Name: expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow-derived dendritic cells and macrophages
Uploaded: 2018-10-30T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages at JoVE.com

Bu eser tarafından Çek Bilim Vakfı (GACR) (proje numarası 16-07425S), Charles Üniversitesi Grant Ajansı (Saung) (proje numarası 923116) tarafından ve kurumsal finansman Enstitüsü, moleküler genetik üzerinden, Çek Bilimler Akademisi tarafından desteklenen Cumhuriyeti (RVO 68378050).

Burada açıklanan tüm yöntemleri, deneysel hayvan refah moleküler genetik Enstitüsü uzman Komitesi ve Çek Cumhuriyeti Bilimler Akademisi tarafından onaylanmış olması.
1. reaktif hazırlık
<ol><li>Amonyum klorür potasyum (ACK) arabellek hazırlayın. NH4Cl 4.145 g ve 0.5 g KHCO3 GKD2O, 500 mL için eklemek sonra 0, 5 M ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) 100 µL eklemek ve filtre sterilize.</li>
	<li>Polyethylenimine (PEI) çözüm hazırlamak....

<ol>
	<li>Moghaddam, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity,+polarization+and+function+in+health+and+disease.">Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease.</a> Journal of Cellular Physiology. , (2018).</li><li>Qian, C., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+the+regulation+of+immunity+and+inflammation.">Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation.</a> Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).</li><li>Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function:+from+mechanisms+to+disease.">Neutrophil function: from mechanisms to disease.</a> Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).</li><li>Kondo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+and+myeloid+lineage+commitment+in+multipotent+hematopoietic+progenitors.">Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors.</a> Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).</li><li>Andrews, T., Sullivan, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+in+patients+with+inherited+defects+in+phagocytic+function.">Infections in patients with inherited defects in phagocytic function.</a> Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).</li><li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+biology+in+development,+homeostasis+and+disease.">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li><li>Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+factor+in+L-cell+conditioned+medium+capable+of+stimulating+colony+formation+by+mouse+marrow+cells+in+culture.">Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture.</a> Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).</li><li>Scheicher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+GM-CSF+induces+in+vitro+differentiation+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow.">Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).</li><li>Stanley, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+colony-stimulating+factor,+CSF-1.">The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1.</a> Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).</li><li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow.">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).</li><li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor.">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li><li>Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+non-equivalence+of+murine+(monocyte-)+macrophage+cells+in+biomaterial+and+inflammatory+models.">Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).</li><li>Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein:+a+perspective.">Green fluorescent protein: a perspective.</a> Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+In+Vivo+Imaging+Using+Fluorescent+Proteins.">Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).</li><li>Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+fluorescent+proteins.">Flow cytometry of fluorescent proteins.</a> Methods. 57 (3), 318-330 (2012).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+exogenous+genes+in+macrophages:+obstacles+and+opportunities.">The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities.</a> Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).