Name: expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow-derived dendritic cells and macrophages
Uploaded: 2018-10-30T12:30:00
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Este trabajo fue apoyado por Checa ciencia Fundación (GACR) (proyecto número 16-07425S), por Charles University Grant agencia (poesías) (número de proyecto 923116) y por fondos institucionales desde el Instituto de Genética Molecular de la Academia de Ciencias de la República Checa República (RVO 68378050).

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el Comité de expertos sobre bienestar de animales de experimentación del Instituto de Genética Molecular y por la Academia de Ciencias de la República Checa.
1. preparación del reactivo
<ol><li>Preparar el tampón amonio cloruro de potasio (ACK). Añadir 4,145 g de NH4Cl y 0,5 g de KHCO3 a 500 mL de ddH2O, añada 100 μl de 0.5m ácido etilendiaminotetracético (EDTA) y esterilizar filtro.</li>
	<...

<ol>
	<li>Moghaddam, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity,+polarization+and+function+in+health+and+disease.">Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease.</a> Journal of Cellular Physiology. , (2018).</li><li>Qian, C., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+the+regulation+of+immunity+and+inflammation.">Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation.</a> Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).</li><li>Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function:+from+mechanisms+to+disease.">Neutrophil function: from mechanisms to disease.</a> Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).</li><li>Kondo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+and+myeloid+lineage+commitment+in+multipotent+hematopoietic+progenitors.">Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors.</a> Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).</li><li>Andrews, T., Sullivan, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+in+patients+with+inherited+defects+in+phagocytic+function.">Infections in patients with inherited defects in phagocytic function.</a> Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).</li><li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+biology+in+development,+homeostasis+and+disease.">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li><li>Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+factor+in+L-cell+conditioned+medium+capable+of+stimulating+colony+formation+by+mouse+marrow+cells+in+culture.">Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture.</a> Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).</li><li>Scheicher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+GM-CSF+induces+in+vitro+differentiation+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow.">Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).</li><li>Stanley, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+colony-stimulating+factor,+CSF-1.">The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1.</a> Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).</li><li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow.">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).</li><li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor.">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li><li>Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+non-equivalence+of+murine+(monocyte-)+macrophage+cells+in+biomaterial+and+inflammatory+models.">Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).</li><li>Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein:+a+perspective.">Green fluorescent protein: a perspective.</a> Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+In+Vivo+Imaging+Using+Fluorescent+Proteins.">Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).</li><li>Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+fluorescent+proteins.">Flow cytometry of fluorescent proteins.</a> Methods. 57 (3), 318-330 (2012).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+exogenous+genes+in+macrophages:+obstacles+and+opportunities.">The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities.</a> Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).</li><li>Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tolerance+induction+in+major+histocompatibility+complex+class+II-restricted+T+cells+specific+for+a+blood-borne+self-antigen.">Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen.</a> Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).</li><li>Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Characterization+of+the+New+Osteoclast+Progenitor+with+Macrophage+Phenotypes+Being+Able+to+Differentiate+into+Mature+Osteoclasts.">Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).</li><li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pCL+vector+system:+rapid+production+of+helper-free,+high-titer,+recombinant+retroviruses.">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).</li><li>Janssen, E., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptor+proteins+in+lymphocyte+activation.">Adaptor proteins in lymphocyte activation.</a> Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).</li><li>Ferguson, P. J., Laxer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+discoveries+in+CRMO:+IL-1beta,+the+neutrophil,+and+the+microbiome+implicated+in+disease+pathogenesis+in+Pstpip2-deficient+mice.">New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).</li><li>Holleman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+outcome+predictor+in+acute+leukemia+1+(OPAL1)+gene+is+not+an+independent+prognostic+factor+in+patients+treated+according+to+COALL+or+St+Jude+protocols.">Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols.</a> Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).</li><li>Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+Differentiation+of+Murine+Myeloid+Precursor+32D/G-CSF-R+Cells.">Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).</li><li>Kralova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transmembrane+Adaptor+Protein+SCIMP+Facilitates+Sustained+Dectin-1+Signaling+in+Dendritic+Cells.">The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).</li><li>Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960 (2014).</li><li>Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protocol+for+efficient+transfection+of+dendritic+cells+without+cell+maturation.">Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766 (2011).</li><li>Siegert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+siRNA+into+mouse+bone+marrow-derived+macrophages+and+dendritic+cells.">Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery:+Potential+Applications+for+Gene+and+Cell-Based+Therapies+in+the+New+Era+of+Personalized+Medicine.">Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine.</a> Genes &amp; Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li><li>Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+progress+in+gene+delivery+technology+based+on+chemical+methods+and+nano-carriers.">Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers.</a> Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).</li><li>Muruve, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome+recognizes+cytosolic+microbial+and+host+DNA+and+triggers+an+innate+immune+response.">The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response.</a> Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).</li><li>Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+humoral+immune+responses+to+viral+antigens+create+barriers+to+lung-directed+gene+therapy+with+recombinant+adenoviruses.">Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses.</a> Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).</li><li>Tallone, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+adenovirus+gene+delivery.">A mouse model for adenovirus gene delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).</li><li>Milone, M. C., O'Doherty, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+use+of+lentiviral+vectors.">Clinical use of lentiviral vectors.</a> Leukemia. , (2018).</li><li>McTaggart, S., Al-Rubeai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+vectors+for+human+gene+delivery.">Retroviral vectors for human gene delivery.</a> Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transience+of+transient+overexpression.">The transience of transient overexpression.</a> Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).</li></ol>

