Name: expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow-derived dendritic cells and macrophages
Uploaded: 2018-10-30T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages at JoVE.com

Detta arbete fick stöd av tjeckiska Science Foundation (GACR) (projektnummer 16-07425S), av Charles universitet Grant byrån (GAUK) (projektnummer 923116) och av institutionell finansiering från Institutet för molekylär genetik, akademin av vetenskaper av tjeckiska Republiken (RVO 68378050).

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av utskottet Expert om välfärd av experimentella djur av Institutet för molekylär genetik och av Vetenskapsakademien i Tjeckien.
1. REAGENSBEREDNING
<ol><li>Förbereda ammonium-klorid-kalium (ACK) bufferten. Tillsätt 4.145 g NH4Cl och 0,5 g KHCO3 till 500 mL ddH2O, sedan Tillsätt 100 µL 0,5 M etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) och filter-sterilisera.</li>
	<li>Bered polyethylenimine (PEI). ...

<ol>
	<li>Moghaddam, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity,+polarization+and+function+in+health+and+disease.">Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease.</a> Journal of Cellular Physiology. , (2018).</li><li>Qian, C., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+the+regulation+of+immunity+and+inflammation.">Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation.</a> Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).</li><li>Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function:+from+mechanisms+to+disease.">Neutrophil function: from mechanisms to disease.</a> Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).</li><li>Kondo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+and+myeloid+lineage+commitment+in+multipotent+hematopoietic+progenitors.">Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors.</a> Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).</li><li>Andrews, T., Sullivan, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+in+patients+with+inherited+defects+in+phagocytic+function.">Infections in patients with inherited defects in phagocytic function.</a> Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).</li><li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+biology+in+development,+homeostasis+and+disease.">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li><li>Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+factor+in+L-cell+conditioned+medium+capable+of+stimulating+colony+formation+by+mouse+marrow+cells+in+culture.">Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture.</a> Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).</li><li>Scheicher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+GM-CSF+induces+in+vitro+differentiation+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow.">Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).</li><li>Stanley, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+colony-stimulating+factor,+CSF-1.">The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1.</a> Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).</li><li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow.">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).</li><li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor.">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li><li>Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+non-equivalence+of+murine+(monocyte-)+macrophage+cells+in+biomaterial+and+inflammatory+models.">Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).</li><li>Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein:+a+perspective.">Green fluorescent protein: a perspective.</a> Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+In+Vivo+Imaging+Using+Fluorescent+Proteins.">Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).</li><li>Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+fluorescent+proteins.">Flow cytometry of fluorescent proteins.</a> Methods. 57 (3), 318-330 (2012).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+exogenous+genes+in+macrophages:+obstacles+and+opportunities.">The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities.</a> Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).</li><li>Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tolerance+induction+in+major+histocompatibility+complex+class+II-restricted+T+cells+specific+for+a+blood-borne+self-antigen.">Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen.</a> Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).</li><li>Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Characterization+of+the+New+Osteoclast+Progenitor+with+Macrophage+Phenotypes+Being+Able+to+Differentiate+into+Mature+Osteoclasts.">Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).</li><li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pCL+vector+system:+rapid+production+of+helper-free,+high-titer,+recombinant+retroviruses.">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).</li><li>Janssen, E., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptor+proteins+in+lymphocyte+activation.">Adaptor proteins in lymphocyte activation.</a> Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).</li><li>Ferguson, P. J., Laxer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+discoveries+in+CRMO:+IL-1beta,+the+neutrophil,+and+the+microbiome+implicated+in+disease+pathogenesis+in+Pstpip2-deficient+mice.">New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).</li><li>Holleman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+outcome+predictor+in+acute+leukemia+1+(OPAL1)+gene+is+not+an+independent+prognostic+factor+in+patients+treated+according+to+COALL+or+St+Jude+protocols.">Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols.</a> Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).</li><li>Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+Differentiation+of+Murine+Myeloid+Precursor+32D/G-CSF-R+Cells.">Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).</li><li>Kralova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transmembrane+Adaptor+Protein+SCIMP+Facilitates+Sustained+Dectin-1+Signaling+in+Dendritic+Cells.">The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).</li><li>Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960 (2014).</li><li>Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protocol+for+efficient+transfection+of+dendritic+cells+without+cell+maturation.">Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766 (2011).</li><li>Siegert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+siRNA+into+mouse+bone+marrow-derived+macrophages+and+dendritic+cells.">Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery:+Potential+Applications+for+Gene+and+Cell-Based+Therapies+in+the+New+Era+of+Personalized+Medicine.">Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine.</a> Genes &amp; Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li><li>Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+progress+in+gene+delivery+technology+based+on+chemical+methods+and+nano-carriers.">Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers.</a> Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).</li><li>Muruve, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome+recognizes+cytosolic+microbial+and+host+DNA+and+triggers+an+innate+immune+response.">The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response.</a> Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).</li><li>Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+humoral+immune+responses+to+viral+antigens+create+barriers+to+lung-directed+gene+therapy+with+recombinant+adenoviruses.">Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses.</a> Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).</li><li>Tallone, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+adenovirus+gene+delivery.">A mouse model for adenovirus gene delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).</li><li>Milone, M. C., O'Doherty, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+use+of+lentiviral+vectors.">Clinical use of lentiviral vectors.</a> Leukemia. , (2018).</li><li>McTaggart, S., Al-Rubeai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+vectors+for+human+gene+delivery.">Retroviral vectors for human gene delivery.</a> Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transience+of+transient+overexpression.">The transience of transient overexpression.</a> Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).</li></ol>