</li><li>Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tolerance+induction+in+major+histocompatibility+complex+class+II-restricted+T+cells+specific+for+a+blood-borne+self-antigen.">Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen.</a> Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).</li><li>Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Characterization+of+the+New+Osteoclast+Progenitor+with+Macrophage+Phenotypes+Being+Able+to+Differentiate+into+Mature+Osteoclasts.">Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).</li><li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pCL+vector+system:+rapid+production+of+helper-free,+high-titer,+recombinant+retroviruses.">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).</li><li>Janssen, E., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptor+proteins+in+lymphocyte+activation.">Adaptor proteins in lymphocyte activation.</a> Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).</li><li>Ferguson, P. J., Laxer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+discoveries+in+CRMO:+IL-1beta,+the+neutrophil,+and+the+microbiome+implicated+in+disease+pathogenesis+in+Pstpip2-deficient+mice.">New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).</li><li>Holleman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+outcome+predictor+in+acute+leukemia+1+(OPAL1)+gene+is+not+an+independent+prognostic+factor+in+patients+treated+according+to+COALL+or+St+Jude+protocols.">Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols.</a> Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).</li><li>Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+Differentiation+of+Murine+Myeloid+Precursor+32D/G-CSF-R+Cells.">Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).</li><li>Kralova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transmembrane+Adaptor+Protein+SCIMP+Facilitates+Sustained+Dectin-1+Signaling+in+Dendritic+Cells.">The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).</li><li>Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960 (2014).</li><li>Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protocol+for+efficient+transfection+of+dendritic+cells+without+cell+maturation.">Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766 (2011).</li><li>Siegert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+siRNA+into+mouse+bone+marrow-derived+macrophages+and+dendritic+cells.">Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery:+Potential+Applications+for+Gene+and+Cell-Based+Therapies+in+the+New+Era+of+Personalized+Medicine.">Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine.</a> Genes &amp; Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li><li>Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+progress+in+gene+delivery+technology+based+on+chemical+methods+and+nano-carriers.">Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers.</a> Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).</li><li>Muruve, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome+recognizes+cytosolic+microbial+and+host+DNA+and+triggers+an+innate+immune+response.">The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response.</a> Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).</li><li>Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+humoral+immune+responses+to+viral+antigens+create+barriers+to+lung-directed+gene+therapy+with+recombinant+adenoviruses.">Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses.</a> Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).</li><li>Tallone, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+adenovirus+gene+delivery.">A mouse model for adenovirus gene delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).</li><li>Milone, M. C., O'Doherty, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+use+of+lentiviral+vectors.">Clinical use of lentiviral vectors.</a> Leukemia. , (2018).</li><li>McTaggart, S., Al-Rubeai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+vectors+for+human+gene+delivery.">Retroviral vectors for human gene delivery.</a> Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transience+of+transient+overexpression.">The transience of transient overexpression.</a> Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).</li></ol>

