Name: functional characterization of carboxylesterases in insecticide resistant house flies, musca domestica
Uploaded: 2018-08-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica at JoVE.com

1. uttrykk og isolasjon av målet proteiner med en Baculovirus-mediert insekt celle uttrykk
<ol><li>Directionally klone blunt endte PCR produkter av målet proteiner fra huse fluene.<ol>
<li>Utforme PCR primere grønne fluorescerende protein (GFP) og huset fly MdαE7 genet basert på deres sekvenser og de spesielle kravene til den valgte vektoren (tabell 1).</li>
		<li>Bruke en thermostable, korrekturlesing DNA polymerase og primere fra trinn 1.1.1 for å utføre en 150 µL PCR reaksjon (30 µL reaksjo...

<ol>
	<li>Scott, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insecticide+resistance+in+house+flies+from+the+United+States:+Resistance+levels+and+frequency+of+pyrethroid+resistance+alleles.">Insecticide resistance in house flies from the United States: Resistance levels and frequency of pyrethroid resistance alleles.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 377-384 (2013).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole+transcriptomal+linkage+analysis+of+gene+co-regulation+in+insecticide+resistant+house+flies,+Musca+domestica.">A whole transcriptomal linkage analysis of gene co-regulation in insecticide resistant house flies, Musca domestica.</a> BMC Genomics. 14, 803 (2013).</li><li>Liu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insecticide+resistance+in+mosquitoes:+impact,+mechanisms,+and+research+directions.">Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions.</a> Annual Review of Entomology. 60, 537-559 (2015).</li><li>Grigoraki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+and+genetic+study+reveal+amplified+carboxylesterase+genes+implicated+in+temephos+resistance,+in+the+Asian+tiger+mosquito+Aedes+albopictus.">Transcriptome profiling and genetic study reveal amplified carboxylesterase genes implicated in temephos resistance, in the Asian tiger mosquito Aedes albopictus.</a> e0003771. 9, e0003771 (2015).</li><li>Grigoraki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboxylesterase+gene+amplifications+associated+with+insecticide+resistance+in+Aedes+albopictus:+Geographical+distribution+and+evolutionary+origin.">Carboxylesterase gene amplifications associated with insecticide resistance in Aedes albopictus: Geographical distribution and evolutionary origin.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 11, e0005533 (2017).</li><li>Wheelock, C., Shan, G., Ottea, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+carboxylesterases+and+their+role+in+the+metabolism+of+insecticides.">Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides.</a> Journal of Pesticide Science. 30, 75-83 (2005).</li><li>Feng, X., Li, M., Liu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboxylesterase+genes+in+pyrethroid+resistant+house+flies,+Musca+domestica.">Carboxylesterase genes in pyrethroid resistant house flies, Musca domestica.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 30-39 (2018).</li><li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival:+application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assays.">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays.</a> J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li><li>Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus-insect+cell+expression+systems.">Baculovirus-insect cell expression systems.</a> Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).</li><li>Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+system+for+heterologous+multiprotein+complexes.">Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1583 (2004).</li><li>Gong, Y., Li, T., Feng, Y., Liu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+two+P450s,+CYP9M10+and+CYP6AA7,+in+the+permethrin+resistance+of+Culex+quinquefasciatus.">The function of two P450s, CYP9M10 and CYP6AA7, in the permethrin resistance of Culex quinquefasciatus.</a> Scientific Reports. 7 (1), 587 (2017).