Uttrycket av protein sevärdheter i målceller är ett viktigt steg i många typer av biologiska studier. Differentierade makrofager och dendritiska celler är svåra att transfect av standard transfection och retrovirala transduktion tekniker. Förbi transfection dessa differentierade celler med retrovirala transduktion av benmärgen progenitorceller, följt av differentiering när de redan bär den önskvärda bygga, är ett viktigt steg så att uttrycket av ektopisk cDNAs i dessa celltyper. Ett exempel på framgångsr...

Myeloida celler utgör en oumbärlig del av vår försvarsmekanismer mot patogener. De har möjlighet att snabbt eliminera mikrober, liksom döende celler. Dessutom, är de också involverade i regleringen av vävnad utveckling och reparation och att upprätthålla homeostas1,2,3. Alla myeloida celler skilja från vanliga myeloida i benmärgen. Deras differentiering till många funktionellt och morfologiskt skilda grupper är i stor utsträckning kontrolleras av cytokiner och deras olika kombinationer4. Mest intensivt studerade myeloida cell delmängder inkluderar neutrofila granulocyter, makrofager och dendritiska celler. Defekter i någon av dessa populationer leda till potentiellt livshotande konsekvenser och orsaka svår dysfunktioner av immunsystemet hos människor och möss1,2,3,5, 6.
Till skillnad från neutrofila granulocyter, dendritiska celler och makrofager är vävnad bosatt celler och deras överflöd i immun organ är relativt låg. Som ett resultat, är isolering och rening av primära dendritiska celler och makrofager för experiment som kräver ett stort antal av dessa celler dyra och ofta omöjligt. För att lösa problemet, har protokoll utvecklats för att få stora mängder homogen makrofager och dendritiska celler in vitro. Dessa metoder är baserade på differentieringen av murina benmärgsceller i närvaro av cytokiner: makrofag granulocytkolonistimulerande faktor (M-CSF) för makrofager och granulocyt-makrofag granulocytkolonistimulerande faktor (GM-CSF) eller Flt3 ligand för dendritiska celler7,8,9,10,11,12. Celler som genereras av denna metod beskrivs ofta i litteraturen som benmärg härrör makrofager (BMDMs) och benmärg härrör dendritiska celler (BMDCs). De har mer fysiologiska egenskaper gemensamt med primära makrofager och dendritiska celler än med motsvarande cell linjer. En annan stor fördel är möjligheten att få dessa celler bildar genetiskt modifierade möss13. Jämförande studier mellan vildtyps-celler och celler som härrör från genetiskt modifierade möss är ofta avgörande för avslöjande roman funktioner av gener eller proteiner av intresse.
Analysen av subcellulär lokalisering av proteiner i levande celler kräver kopplingen av en fluorescerande etikett till proteinet av intresse i vivo. Detta uppnås vanligen genom att uttrycka genetiskt kodade fusion konstruktion består av en analyserade protein tillsammans (ofta via en kort länkare) till ett fluorescerande protein (t.ex., grönt fluorescerande protein (GFP))14,15 , 16. uttrycket av fluorescently märkta proteiner i dendritiska celler eller makrofager är utmanande. Dessa celler är generellt svåra att transfect av standard transfection förfaranden och effektivitetsvinsterna tenderar att vara mycket låg. Dessutom transfection är övergående, det genererar cellulär stress och uppnådda intensiteten av fluorescens kan inte räcka för mikroskopi17. För att få en rimlig andel av dessa celler med en tillräcklig nivå av transgenens uttryck, infektionen av benmärg stamceller med retrovirala har vektorer och deras efterföljande differentiering till BMDMs eller BMDCs blivit en mycket effektiv tillvägagångssätt. Det är tillåtet för analys av proteinerna av myeloisk ursprung i deras infödda cellulära miljön, både i ett stabilt tillstånd eller under processer som är kritiska för immunsvar som fagocytos, immunologisk synaps bildandet eller migration. Här beskriver vi ett protokoll som tillåter stabil uttrycket av fluorescently märkta proteiner intresset murina benmärgen härrör makrofager och dendritiska celler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>15028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>10270</td>
			<td>For media suplementation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Lachema, Brno, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>BB Pharma AS, Prague, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PENICILIN G 1,0 DRASELN&#193; SOL&#39; BIOTIKA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>S9137</td>
			<td>Streptomycin sulfate salt powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Dr. Kulich Pharma, Hradec Kr&#225;lov&#233;, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, linear, MW 25,000</td>
			<td>Polyscience, Warrington, PA, USA</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>101212</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>123110</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>117310</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)</td>
			<td>315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>H1398</td>
			<td>flow cytometry analysis use at 1-2 &#181;g/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow-derived dendritic cells and macrophages