Faiz hedef hücrelerdeki protein önemli bir adım biyolojik çalışmalar birçok türde ifadesidir. Farklılaştırılmış makrofaj ve dendritik hücreler retroviral iletim teknikleri ile standart transfection transfect zordur. Bu farklılaşmış hücreler transfection kemik iliği ataları, onlar zaten istenen yapı taşır farklılaşma tarafından takip retroviral iletim ile atlayarak ektopik cDNAs ifade bunları sağlayan kritik bir adımdır hücre tipleri. Bu yöntemin başarılı kullanım örneği bizim son y...

Myeloid hücrelerin patojenlere karşı savunma mekanizmaları vazgeçilmez bir parçası temsil eder. Onlar hızla mikroplar, hem de ölen hücreleri ortadan kaldırmak mümkündür. Buna ek olarak, onlar da doku gelişimi ve onarım düzenlenmesinde ve homeostasis1,2,3korumak yer alırlar. Kemik iliğinde ortak miyeloid ataları myeloid hücrelerin tümünü ayırt. Pek çok işlevsel ve morfolojik ayrı alt kümeleri içine onların farklılaşma sitokinler ve onların çeşitli kombinasyonları4tarafından kontrol edilen büyük ölçüde etmektir. Çalışılmış en myeloid hücre alt kümeleri nötrofilik granülosit, makrofajlar ve dendritik hücreleri içerir. Bu nüfusun herhangi bir kusurları sonuçları potansiyel olarak yaşamı tehdit eden ve neden ciddi işlev bozuklukları insan ve fare1,2,3,5, , bağışıklık sisteminin yol 6.
Nötrofilik granülosit, aksine dendritik hücreleri ve makrofajlar doku ikamet hücreleri ve bağışıklık organlarında kendi bereket nispeten düşük. Sonuç olarak, yalıtım ve arıtma birincil dendritik hücreleri ve makrofajlar bu hücreler çok sayıda gerektiren deneyler için pahalı ve sık sık imkansız. Bu sorunu çözmek için iletişim kuralları homojen makrofajlar veya dendritik hücreler içinde vitrobüyük miktarda elde etmek için geliştirilmiştir. Bu yaklaşımlar sitokinler huzurunda fare kemik iliği hücrelerinin farklılaşması üzerine dayanır: makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) makrofajlar ve granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) veya Flt3 ligand için için dendritik hücreler7,8,9,10,11,12. Bu yöntemle üretilen hücreler yaygın olarak kemik iliği makrofajlar (BMDMs) elde edilen ve kemik iliği dendritik hücreler (BMDCs) elde edilen literatürde açıklanmıştır. Onlar daha fazla fizyolojik özellikleri ile ortak birincil makrofajlar veya karşılık gelen hücre hatları ile dendritik hücreler daha vardır. Bu hücreler formu genetik olarak elde etme olasılığını fareler13değiştiren başka bir büyük avantaj sağlıyor. Vahşi tipi hücreler arasında karşılaştırmalı çalışmalar ve genetiği değiştirilmiş fare türetilmiş hücre kez genlerin ortaya çıkarılması roman işlevleri veya ilgi proteinler için önemlidir.
Canlı hücreler proteinlerin hücre altı yerelleştirme analiz faiz vivo içindeprotein flüoresan etiket bağlantı gerektirir. Bu en sık (sık sık bir kısa bağlayıcı) birleştiğinde bir analiz protein flüoresan bir protein oluşan genetik olarak kodlanmış füzyon yapı ifade ederek elde edilir (Örn., yeşil flüoresan protein (GFP))14,15 , 16. dendritik hücreler veya makrofajlar fluorescently tagged proteinler zorlu ifadesidir. Bu hücreler genellikle standart transfection yordamlar tarafından transfect zordur ve verimliliği çok düşük olma eğilimindedir. Ayrıca, transfection geçici, hücresel stres oluşturur ve elde yoğunluğunu floresans mikroskobu17için yeterli olmayabilir. Bu hücreler makul bir kısmını transgene ifade, enfeksiyon kemik iliği progenitör hücre retroviral ile yeterli bir düzeyde elde etmek için vektörel çizimler ve onların sonraki farklılaşma BMDMs veya BMDCs haline gelmiştir çok etkili yaklaşım. Kendi yerel hücresel ortamında, fagositoz, immünolojik synapse oluşumu veya geçiş gibi bağışıklık yanıtı için kritik olan işlemleri sırasında veya bir sabit durumda miyeloid kökenli proteinlerin analiz için izin verdi. Burada, biz fare kemik iliği türetilmiş makrofaj ve dendritik hücreler ilgi fluorescently tagged proteinlerin istikrarlı ifade sağlayan bir protokol tanımlamak.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>15028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>10270</td>
			<td>For media suplementation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Lachema, Brno, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>BB Pharma AS, Prague, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PENICILIN G 1,0 DRASELN&#193; SOL&#39; BIOTIKA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>S9137</td>
			<td>Streptomycin sulfate salt powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Dr. Kulich Pharma, Hradec Kr&#225;lov&#233;, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, linear, MW 25,000</td>
			<td>Polyscience, Warrington, PA, USA</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>101212</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>123110</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418</td>
			<td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td>
			<td>117310</td>
			<td>flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)</td>
			<td>315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>H1398</td>
			<td>flow cytometry analysis use at 1-2 &#181;g/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow-derived dendritic cells and macrophages