La expresión de la proteína de interés en las células Diana es un paso clave en muchos tipos de estudios biológicos. Diferenciados de los macrófagos y las células dendríticas son difíciles de transfectar, transfección estándar y técnicas de transducción retroviral. Pasando por alto la transfección de las células diferenciadas con transducción retroviral de progenitores de médula ósea, seguido por la diferenciación cuando ya llevan la construcción deseada, es un paso crítico que permite la expresión ...

Las células mieloides representan una parte imprescindible de nuestros mecanismos de defensa contra patógenos. Son capaces de rápidamente eliminar microbios, así como las células moribundas. Además, también están involucrados en la regulación de la reparación y desarrollo de tejido y en el mantenimiento de la homeostasis1,2,3. Todas las células mieloides se diferencian de la común progenitores mieloides de la médula ósea. Su diferenciación en muchos subconjuntos funcionalmente y morfológicamente distintos es en gran parte controlada por citoquinas y sus diversas combinaciones4. Los subconjuntos de células mieloides más intensamente estudiadas son granulocitos, macrófagos y células dendríticas. Defectos en cualquiera de estas poblaciones llevan a consecuencias potencialmente peligrosas para la vida y causa graves disfunciones del sistema inmunitario en humanos y ratones1,2,3,5, 6.
A diferencia de los granulocitos, macrófagos y células dendríticas son células residentes del tejido y su abundancia en los órganos inmunes es relativamente baja. Como resultado, el aislamiento y purificación de primarias células dendríticas y macrófagos para experimentos que requieren un gran número de estas células es costoso y a menudo imposible. Para resolver este problema, se han desarrollado protocolos para obtener grandes cantidades de homogéneos macrófagos o células dendríticas in vitro. Estos enfoques se basan en la diferenciación de células de médula ósea murina en presencia de citoquinas: factor de estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) de macrófagos y el factor colonia-estimulante del granulocyte-macrófago (GM-CSF) o el ligando Flt3 para 8,7,9,10,de las células dendríticas de11,12. Células generadas por este método comúnmente se describen en la literatura como la médula ósea derivados de macrófagos (BMDMs) y la médula ósea derivados de células dendríticas (BMDCs). Tienen propiedades fisiológicas más en común con primarios macrófagos o células dendríticas que con líneas celulares correspondientes. Otra gran ventaja es la posibilidad de obtener estos forman células genéticamente modificados ratones13. Estudios comparativos entre las células de tipo salvaje y las células derivadas de ratones genéticamente modificados son a menudo críticas para descubrir nuevas funciones de genes o proteínas de interés.
Análisis de la localización subcelular de las proteínas en las células vivas requiere el acoplamiento de una etiqueta fluorescente de la proteína de interés en vivo. Esto comúnmente se logra expresando construcción genéticamente codificados fusión compuesta por una proteína analizada juntada (a menudo vía un enlazador corto) a una proteína fluorescente (por ej., proteína fluorescente (GFP) de verde)14,15 , 16. la expresión de fluorescencia etiquetas proteínas en las células dendríticas o macrófagos es un reto. Estas células son generalmente difíciles de transfectar por procedimientos estándar de la transfección y la eficiencia tiende a ser muy baja. Por otra parte, la transfección es transitoria, genera estrés celular y alcanzado intensidad de la fluorescencia puede no ser suficiente para microscopia17. Para obtener una fracción razonable de estas células con un suficiente nivel de expresión de transgenes, la infección de células progenitoras de médula ósea con retroviral vectores y su posterior diferenciación en BMDMs o BMDCs se ha convertido en un muy eficiente enfoque. Ha permitido el análisis de las proteínas de origen mieloide en su entorno celular nativo, en un estado estacionario o en procesos que son críticos para la respuesta inmune tales como fagocitosis, formación de la sinapsis inmunológica o migración. Aquí, describimos un protocolo que permite la expresión estable de fluorescencia etiquetas proteínas de interés en murinos la médula ósea derivado de macrófagos y células dendríticas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>15028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>10270</td>
			<td>For media suplementation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Lachema, Brno, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>BB Pharma AS, Prague, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PENICILIN G 1,0 DRASELN&#193; SOL&#39; BIOTIKA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>S9137</td>
			<td>Streptomycin sulfate salt powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Dr. Kulich Pharma, Hradec Kr&#225;lov&#233;, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, linear, MW 25,000</td>
			<td>Polyscience, Warrington, PA, USA</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>101212</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>123110</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>117310</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)</td>
			<td>315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>H1398</td>
			<td>flow cytometry analysis use at 1-2 &#181;g/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow-derived dendritic cells and macrophages