Dendritiska celler och makrofager är avgörande celler som bildar den första försvarslinjen mot patogener. De kan också spela viktiga roller i inledandet av ett adaptivt immunsvar. Experimentellt arbete med dessa celler är ganska utmanande. Deras överflöd i organ och vävnader är relativt låg. Som ett resultat, kan inte de isoleras i stort antal. De är också svårt att transfect med cDNA konstruktioner. I murina modellen, kan dessa problem delvis övervinnas genom in vitro- differentiering från benmärgen stamfäder i närvaro av M-CSF för makrofager eller GM-CSF för dendritiska celler. På detta sätt är det möjligt att få stora mängder av dessa celler från mycket få djur. Dessutom kan benmärgen föräldraparets vara sensorik med retrovirala vektorer bära cDNA konstruktioner under tidiga stadier av odling före deras differentiering till benmärgen härrör dendritiska celler och makrofager. Retrovirala transduktion följt av differentiering in vitro- kan således användas för att uttrycka olika cDNA konstruktioner i dessa celler. Förmågan att uttrycka ektopisk proteiner avsevärt utökar räckvidden för experiment som kan utföras på dessa celler, inklusive levande cell avbildning av fluorescerande proteiner, tandem reningar för interactome analyser, struktur och funktion analyser, övervakning av cellulära funktioner med biosensorer och många andra. I den här artikeln beskriver vi ett detaljerat protokoll för retrovirala transduktion murina benmärgen härrör dendritiska celler och makrofager med vektorer som kodar för proteiner som fluorescently-taggade. Exemplet med två adapter proteiner, OPAL1 och PSTPIP2, bevisa vi dess praktiska tillämpning i flödescytometri och mikroskopi. Vi diskuterar också fördelarna och begränsningarna med denna metod.

Signalering adapter proteiner är vanligtvis små proteiner utan någon enzymaktivitet. De besitter olika interaktion domäner eller motiv, som medlar bindning till andra proteiner involverade i signaltransduktion, inklusive tyrosinkinaser, fosfataser, ubiquitin ligases och andra21. För demonstration av funktionerna i detta protokoll valdes myeloida cell adaptrar PSTPIP2 och OPAL1. PSTPIP2 är ett väl karakteriserade protein som är involverade i regleringen av i...

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages at JoVE.com

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Uttryck för fluorescerande fusionsproteinerna i murina benmärg-derived dendritiska celler och makrofager

I denna artikel ger vi ett detaljerat protokoll för uttrycket av fluorescerande fusionsproteinerna i murina benmärgen härrör dendritiska celler och makrofager. Metoden är baserad på transduktion av benmärg föräldraparets med retrovirala konstruktioner följt av differentiering till makrofager och dendritiska celler in vitro.