</li><li>Cao, C. W., Zhang, J., Gao, X. W., Liang, P., Guo, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+carboxylesterase+gene+associated+with+organophosphorous+insecticide+resistance+in+cotton+aphids,+Aphis+gossypii+(Glover).">Overexpression of carboxylesterase gene associated with organophosphorous insecticide resistance in cotton aphids, Aphis gossypii (Glover).</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 90 (3), 175-180 (2008).</li><li>Zhang, L., Gao, X., Liang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cypermethrin+resistance+associated+with+high+carboxylesterase+activities+in+a+strain+of+house+fly,+Musca+domestica+(Diptera:+Muscidae).">Beta-cypermethrin resistance associated with high carboxylesterase activities in a strain of house fly, Musca domestica (Diptera: Muscidae).</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 89, 65-72 (2007).</li><li>Van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sensitivity+assays:+the+MTT+assay.">Cell sensitivity assays: the MTT assay.</a> Cancer cell culture. , 237-245 (2011).</li><li>Stockert, J. C., Bl&#225;zquez-Castro, A., Ca&#241;ete, M., Horobin, R. W., Villanueva, &. #. 1. 9. 3. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MTT+assay+for+cell+viability:+Intracellular+localization+of+the+formazan+product+is+in+lipid+droplets.">MTT assay for cell viability: Intracellular localization of the formazan product is in lipid droplets.</a> Acta Histochemica. 114 (8), 785-796 (2012).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Riss, T. L., Moravec, R. A., Niles, A. L., Duellman, S., Benink, H. A., Worzella, T. J., Minor, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+viability+assays.">Cell viability assays.</a> Assay Guidance Manual. , (2013).</li><li>Wheelock, C. E., Shan, G., Ottea, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+carboxylesterases+and+their+role+in+the+metabolism+of+insecticides.">Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides.</a> Journal of Pesticide Science. 30 (2), 75-83 (2005).</li><li>Li, X., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+metabolic+resistance+to+synthetic+and+natural+xenobiotics.">Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics.</a> Annual Review of Entomology. 52, 231-253 (2007).</li><li>Nakamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+metabolism+of+a+pyrethroid+insecticide,+permethrin,+and+its+hydrolysis+products+in+rats.">The in vitro metabolism of a pyrethroid insecticide, permethrin, and its hydrolysis products in rats.</a> Toxicology. 235 (3), 176-184 (2007).</li><li>Kruger, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bradford+method+for+protein+quantitation.">The Bradford method for protein quantitation.</a> The protein protocols handbook. , 15-21 (2002).</li><li>Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+protein+production+using+the+Pichia+pastoris+expression+system.">Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system.</a> Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).</li><li>Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+system+for+heterologous+multiprotein+complexes.">Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1583 (2004).</li><li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+bacterial+expression+systems+for+heterologous+protein+production:+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems.">Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211 (2006).</li><li>Bulter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+a+fungal+laccase+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+directed+evolution.">Functional expression of a fungal laccase in Saccharomyces cerevisiae by directed evolution.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 69 (2), 987-995 (2003).</li><li>Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pitfalls+of+the+MTT+assay:+Direct+and+off-target+effects+of+inhibitors+can+result+in+over/underestimation+of+cell+viability.">Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability.</a> Gene. 574 (2), 193-203 (2015).</li></ol>

