цельсию DMEM дополнен 2%FBS и осторожно добавить смесь трансфекции в каплях к пластине. После 4-часовой инкубации при 37 градусах по Цельсию замените супернатент 10 миллилитров 37 градусов по Цельсию DMEM, дополненный 10%FBS для 24-часовой инкубации при 37 градусах по Цельсию. На следующий день используйте трубу из 5 миллилитров для переноса экотропных ретровирусных частиц, содержащих супернатент, в 15-миллилитровую центрифугу и удаления мусора и содержания клеток путем центрифугации.Между тем, добавить 10 миллилитров 37 градусов по Цельсию DMEM плюс 10%FBS к культуре блюдо еще 24 часа инкубации при 37 градусов по Цельсию и собирать второй раунд вирусных частиц, как только что продемонстрировали. Для сбора костного мозга, в капюшоне культуры тканей, используйте пинцет и ножницы, чтобы удалить кожу и часть мышц из задних конечностей и тщательно выбить ацетабулум из тазобедренного сустава, не нарушая бедренной кости. Вырезать лапы на голеностопных суставах и спрей кости с 70% этанола.Затем удалите остальную часть мышцы бумажным полотенцем и поместите кости в 5-сантиметровую чашку Петри PBS, дополненную 2%FBS. Затем согните коленный сустав каждого набора костей и тщательно разделте кости ножницами. Используйте ножницы, чтобы удалить от одного до двух миллиметров каждого эпифиза одной кости и использовать два или пять миллилитров шприц оснащен 30 калибровочных иглы загружены свежим PBS плюс FBS, чтобы промыть костный мозг с обоих концов кости в 15 миллилитров центрифуги трубки.Когда костный мозг был собран из каждой из костей, гранулы костных клеток центрифугации и повторно приостановить гранулы в 2,5 миллилитров красных кровяных клеток лиза буфера в течение двух-трех минут при комнатной температуре. После лиза, фильтровать клетки через 100 микрометровый ситечко клеток в новую 15 миллилитровую центрифугу трубки и восстановить упорство с 12 миллилитров PBS плюс FBS. Повторно приостановить гранулы в DMEM, дополняется 10%FBS и антибиотики для подсчета и пластины от пяти до 10 раз от 10 до шестой клетки костного мозга в 10 сантиметров, не-ткани культуры лечение Петри блюдо в 10 миллилитров DMEM дополнен сыворотки и макрофаг колонии стимулирующий фактор, или MCSF.На пятый день культуры, тщательно наклонить блюдо клеточной культуры и удалить все, кроме примерно 5 миллилитров среды с поверхности вблизи края блюда. Затем добавьте 20 миллилитров свежей среды 37 градусов по Цельсию, дополненной FBS и MCSF, в блюдо и верните клетки в инкубатор клеточной культуры. Чтобы собрать клетки, на шестой-седьмой день, удалить все средние и плавающие клетки и мыть культуру с 37 градусов по Цельсию PBS.Отсоедините адепт клетки с пятью миллилитров 0,02%EDTA и PBS в течение трех-пяти минут при 37 градусах по Цельсию в инкубаторе культуры тканей и используйте пятими миллилитровую пипетку, чтобы аккуратно смыть диссоциированные клетки со дна пластины. Затем перенесите клетки в 50-миллилитровую центрифугу, содержащую 25 миллилитров свежего PBS. Чтобы вызвать EGFP помечены выражение белка в костном мозге производных антигенов, представляя клетки, в начале протокола дифференциации клеток, разбавить клетки костного мозга в два-пять раз от 10 до шестой клетки на миллилитров DMEM плюс FBS и антибиотики conentration и пластины клетки одного миллилитра среды на колодец, дополненный соответствующей дифференциации цитокинов.После четырех-шести часов в инкубаторе клеточной культуры добавьте два миллилитров первого раунда собранного вируса, дополненного полибреном, и трансдуцировать клеточные культуры центрифугой и четырехчасовой инкубацией в инкубаторе клеточной культуры. В конце периода трансдукции перенесите неадъердные клетки из каждого колодец в отдельные 15 миллилитровых центрифугных трубок и соберите клетки путем центрифугации. Если требуется большее количество клеток, клетки могут быть заражены одним и тем же консорциумом в нескольких скважинах и объединились перед дифференциацией.Затем повторно приостановить гранулы в 10 миллилитров культуры среды дополняется соответствующей дифференциации цитокинов и пластины клеток на один 10 сантиметров, не ткани культуры лечение Петри блюдо на трубку, за их шесть-восемь дней культуры, как только что продемонстрировали. Оценка эффективности трансфекции Platinum Eco по цитометрии потока после сбора второго вируса, содержащего супернатент, показывает средняя эффективность трансинфекции 62% для PSTPIP2-EGFP и 53% для OPAL1-EGFP. Ретровирусная трансдукция не влияет на дифференциацию состояния клеток костного мозга с более чем 90% клеток в обеих культурах, демонстрирующих положительность для их соответствующих маркеров после трансдукции с любого вируса.И с соответствующими, характерными морфологическими изменениями, наблюдаемыми для обоих типов дифференцированных клеток. Следует отметить, что общее выражение EGFP было ниже в костном мозге, полученных дендритных клеточных культур по сравнению с костного мозга, полученных макрофаг EGFP выражение, независимо от типа ретровируса. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы использовать не ткани, культуры лечение пластиковых блюд, которые обычно используются для выращивания бактерий, если вы планируете удалить клетки из блюда для эксперимента.Следуя этой процедуре, другие методы живой клеточной визуализации, микроскопии супер разрешения или других видов микроскопии могут быть использованы, чтобы ответить на дополнительные вопросы о субклеточной локализации и динамике дендритных клеток и макрофагов белков, представляющих интерес. Этот метод проложил путь для исследователей в области иммунологии в изучении распределения и спациальных отношений белков, выраженных макрофагов и дендритных клеток и в дальнейшем наше понимание функции этих белков во время иммунных реакций. Не забывайте, что работа с вирусными частицами может быть чрезвычайно опасной, и что меры предосторожности, такие как минимизация производства аэрозолей, ношение защитного оборудования, и использование ламинарного капюшона потока, всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Культура миелоидных дендритных клеток из костного мозга прекурсоров

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Генерация костного мозга мышей Производные дендритных клеток для использования в 2-фотонных изображений

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Подготовка первичных гемопоэтических клеточных культур из костного мозга мышей для Электропорация

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Окрашивание белков в гелях Кумасси G-250 без органических растворителей и уксусной кислоты

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Флуоресцентная маркировка COS-7 выражая SNAP-теги Белки Fusion для живых изображений сотовый

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Использование автоматизированных счетчиков сотовый для упрощения исследования экспрессии генов: миРНК Нокдаун ИЛ-4 зависимости экспрессии генов в клетках Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Фотопревращения Очищенная флуоресцентных белков и двойного зонда Оптические Выделение в живых клетках

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

Пептидов из библиотеки Показать Фаг Модуляция экспрессии генов в клетки и мезенхимальные Потенцирует остеогенез в Unicortical костных дефектов

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Зеленый флуоресцентный белок на основе Expression Скрининг мембранных белков в<em&gt; Кишечная палочка</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...