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom makrofag och dendritisk cellbiologi om subcellulär lokalisering och dynamik av olika proteiner i dessa celltyper. De viktigaste fördelarna med denna teknik är att det är relativt enkelt, billigt, och visar en bättre effektivitet och stabilitet i uttryck än majoriteten av andra tillgängliga metoder. Demonstrera förfarandet kommer att Jarmila Kralova, en grad student från mitt laboratorium.För att producera retrovirus, platta en encellig suspension av Platinum Eco-förpackning celler i en 10 centimeter petriskål och odla cellerna i 15 milliliter DMEM, kompletteras med 10%fetala nötkreatur serum, eller FBS, tills kulturen är 50 till 60%confluent. Nästa dag, tillsätt 20 mikrogram av den retrovirala konstruktionen av intresse och 10 mikrogram PCL eco-förpackning vektor till 1 milliliter DMEM utan serum, med skonsam blandning. Tillsätt 75 mikroliter pei i 1 milliliter DMEM utan serum och antibiotika till ett andra rör för en fem minuters inkubering vid rumstemperatur, och blanda innehållet i båda rören tillsammans för ytterligare 10 minuters inkubation vid rumstemperatur.Därefter byter du försiktigt ut mediet på Platinum Eco-cellerna med 8 milliliter av färsk 37 grader Celsius DMEM kompletterad med 2%FBS och tillsätt noggrant transfektionsblandningen i droppar till plattan. Efter en 4 timmars inkubation vid 37 grader Celsius, ersätta supernatent med 10 milliliter av 37 grader Celsius DMEM, kompletterad med 10%FBS för en 24 timmars inkubation vid 37 grader Celsius. Nästa dag, använd en 5 milliliter pipett för att överföra den ekotropiska retrovirala partikelinnehållande supernatent till en 15 milliliter centrifuge röret och ta bort skräp och innehållande celler genom centrifugering.Under tiden, tillsätt 10 milliliter av 37 grader Celsius DMEM plus 10% FBS till kultur skålen för en annan 24 timmars inkubation vid 37 grader Celsius och samla en andra omgång av viruspartiklar som just visat. För att skörda benmärgen, i en vävnadskultur huva, använda pincett och sax för att ta bort huden och en del av musklerna från bakbenen och försiktigt rubba acetabulum från höftleden utan att bryta lårbenet. Skär tassarna vid fotlederna och spraya benen med 70%etanol.Ta sedan bort resten av muskeln med en pappershandduk och placera benen i en 5 centimeter petriskål pbs kompletteras med 2%FBS. Därefter böj knäleden i varje benset och separera noggrant benen med sax. Använd saxen för att ta bort ungefär en till två millimeter av varje epifys av ett ben och använd en två eller fem milliliter spruta utrustad med en 30 gauge nål laddad med färska PBS plus FBS för att spola benmärgen från båda ändarna av benet i en 15 milliliter centrifuge röret.När märgen har samlats in från vart och ett av benen, pelleten bencellerna genom centrifugeringen och åter upphäva pelleten i 2,5 milliliter av röda blodkroppar lys buffert för två till tre minuter vid rumstemperatur. Efter ljustring, filtrera cellerna genom en 100 mikrometer cell sil i en ny 15 milliliter centrifugrör och återställa envishet med 12 milliliter PBS plus FBS. Åter upphäva pelleten i DMEM, kompletteras med 10%FBS och antibiotika för räkning och platta fem till 10 gånger 10 till den sjätte benmärg celler i en 10 centimeter, icke-vävnad kulturbehandlade petriskål i 10 milliliter dmem kompletteras med serum och makrofag koloni stimulerande faktor, eller MCSF.På dag fem av kultur, försiktigt luta cellodling skålen och ta bort alla men cirka 5 milliliter medium från ytan nära kanten av skålen. Tillsätt sedan 20 milliliter färska 37 grader Celsius medium kompletterat med FBS och MCSF till skålen och returnera cellerna till cellodlingsinkubatorn. För att skörda cellerna, på dag sex till sju, ta bort alla medium och flytande celler och tvätta kulturen med 37 grader Celsius PBS.Lösgör de vidhäftande cellerna med fem milliliter på 0,02%EDTA och PBS i tre till fem minuter vid 37 grader Celsius i vävnadskulturinkubatorn och använd en fem milliliterpipett för att försiktigt spola de dissocierade cellerna från plattans botten. Överför sedan cellerna till ett centrifugrör på 50 milliliter som innehåller 25 milliliter färsk PBS. Att inducera EGFP taggade protein uttryck i benmärg härledd