Name: functional characterization of carboxylesterases in insecticide resistant house flies, musca domestica
Uploaded: 2018-08-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica at JoVE.com

1. выражение и изоляции целевых белков с системой выражение бакуловирусы опосредованной насекомых ячейки
<ol><li>Направленно клонирования туп законченному продуктов ПЦР целевых белков из дома мух.<ol>
<li>Дизайн праймеры PCR зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) и дом летать MdαE7 гена, на осно...

<ol>
	<li>Scott, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insecticide+resistance+in+house+flies+from+the+United+States:+Resistance+levels+and+frequency+of+pyrethroid+resistance+alleles.">Insecticide resistance in house flies from the United States: Resistance levels and frequency of pyrethroid resistance alleles.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 377-384 (2013).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole+transcriptomal+linkage+analysis+of+gene+co-regulation+in+insecticide+resistant+house+flies,+Musca+domestica.">A whole transcriptomal linkage analysis of gene co-regulation in insecticide resistant house flies, Musca domestica.</a> BMC Genomics. 14, 803 (2013).</li><li>Liu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insecticide+resistance+in+mosquitoes:+impact,+mechanisms,+and+research+directions.">Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions.</a> Annual Review of Entomology. 60, 537-559 (2015).</li><li>Grigoraki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+and+genetic+study+reveal+amplified+carboxylesterase+genes+implicated+in+temephos+resistance,+in+the+Asian+tiger+mosquito+Aedes+albopictus.">Transcriptome profiling and genetic study reveal amplified carboxylesterase genes implicated in temephos resistance, in the Asian tiger mosquito Aedes albopictus.</a> e0003771. 9, e0003771 (2015).</li><li>Grigoraki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboxylesterase+gene+amplifications+associated+with+insecticide+resistance+in+Aedes+albopictus:+Geographical+distribution+and+evolutionary+origin.">Carboxylesterase gene amplifications associated with insecticide resistance in Aedes albopictus: Geographical distribution and evolutionary origin.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 11, e0005533 (2017).</li><li>Wheelock, C., Shan, G., Ottea, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+carboxylesterases+and+their+role+in+the+metabolism+of+insecticides.">Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides.</a> Journal of Pesticide Science. 30, 75-83 (2005).</li><li>Feng, X., Li, M., Liu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboxylesterase+genes+in+pyrethroid+resistant+house+flies,+Musca+domestica.">Carboxylesterase genes in pyrethroid resistant house flies, Musca domestica.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 30-39 (2018).</li><li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival:+application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assays.">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays.</a> J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li><li>Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus-insect+cell+expression+systems.">Baculovirus-insect cell expression systems.</a> Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).</li><li>Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+system+for+heterologous+multiprotein+complexes.">Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1583 (2004).</li><li>Gong, Y., Li, T., Feng, Y., Liu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+two+P450s,+CYP9M10+and+CYP6AA7,+in+the+permethrin+resistance+of+Culex+quinquefasciatus.">The function of two P450s, CYP9M10 and CYP6AA7, in the permethrin resistance of Culex quinquefasciatus.</a> Scientific Reports. 7 (1), 587 (2017).</li><li>Cao, C. W., Zhang, J., Gao, X. W., Liang, P., Guo, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+carboxylesterase+gene+associated+with+organophosphorous+insecticide+resistance+in+cotton+aphids,+Aphis+gossypii+(Glover).">Overexpression of carboxylesterase gene associated with organophosphorous insecticide resistance in cotton aphids, Aphis gossypii (Glover).</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 90 (3), 175-180 (2008).</li><li>Zhang, L., Gao, X., Liang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cypermethrin+resistance+associated+with+high+carboxylesterase+activities+in+a+strain+of+house+fly,+Musca+domestica+(Diptera:+Muscidae).">Beta-cypermethrin resistance associated with high carboxylesterase activities in a strain of house fly, Musca domestica (Diptera: Muscidae).</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 89, 65-72 (2007).</li><li>Van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sensitivity+assays:+the+MTT+assay.">Cell sensitivity assays: the MTT assay.</a> Cancer cell culture. , 237-245 (2011).</li><li>Stockert, J. C., Bl&#225;zquez-Castro, A., Ca&#241;ete, M., Horobin, R. W., Villanueva, &. #. 1. 9. 3. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MTT+assay+for+cell+viability:+Intracellular+localization+of+the+formazan+product+is+in+lipid+droplets.">MTT assay for cell viability: Intracellular localization of the formazan product is in lipid droplets.</a> Acta Histochemica. 114 (8), 785-796 (2012).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Riss, T. L., Moravec, R. A., Niles, A. L., Duellman, S., Benink, H. A., Worzella, T. J., Minor, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+viability+assays.">Cell viability assays.</a> Assay Guidance Manual. , (2013).</li><li>Wheelock, C. E., Shan, G., Ottea, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+carboxylesterases+and+their+role+in+the+metabolism+of+insecticides.">Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides.</a> Journal of Pesticide Science. 30 (2), 75-83 (2005).</li><li>Li, X., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+metabolic+resistance+to+synthetic+and+natural+xenobiotics.">Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics.</a> Annual Review of Entomology. 52, 231-253 (2007).</li><li>Nakamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+metabolism+of+a+pyrethroid+insecticide,+permethrin,+and+its+hydrolysis+products+in+rats.">The in vitro metabolism of a pyrethroid insecticide, permethrin, and its hydrolysis products in rats.</a> Toxicology. 235 (3), 176-184 (2007).</li><li>Kruger, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bradford+method+for+protein+quantitation.">The Bradford method for protein quantitation.</a> The protein protocols handbook. , 15-21 (2002).</li><li>Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+protein+production+using+the+Pichia+pastoris+expression+system.">Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system.</a> Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).</li><li>Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+system+for+heterologous+multiprotein+complexes.">Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1583 (2004).</li><li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+bacterial+expression+systems+for+heterologous+protein+production:+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems.">Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211 (2006).</li><li>Bulter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+a+fungal+laccase+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+directed+evolution.">Functional expression of a fungal laccase in Saccharomyces cerevisiae by directed evolution.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 69 (2), 987-995 (2003).</li><li>Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pitfalls+of+the+MTT+assay:+Direct+and+off-target+effects+of+inhibitors+can+result+in+over/underestimation+of+cell+viability.">Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability.</a> Gene. 574 (2), 193-203 (2015).</li></ol>