Dendritik hücreleri ve makrofajlar patojenlere karşı savunma ilk satırı oluşturan önemli hücrelerdir. Onlar da edinilmiş bağışıklık yanıtının başlama önemli rol oynarlar. Bu hücreler ile deneysel çalışma oldukça zordur. Onların bereket organ veya doku nispeten azdır. Sonuç olarak, onlar çok sayıda izole edemem. Onlar da cDNA yapıları ile transfect zordur. Fare modelinde, bu sorunların kısmen vitro farklılaştırma üzerinden M-CSF makrofajlar için veya GM-CSF dendritik hücreler için huzurunda kemik iliği ataları tarafından aşılabilir. Bu şekilde, bu hücreler büyük miktarda çok az hayvanlardan elde etmek mümkündür. Ayrıca, kemik iliği ataları cDNA yapıları ekimi onların farklılaşma kemik iliği türetilmiş dendritik hücreleri ve makrofajlar içine önce erken aşamalarında taşıyan retroviral vektörler ile transduced. Böylece, farklılaşma vitro tarafından takip retroviral iletim bu hücrelerde çeşitli cDNA yapıları ifade etmek için kullanılabilir. Ektopik proteinler önemli ölçüde hızlı yeteneği canlı hücre görüntüleme floresan proteinlerin, tandem purifications interactome analizleri, yapı-fonksiyon analizleri de dahil olmak üzere bu hücreler üzerinde gerçekleştirilen deneyler aralığı genişletir, biyosensörler ve diğerleri ile hücresel fonksiyonların izleme. Bu makalede, vektörel çizimler fluorescently öğesini proteinler için kodlama ile fare kemik iliği türetilmiş dendritik hücreleri ve makrofajlar retroviral iletim için detaylı bir protokol açıklamak. İki adaptör protein, OPAL1 ve PSTPIP2, örnek üzerinde Akış Sitometresi ve mikroskopi pratik uygulaması gösterilmektedir. Biz de avantaj ve sınırlamalar bu yaklaşımın tartışıyorlar.

Sinyal adaptör proteinlerinin enzimatik herhangi bir etkinliği olmayan genellikle küçük proteinlerdir. Sahip oldukları çeşitli etkileşim etki alanları veya diğer proteinler için bağlayıcı arabuluculuk motifleri Tirozin kinaz, fosfatazlar, Ubikuitin Ligazlar ve diğerleri de dahil olmak üzere sinyal iletimi içinde21dahil. Bu iletişim kuralının işlevselliğini gösteri için myeloid hücre adaptörleri PSTPIP2 ve OPAL1 seçildi. PSTPIP2 inflamatu...

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages at JoVE.com

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Kemik iliği türevi fare dendritik hücreleri ve makrofajlar floresan Fusion proteinlerin ifade

Bu makalede, biz fare kemik iliğinde floresan füzyon proteinlerin ifade için detaylı bir protokol dendritik hücreleri ve makrofajlar elde sağlar. Bu yöntem dayanır kemik iliği iletim üzerinde ataları ile retroviral yapıları farklılaşma içine makrofajlar tarafından izlenen ve dendritik hücreleri vitro.