Macrófagos y células dendríticas son células cruciales que forman la primera línea de defensa contra patógenos. También juegan papeles importantes en la iniciación de una respuesta inmune adaptativa. Trabajo experimental con estas células es más bien un desafío. Su abundancia en órganos y tejidos es relativamente baja. Como resultado, no puede ser aislados en grandes cantidades. También son difíciles de transfectar con construcciones de cDNA. En el modelo murino, estos problemas pueden superarse parcialmente por en vitro la diferenciación de progenitores de médula ósea en presencia de M-CSF para macrófagos GM-CSF de las células dendríticas. De esta manera, es posible obtener grandes cantidades de estas células de muy pocos animales. Por otra parte, progenitores de médula ósea pueden ser transduced con vectores retrovirales que construcciones de cDNA durante etapas tempranas del cultivo antes de su diferenciación en la médula ósea derivada de células dendríticas y macrófagos. Por lo tanto, transducción retroviral seguida de diferenciación en vitro puede utilizarse para expresar diversas construcciones de cDNA en estas células. La habilidad de expresar proteínas ectópicas substancialmente amplía la gama de experimentos que se pueden realizar en estas células, incluyendo células vivas imágenes de proteínas fluorescentes, purificaciones de tándem para interactoma análisis, análisis de la estructura y función, seguimiento de las funciones celulares con biosensores y muchos otros. En este artículo, describimos un protocolo detallado para la transducción retroviral de murino la médula ósea derivada de células dendríticas y macrófagos con vectores que codifica para las proteínas con etiqueta fluorescente. En el ejemplo de dos proteínas, OPAL1 y PSTPIP2, demostramos su aplicación práctica en microscopia y citometría de flujo. También discutimos las ventajas y limitaciones de este enfoque.

Proteínas señales son proteínas generalmente pequeñas sin ninguna actividad enzimática. Poseen varios dominios de interacción o motivos, que median la Unión a otras proteínas involucradas en transducción de señales, incluyendo tirosina quinasas, fosfatasas, ligasas de ubiquitina y otros21. Para la demostración de la funcionalidad de este protocolo se seleccionaron adaptadores de células mieloides PSTPIP2 y OPAL1. PSTPIP2 es una proteína bien caracteriz...

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Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Expresión de proteínas fluorescentes de fusión en murinas médula ósea células dendríticas y macrófagos

En este artículo, nos proporcionan que un protocolo detallado para la expresión de proteínas fluorescentes de fusión en médula ósea murina derivados de macrófagos y células dendríticas. El método se basa en la transducción de la médula ósea progenitores con retrovirales construcciones seguidas de diferenciación en macrófagos y dendríticas de las células en vitro.