I de siste tiårene, har heterologous uttrykk systemer vært mye brukt til å uttrykke og isolere store mengder proteiner, slik at biokjemiske og funksjonelle besluttsomhet og karakterisering av enzymer i vitro. Hittil har flere forskjellige modellsystemer inkludert Escherichia coli, Pichia pastoris, Sacccharomyces cerevisiaeog Spodoptera frugiperda har blitt tilpasset for rekombinant protein uttrykk, og valget av den i vitro system er avgjørende for storskala genera...

Insektmiddel motstand er et stort problem av huset fly kontroll over hele verden1,2. Å bestemme mekanismen av insektmiddel motstand muliggjør bedre forståelse av dette problemet, og dermed gi romanen strategier for å effektivt forhindre eller redusere spredningen av resistens utvikling3. Carboxylesterases, som en av de viktigste avgiftning enzymene, har tiltrukket seg mye oppmerksomhet for sine roller i sequestering og metabolizing insektmidler i ulike insekter4,5,6. Våre tidligere studier har identifisert flere carboxylesterases i huset fluer og uttrykk nivåene var ikke bare constitutively opp-regulert i motstandsdyktig ALHF belastningen, men også kan bli overtalt til høyere nivåer svar permethrin behandlingene7 . Men gjenstår de funksjonell karakteristikkene av disse carboxylesterase gener i metabolizing insektmidler å bli utforsket.
Siden den første rapporten i tidlig 1980-tallet8, har en baculovirus-mediert utenlandske gene expression system vært viden ansatt på grunn av sin høye protein effektivitet og eukaryotic protein behandling evner9. Denne binært system består av to grunnleggende elementer: den konstruert rekombinant baculovirus levere utenlandsk gener i verten cellene, og den store uttrykket for interessert proteiner av celler som er infisert av rekombinant baculovirus. De siste tiårene, baculovirus mediert cellen uttrykk systemet har vært mye brukt til å produsere tusenvis av rekombinante proteiner, alt fra cytosolic enzymer membran-bundet proteiner i insekt og pattedyr cellene10. Vår forrige studie uttrykt ble flere CYP450 enzymer i insekt Sf9 celler med dette systemet11. I denne studien vi bygget en carboxylesterase-rekombinant baculovirus å infisere insekt Sf9 celler, utforsket celle toleransen til forskjellige permethrin behandlingene og store uttrykt carboxylesterase proteiner i vitro for funksjonell leting. I stedet for undersøke flere carboxylesterase isozyme blandinger fra insekt homogenates som ble vedtatt av tidligere studier12,13, baculovirus-mediert insekt celle uttrykk systemet lar bestemt uttrykket og isolering av målrettet proteiner for bedre karakteristikk av biokjemiske og strukturelle egenskapene.
Tetrazolium salt-baserte analysen (MTT) er en høy gjennomstrømming kolorimetrisk metode utviklet og optimalisert for å måle celle levedyktighet. Denne analysen er basert på mekanismen som bare levende celler kan metabolizing gul-farget MTT reagensen til en mørk lilla farget formazan bunnfall, som kan analyseres colorimetrically etter oppløst i organiske løsemidler14, 15. Flere mer nøyaktig, men tidkrevende metoder, for eksempel Trypan blå eksklusjon og de thymidine titrering analyse16,17, har blitt utviklet i de senere år. Imidlertid er cellebasert MTT analysen fortsatt anerkjent som den mest rask og lett å bruke metoden å raskt oppdage celle levedyktighet. Her bruker vi MTT analysen for å utforske celle toleransen mot insektmiddel behandlinger. Forbedret toleranse av celler når infisert med carboxylesterase rekombinant baculovirus sterkt støtter metabolske rollene som carboxylesterases til insektmidler som igjen antyder deres engasjement i insektmiddel motstand.
I tillegg ble i vitro metabolske analysen gjennomført i denne studien. Sammenlignet med generelle carboxylesterase analyser som bruker vanlige underlag som α-napthyl acetate (α-NA) og β-naphthyl acetate (β-NA) for å reflektere hydrolytisk aktivitetene til carboxylesterases, regnes i vitro metabolske studien som en nøyaktig måte mål av carboxylesterases mot insektmidler18direkte. Denne metoden har vært vellykket ansatt i ulike insekter som karakteriserer flere cytochrome P450s i samarbeid med insektmiddel motstand11,19,20. Men har denne metoden ikke ennå blitt brukt i carboxylesterase studier. Med anvendeligheten av carboxylesterase proteiner produsert av baculovirus-mediert uttrykk systemet, kan vi utføre en i vitro metabolske studie av carboxylesterases mot permethrin, som kan videre gir sterke bevis på engasjement av carboxylesterases i overdragelse pyrethroid motstand i huset flyr.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs inc.</td>
			<td>M0491L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen by life technology</td>
			<td>K240020</td>
			<td>S.O.C medium and universal M13 sequence primers were included in this kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Invitrogen by life technology</td>
			<td>K210002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway LR Clonase II Enzyme mix for BaculoDirectTM Kits</td>
			<td>Invitrogen by life technology</td>
			<td>11791-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit</td>
			<td>Invitrogen by life technology</td>
			<td>12562-019</td>
			<td>Cellfectin transfection reagent and ganciclovir were included in this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR-CAT plasmid</td>
			<td>Invitrogen by life technology</td>
			<td></td>
			<td>Included in BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit, concentration: 0.5 ug/uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated Fetal Bovine Serum, Certified</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>10082-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells in Sf-900 III SFM</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>12659017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction &#38; Lysis Buffer</td>
			<td>G Biosciences by A Geno Technology Inc</td>
			<td>786-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf-900 III SFM (1&#215;) Serum Free Medium Complete</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>12658-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#39;s Insect Medium, unsupplemented</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>11595030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permethrin (isomers) analytical standard</td>
			<td>SUPELCO by Solutions WithinTM</td>
			<td>442748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (analytical graded)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (analytical graded)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GHP Acrodisc 25 mm Syringe Filters with 0.45 &#956;m GHP Membrane (HPLC Certified)</td>
			<td>Pall Life Sciences</td>
			<td>21890388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alliance Waters 2695 HPLC System</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycle</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional characterization of carboxylesterases in insecticide resistant house flies, musca domestica