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

Bu yöntem, bu hücre tiplerinde çeşitli proteinlerin alt hücresel lokalizasyonu ve dinamiği hakkında makrofaj ve dendritik hücre biyolojisi alanlarındaki anahtar soruların yanıtlatılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin başlıca avantajları nispeten basit, ucuz ve diğer mevcut yöntemlerin çoğunluğu daha iyi bir verimlilik ve ifade istikrarı göstermektedir. Prosedürü gösteren Jarmila Kralova, benim laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi olacak.Retrovirüs üretmek için, 10 santimetre petri kabında Platin Eko-ambalaj hücrelerinin tek hücreli süspansiyon plaka ve DMEM 15 mililitre hücreleri yetiştirmek, ile takviye 10%fetal sığır serum, veya FBS, kültür kadar 50-60%fluent. Ertesi gün, 20 mikrogram lık retroviral ilgi yapısı ve 10 mikrogram PCL eko-ambalaj vektörü 1 mililitre DMEM'e serumsuz, yumuşak karıştırma ile ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakikalık kuluçka için serum ve antibiyotik olmadan DMEM 1 mililitre PEI 75 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında ek bir 10 dakikalık kuluçka için birlikte her iki tüpün içeriğini karıştırın.Daha sonra, Platin Eco hücrelerindeki ortamı %2 FBS ile desteklenen 8 mililitre taze 37 derece Santigrat DMEM ile dikkatlice değiştirin ve transfeksiyon karışımını dikkatlice tabağa ekleyin. 37 santigrat derecede 4 saatlik kuluçkadan sonra, 37 santigrat derecede 24 saatlik kuluçka için %10 FBS ile desteklenen 37 santigrat derece dmem'in 10 mililitresi ile süpernatenti değiştirin. Ertesi gün, bir ecotropic retroviral parçacık içeren supernatent bir 15 mililitre centrifuge tüp aktarmak için 5 mililitrelik pipet kullanın ve enkaz kaldırmak ve santrifüj ile hücreleri içeren.Bu arada, 37 santigrat derece DMEM artı% 10 FBS 37 santigrat derece başka bir 24 saat kuluçka için kültür çanak 10 mililitre ekleyin ve viral parçacıkların ikinci bir tur toplamak gibi sadece gösterdi. Kemik iliği hasat için, bir doku kültürü başlık içinde, arka ekstremitederi ve kasların bir kısmını kaldırmak ve dikkatle femur bozmadan kalça ekleminden asetabulum çıkarmak için cımbız ve makas kullanın. Ayak bileği eklemlerinde pençeleri kesin ve% 70 etanol ile kemikleri sprey.Sonra bir kağıt havlu ile kas geri kalanı çıkarın ve PBS 5 santimetre petri çanak% 2 FBS ile desteklenen kemikleri yerleştirin. Daha sonra, her kemik seti diz eklemi bükmek ve dikkatle makas ile kemikleri ayırın. Bir kemiğin her epifiz yaklaşık bir ila iki milimetre kaldırmak için makas kullanın ve bir 15 mililitre santrifüj tüpü içine kemik her iki ucundan kemik iliği floş taze PBS artı FBS ile yüklü bir 30 gauge iğne ile donatılmış bir iki veya beş mililitreşli şırınga kullanın.Kemiklerin her birinden ilik toplandığında, kemik hücrelerini santrifüj le peletleyin ve oda sıcaklığında 2-3 dakika boyunca 2,5 mililitre kırmızı kan hücresi lisis tamponu ile yeniden askıya alın. Lysing sonra, yeni bir 15 mililitre santrifüj tüp içine 100 mikrometre hücresüz ile hücreleri filtre ve PBS artı FBS 12 mililitre ile muaşelik geri. DMEM pelet yeniden askıya, sayma için 10% FBS ve antibiyotikler ile takviye ve plaka beş ila 10 kez 10 bir altıncı kemik iliği hücrelerine 10 santimetre, doku dışı kültür dmem 10 mililitre de petri çanak tedavi serum ve makrofaj koloni uyarıcı faktör ile birlikte, veya MCSF.Kültürün beşinci gününde, hücre kültürünü dikkatlice yatırın ve yaklaşık 5 mililitre orta mililitresini yemeğin kenarına yakın yüzeyden çıkarın. Sonra çanak FBS ve MCSF ile desteklenen taze 37 derece santigrat orta 20 mililitre ekleyin ve hücre kültürü kuluçka hücreleri dönmek. Hücreleri hasat etmek için, altıncı ila yedi gün, tüm orta ve yüzen hücreleri kaldırmak ve 37 derece Santigrat PBS ile kültür yıkayın.Doku kültürü kuluçka makinesinde 37 santigrat derecede 3-5 dakika boyunca %0,02 