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología de los macrófagos y las células dendríticas sobre la localización subcelular y la dinámica de varias proteínas en estos tipos celulares. Las principales ventajas de esta técnica son que es relativamente simple, económica y demuestra una mejor eficiencia y estabilidad de expresión que la mayoría de los otros métodos disponibles. Demostrando el procedimiento estará Jarmila Kralova, una estudiante de posgrado de mi laboratorio.Para producir el retrovirus, vajilla una suspensión monocelular de células de Platinum Eco-packaging en un plato petri de 10 centímetros y cultive las células en 15 mililitros de DMEM, complementado con un 10% de suero bovino fetal, o FBS, hasta que el cultivo sea de 50 a 60% confluente. Al día siguiente, añadir 20 microgramos de la construcción retroviral de interés y 10 microgramos de vector de eco-envasado PCL a 1 mililitro de DMEM sin suero, con mezcla suave. Añadir 75 microlitros de PEI en 1 mililitro de DMEM sin suero y antibióticos a un segundo tubo para una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente, y mezclar el contenido de ambos tubos para una incubación adicional de 10 minutos a temperatura ambiente.A continuación, reemplace cuidadosamente el medio en las células Platinum Eco con 8 mililitros de DMEM fresco de 37 grados Celsius complementados con 2%FBS y agregue cuidadosamente la mezcla de transfección en gotas a la placa. Después de una incubación de 4 horas a 37 grados centígrados, reemplace el sobrenadante con 10 mililitros de DMEM de 37 grados Celsius, complementado con 10%FBS para una incubación de 24 horas a 37 grados centígrados. Al día siguiente, utilice una pipeta de 5 mililitros para transferir el sobrenadante retroviral retroviral que contiene partículas ecotrópica a un tubo centrífugo de 15 mililitros y eliminar los desechos y las células que contienen por centrifugación.Mientras tanto, añadir 10 mililitros de 37 grados Celsius DMEM más 10%FBS al plato de cultivo para otra incubación de 24 horas a 37 grados Celsius y recoger una segunda ronda de partículas virales como acaba de demostrar. Para cosechar la médula ósea, en una capucha de cultivo de tejido, utilice pinzas y tijeras para eliminar la piel y parte de los músculos de las extremidades posteriores y desalojar cuidadosamente el acetábulo de la articulación de la cadera sin romper el fémur. Cortar las patas en las articulaciones del tobillo y rociar los huesos con 70%etanol.Luego retire el resto del músculo con una toalla de papel y coloque los huesos en un plato petri de 5 centímetros de PBS complementado con 2%FBS. A continuación, dobla la articulación de la rodilla de cada conjunto óseo y separa cuidadosamente los huesos con tijeras. Utilice las tijeras para extraer de uno a dos milímetros de cada epifísis de un hueso y utilice una jeringa de dos o cinco mililitros equipada con una aguja de calibre 30 cargada con PBS fresco más FBS para vaciar la médula ósea de ambos extremos del hueso en un tubo centrífugo de 15 mililitros.Cuando la médula se ha recogido de cada uno de los huesos, pele el gestion de las células óseas por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en 2,5 mililitros de tampón de lysis de glóbulos rojos durante dos a tres minutos a temperatura ambiente. Después de la lesión, filtre las células a través de un colador celular de 100 micrómetros en un nuevo tubo centrífuga de 15 mililitros y restaure la tenacidad con 12 mililitros de PBS más FBS. Re-suspender el pellet en DMEM, complementado con 10%FBS y antibióticos para el conteo y placa de cinco a 10 veces 10 a la sexta célula de médula ósea en un 10 centímetros, cultivo no tejido tratado petri en 10 mililitros de DMEM complementado con suero y factor estimulante de colonia de macrófagos, o MCSF.En el quinto día de cultivo, incline cuidadosamente el plato de cultivo celular y retire todos los mililitros de medio, excepto aproximadamente, de la superficie cerca del borde del plato. Luego agregue 20 mililitros de medio fresco de 37 grados Celsius complementados con FBS y MCSF al plato y devuelva las células a la incubadora de cultivo celular. Para cosechar las células, en el día seis a siete, retire todas las células medianas y flotantes y lave el cultivo con 37 grados Celsius PBS.Separe las células adherentes con cinco mililitros de 0.02%EDTA y PBS durante tres a cinco minutos a 37 grados Celsius en la incubadora de cultivo de tejido y use una pipeta de cinco mililitros para lavar suavemente las células disociadas del fondo de la placa. Luego transfiera las células a un tubo centrífugo de 50 mililitros que contenga 25 mililitros de PBS fresco. Para inducir la