Carboxylesterase-mediert metabolisme antas å spille en viktig rolle i insektmiddel motstand i ulike insekter. Flere carboxylesterase gener ble funnet opp-regulert i resistente hus fly belastningen, mens deres roller i overdragelse insektmiddel motstand gjensto å bli utforsket. Her utviklet vi en protokoll for funksjonell karakterisering av carboxylesterases. Tre eksempel eksperimenter presenteres: (1) uttrykket og isolasjon av carboxylesterase proteiner gjennom et baculovirus-mediert insekt Spodoptera frugiperda (Sf9) cellen uttrykk systemet. (2) en cellebasert Flerbordsturnering (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-yl] -2, 5-diphenyltetrazolium bromide) cytotoksisitet analysen måle toleranse av insekt celler til forskjellige permethrin behandlinger; og (3) i vitro metabolske studier å utforske metabolske funksjonene til carboxylesterases mot permethrin. Carboxylesterase genet MdαE7 ble klonet fra en resistente hus fly belastning ALHF og brukes til å konstruere en rekombinant baculovirus Sf9 celler infisert. I celle viabilities mot ulike permethrin behandlingene ble målt med MTT analysen. Forbedret celle toleranse for forsøksgruppen (MdαE7-rekombinant baculovirus infiserte celler) sammenlignet med de av kontroll grupper (CAT-rekombinant baculovirus infiserte celler og GFP-rekombinant baculovirus infiserte celler) til permethrin behandlinger foreslått egenskapene til MdαE7 i metabolizing insektmidler, og dermed beskytte celler fra kjemisk skade. Bortsett fra det ble carboxylesterase proteiner uttrykt i insekt Sf9 celler og isolert for å gjennomføre en i vitro metabolske studie. Resultatene indikerte en betydelig i vitro metabolsk effektivitet av MdαE7 mot permethrin, indikerer direkte involvering av carboxylesterases i metabolizing insektmidler og dermed overdragelse insektmiddel motstand i huset fluer.

Cellen levedyktigheten mot ulike permethrin behandlingene (MTT analysen)
Cytotoksisitet av permethrin ble undersøkt i MdαE7-rekombinant baculovirus infisert Sf9 cellene (forsøksgruppen) og katten-rekombinant baculovirus (leveres av baculovirus infisert) infisert (kontroll grupper). Forbedret celle toleransen til permethrin i MdαE7 uttrykker celler sterkt støtte metabolske rollene som denne carboxylesterase mot insektmidler og ...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica at JoVE.com

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

Her presenterer vi en protokoll for å produsere huset fly carboxylesterase proteiner i vitro med en baculovirus mediert insekt celle uttrykk og senere funksjonelt karakterisere deres roller i metabolizing permethrin, dermed overdragelse pyrethroid motstand ved å gjennomføre cellebasert MTT analysen og i vitro metabolske studier.

Funksjonell karakteristikk av Carboxylesterases i insektmiddel resistente hus fluer, Musca Domestica

Carboxylesterase-mediated metabolism is thought to play a major role in insecticide resistance in various insects. Several carboxylesterase genes were ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Strukturelle karakteristikk av Mannan cellevegg polysakkarider i planter ved hjelp av TEMPO

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Forbedret protokollen for Chromatin Immunoprecipitation fra musen skjelettlidelser muskel

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakteristikk av glykoproteiner med immunglobulin Fold av Røntgenkrystallografi og Biofysiske teknikker

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerende sølv farging av proteiner i polyakrylamid Gels

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Rask fluorescens-baserte karakterisering av enkelt ekstracellulær blemmer i menneskelig blod hydrogenion sporing analyse

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Identifikasjon av funksjonelle Protein områder gjennom Chimeric Protein konstruksjon

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Karakterisering av membran transportører av Heterologous uttrykk i E. coli og produksjon av membran blemmer

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-bindende enheter (SUBEs) som verktøy for berikelse, isolasjon, identifisering og karakterisering av SUMO proteom i leverkreft

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Funksjonell karakterisering av RING-type E3 Ubiquitin Ligases in vitro og i planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Karakterisering av amyloid strukturer i aldring C. Elegans ved hjelp av fluorescens levetid imaging

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...