EDTA ve PBS beş mililitreile yapışık hücreleri ayırın ve ayrık hücreleri plaka nın dibinden yavaşça temizlemek için beş mililitrelik pipet kullanın. Sonra hücreleri 25 mililitre taze PBS içeren 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücre farklılaşma protokolünün başında, kemik iliği türetilmiş antijen sunan hücrelerde EGFP etiketli protein ekspresyonunu indüklemek için, kemik iliği hücrelerini dMEM artı FBS mililitre başına altıncı hücrelere 2-5 kat seyreltmek ve antibiyotikler kontenjan ve plaka iyi başına orta bir mililitre hücreleri, uygun farklılaşma sitokin ile desteklenmektedir.Hücre kültürü kuluçka dört ila altı saat sonra, polibren ile desteklenen toplanan virüsün ilk turda iki mililitre ekleyin ve santrifüj ve hücre kültürü kuluçka dört saat kuluçka ile hücre kültürleri transduce. Transdüksiyon döneminin sonunda, her kuyudan yapışmayan hücreleri tek tek 15 mililitrelik santrifüj tüplere aktarın ve hücreleri santrifüj ile toplayın. Daha büyük miktarda hücre gerekiyorsa, hücreler birden fazla kuyuda aynı constract ile enfekte olabilir ve farklılaşma dan önce havuza.Daha sonra uygun diferansiyasyon sitokin ile desteklenen 10 mililitre kültür ortamıpeletyeniden askıya ve bir 10 santimetre olmayan doku kültürü üzerine hücreleri plaka tüp başına petri çanak tedavi, onların altı ila sekiz günlük kültür için, sadece gösterildiği gibi. Supernatent içeren ikinci virüsün toplanmasından sonra platin eko transfeksiyonun akış sitometrisi ile etkinliğinin değerlendirilmesi PSTPIP2-EGFP için ortalama transfeksiyon veriminin %62, OPAL1-EGFP için %53 olduğunu ortaya koymaktadır. Retroviral transdüksiyon, her iki kültürde de hücrelerin %90'ından fazlasında bulunan kemik iliği türemiş hücrelerinin farklılaşma durumunu etkilemez ve her iki virüsle de transdüksiyon sonrası kendi belirteçleri için pozitiflik gösterir.Ve her iki farklı hücre tipi için de uygun, karakteristik morfolojik değişiklikler gözlenir. Not, EGFP genel ekspresyonu kemik iliği kaynaklı dendritik hücre kültürlerinde kemik iliği kaynaklı makrofaj EGFP ekspresyonu ile karşılaştırıldığında, retrovirüs türü ne olursa olsun daha düşüktü. Bu prosedürü çalışırken, olmayan doku kullanmayı hatırlamak önemlidir, kültür genellikle deney için çanak hücreleri kaldırmak için planlıyorsanız bakteri yetiştirmek için kullanılan plastik yemekler tedavi.Bu prosedürü takiben, dendritik hücre ve makrofaj proteinlerinin alt hücresel lokalizasyonu ve dinamiği ile ilgili ek soruları cevaplamak için canlı hücre görüntüleme, süper çözünürlüklü mikroskopi veya diğer mikroskopi yöntemleri kullanılabilir. Bu teknik, makrofajlar ve dendritik hücreler tarafından ifade edilen proteinlerin dağılımını ve aralıklarını keşfetmede ve bağışıklık yanıtları sırasında bu proteinin işlevini anlamamızı ilerletmede immünoloji alanında araştırmacıların önünü açmıştır. Viral parçacıklarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve aerosol üretimini minimalize etmek, koruyucu ekipman takmak ve laminar akış başlığı kullanmak gibi önlemlerin bu işlemi gerçekleştirirken her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritik hücreler kemik iliği öncüleri Kültür

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Kemik İliği Üretimi 2-foton Görüntüleme Kullanım murin Dendritik Hücreler Türetilmiş

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Canlı Hücre Görüntüleme için SNAP-tag Fusion Proteinler ifade COS-7 Floresan Etiketleme

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Canlı Hücrelerde Floresan Proteinleri ve Çift prob Optik Vurgulama Saf, Fotoçevrim

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

Bakteriyofaj Görüntüleme Kütüphane Peptitler Mezenkimal Hücreler Gen ekspresyonunu modüle ve Unicortical Kemik Hastalıkları Osteogenezi potansiyalize

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...