expresión de proteínas etiquetadas por EGFP en células que presentan antígenos derivados de la médula ósea, al principio del protocolo de diferenciación celular, diluir las células de la médula ósea a una de dos a cinco veces 10 a las sextas células por mililitros de DMEM más FBS y la coninación de antibióticos y placar las células de un mililitro de medio por pozo, complementadas con la citoquina de diferenciación adecuada.Después de cuatro a seis horas en la incubadora de cultivo celular, añadir dos mililitros de la primera ronda de virus recogidos complementados con polibreno y transducir los cultivos celulares por centrifugación y una incubación de cuatro horas en la incubadora de cultivo celular. Al final del período de transducción, transfiera las células no adherentes de cada pozo a tubos centrífugos individuales de 15 mililitros y recoja las células por centrifugación. Si se necesita una mayor cantidad de células, las células pueden ser infectadas con el mismo constituido en múltiples pozos y agrupados antes de la diferenciación.Luego re-suspende los pellets en 10 mililitros de medio de cultivo complementados con la citoquina de diferenciación apropiada y placar las células en un 10 centímetros no tejido cultivo tratado petri plato por tubo, para su cultivo de seis a ocho días, como acaba de demostrar. La evaluación de la eficacia de la transfección Platinum Eco por citometría de flujo después de la recogida del segundo virus que contiene sobrenadato revela una eficiencia media de transfección del 62% para PSTPIP2-EGFP y del 53% para OPAL1-EGFP. La transducción retroviral no afecta al estado de diferenciación de las células derivadas de la médula ósea con más del 90% de las células en ambos cultivos que demuestran positividad para sus respectivos marcadores después de la transducción con cualquiera de los dos virus.Y con los cambios morfológicos apropiados y característicos observados para ambos tipos de células diferenciadas. Cabe destacar que la expresión general de EGFP fue menor en los cultivos celulares dendríticos derivados de la médula ósea en comparación con la expresión de EGFP de macrófagos derivados de la médula ósea, independientemente del tipo de retrovirus. Al intentar este procedimiento, es importante recordar el uso de platos plásticos no tejidos, tratados con cultivos que se utilizan normalmente para el cultivo de bacterias si planea eliminar las células del plato para el experimento.Después de este procedimiento, se pueden emplear otros métodos de imágenes de células vivas, microscopía de superrescía u otros tipos de microscopía para responder preguntas adicionales sobre la localización subcelular y la dinámica de las proteínas de celda dendrítica y macrófagos de interés. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología exploraran la distribución y las relaciones espaciales de las proteínas expresadas por macrófagos y células dendríticas y en promover nuestra comprensión de la función de estas proteínas durante las respuestas inmunitarias. No olvide que trabajar con partículas virales puede ser extremadamente peligroso y que las precauciones, como la minimización de la generación de aerosoles, el uso de equipos de protección y el uso de una capucha de flujo laminar, siempre deben tomarse durante la realización de este procedimiento.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Cultura de células dendríticas mieloides a partir de precursores de médula ósea

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Investigación

Biología

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Generación de médula ósea procedentes de células murinas dendríticas para su uso en dos fotones de imágenes

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Marcaje fluorescente de COS-7 Expresando etiqueta SNAP-proteínas de fusión de imágenes de células vivas

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

El uso de un contador de células automatizado para simplificar estudios de expresión génica: siRNA Derribo de IL-4 la expresión génica en células dependientes Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Fotoconversión purificada de proteínas fluorescentes y de doble sonda óptica destacar en células vivas

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

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Péptidos de la Biblioteca de Phage Display modular la expresión génica en las células mesenquimales y potenciar la osteogénesis en defectos óseos unicorticales

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Fluorescente verde a base de proteína Expresión Proyección de proteínas de membrana en<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...