antigen presentera celler, i början av cellen differentiering protokollet, späda benmärgen cellerna till en två till fem gånger 10 till sjätte celler per milliliter av DMEM plus FBS och antibiotika conentration och platta cellerna i en milliliter av medium per brunn, kompletteras med lämplig differentiering cytokin.Efter fyra till sex timmar i inkubatorn för cellodling, tillsätt två milliliter av den första omgången av insamlade virus kompletteras med polybrene och transduce cellkulturerna genom centrifugeringen och en fyra timmars inkubation i cellkulturen inkubator. Vid slutet av transduktionsperioden, överför nonadherent cellerna från varje brunn i enskilda 15 milliliter centrifugrör och samla in cellerna genom centrifugering. Om större mängd celler behövs, kan cellerna infekteras med samma constract i flera brunnar och poolas före differentiering.Sedan åter upphäva pellets i 10 milliliter av odling medium kompletteras med lämplig differentiering cytokin och platta cellerna på en 10 centimeter icke vävnad kulturbehandlade petriskål per rör, för deras sex till åtta dagars kultur, som just visat. Utvärdering av effekten av Platinum Eco-transfektion genom flödescytometri efter insamling av det andra viruset som innehåller supernatent avslöjar en genomsnittlig transfektionseffektivitet på 62%för PSTPIP2-EGFP och 53%för OPAL1-EGFP. Retroviral transduktion påverkar inte differentieringsstatusen för benmärgen härledda celler med mer än 90%av cellerna i båda kulturerna som visar positivitet för sina respektive markörer efter transduktion med antingen virus.Och med lämpliga, karakteristiska morfologiska förändringar som observerats för båda typerna av differentierad cell. Notera, det övergripande uttrycket för EGFP var lägre i benmärg härledd dendritiska cellkulturer jämfört med benmärg härledd makrofag EGFP uttryck, oavsett typ av retrovirus. Samtidigt försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att använda icke vävnad, kulturbehandlade plast rätter som vanligtvis används för att odla bakterier om du planerar att ta bort celler från skålen för experiment.Efter detta förfarande, andra metoder levande cell imaging, super upplösning mikroskopi eller andra typer av mikroskopi kan användas för att svara på ytterligare frågor om sub-cellulära lokalisering och dynamik dendritiska cell och makrofag proteiner av intresse. Denna teknik banade väg för forskare inom immunologi området att utforska distribution och spacial relationer av proteiner som uttrycks av makrofager och dendritiska celler och att främja vår förståelse av funktionen av dessa protein under immunsvar. Glöm inte att arbeta med viruspartiklar kan vara extremt farligt och att försiktighetsåtgärder, såsom minimalisering aerosol generation, bär skyddsutrustning, och med hjälp av en laminär flöde huva, bör alltid vidtas när du utför denna procedur.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Kultur av myeloisk dendritiska celler från benmärg prekursorer

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Generering av benmärg härledda Murine dendritiska celler för användning i 2-fotonen Imaging

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Beredningen av primära hematopoietisk cell kulturer från Murine Bone Marrow för elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färgning av proteinerna i geler med Coomassie G-250 utan organiska lösningsmedel och ättiksyra

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Fluorescerande märkning av COS-7 uttrycka SNAP-tagg fusionsproteiner för levande cell imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Hjälp av ett automatiserat celltalsräknare att förenkla Studier Gene Expression: siRNA Knockdown av IL-4 beroende genuttryck i Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Photoconversion renat fluorescerande proteiner och Dual-probe optisk markering i levande celler

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

Peptider från Phage Display Library modulera genuttryck i mesenkymala celler och potentiera Osteogenesis i Unicortical bendefekter

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grönt fluorescerande protein-baserad expressions Screening av membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...