В последние десятилетия гетерологичных выражение системы широко использовались выразить и изолировать большое количество белков, таким образом позволяя биохимических и функциональных определение и характеристика ферментов в пробирке. На сегодняшний день, были адаптированы дл?...

Резистентность к инсектицидам в настоящее время является серьезной проблемой дом летать контроль во всем мире1,2. Попытки определить механизм инсектицидам способствует лучшему пониманию этого вопроса и таким образом обеспечивают Роман стратегии эффективно предотвратить или свести к минимуму Распространение сопротивления развития3. Carboxylesterases, как один из основных детоксикации ферментов, привлекли много внимания из-за их роли в поглощения и метаболизма инсектицидов в различных насекомых4,5,6. Наши предыдущие исследования выявил несколько carboxylesterases в доме мух и их уровни выражения были не только конститутивно вверх регулируются резистентными штаммами ALHF, но также может быть индуцированных для более высоких уровнях в ответ на перметрин лечения7 . Однако функциональные характеристики этих carboxylesterase генов в метаболизм инсектицидов по-прежнему быть изучены.
После представления первого доклада в начале 1980-х8бакуловирусы опосредованной иностранных ген выражение системы широко используются из-за его эффективности производства высоким содержанием белка и эукариотических белка, обработки возможностей9. Эта двойная система состоит из двух основных элементов: сконструированный рекомбинантных бакуловирусы доставки чужеродных генов в клетки хозяина и крупномасштабных выражение заинтересованных белков в клетках, инфицированных рекомбинантного бакуловирусы. За последние десятилетия бакуловирусы опосредованной клеток выражение системы широко используется производить тысячи рекомбинантных белков, начиная от цитозольной ферментов с белками мембраны прыгните насекомых и млекопитающих клеток10. Наши предыдущие исследования успешно выразил несколько CYP450 ферментов насекомых Sf9 клетки с этой системы11. В этом исследовании, мы построен carboxylesterase рекомбинантных бакуловирусы заразить клетки насекомого Sf9, изучаются терпимости клеток для лечения различных перметрин и крупномасштабных выраженной carboxylesterase белков в пробирке для функциональных разведки. Вместо того, чтобы расследование нескольких carboxylesterase изоферменты смеси от насекомых гомогенатах, принятый ранее исследования12,13, эта система выражение бакуловирусы опосредованной насекомых клеток позволяет конкретное выражение и изоляция целевых белков для лучшего изучения их биохимических и структурных свойств.
Пробу на основе соли tetrazolium (МТТ) является высок объём колориметрическим методом разработаны и оптимизированы для измерения жизнеспособности клеток. Этот assay основан на механизме, который только живые клетки способны метаболизировать реагент МТТ желтый цвет к темный фиолетовый Цветные Формазаны осадок, который может быть проанализирован нелабильном после того, как растворяется в органических растворителях14, 15. Несколько более точным, но много времени методы, такие как Трипановый синий изоляции и тимидина титрования пробирного16,17, были разработаны в последние годы. Однако на основе клеток МТТ пробирного до сих пор в настоящее время признается как метод наиболее быстрым и легко управлять быстро обнаружить жизнеспособность клеток. Здесь мы используем МТТ assay для изучения клеток терпимость против инсектицидами лечения. Повышение толерантности клеток когда инфицированных рекомбинантного бакуловирусы carboxylesterase решительно поддерживает метаболические функции carboxylesterases чтобы инсектициды, которые в свою очередь предполагает их участие в инсектицидам.
Кроме того в пробирке метаболических assay также было проведено в этом исследовании. По сравнению с общим carboxylesterase анализов, которые используют общие субстратов, например α-napthyl ацетат (α-NA) и β-naphthyl ацетат (β-NA) для отражения гидролитическая деятельности carboxylesterases, исследование метаболизма в vitro рассматривается как точный способ для прямого измерения деятельности carboxylesterases к инсектицидам18. Этот метод успешно работает в различных насекомых характеризовать множественные цитохрома P450s совместно с инсектицидами сопротивление11,19,20. Однако этот метод еще не применяется в carboxylesterase исследованиях. При наличии carboxylesterase белков, производимые бакуловирусы опосредованной выражение системы мы можем выполнить в vitro метаболических исследование carboxylesterases сторону перметрин, который далее может предоставить убедительные доказательства участия из carboxylesterases в присвоении пиретроид сопротивления в доме мух.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs inc.</td>
			<td>M0491L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen by life technology</td>
			<td>K240020</td>
			<td>S.O.C medium and universal M13 sequence primers were included in this kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Invitrogen by life technology</td>
			<td>K210002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway LR Clonase II Enzyme mix for BaculoDirectTM Kits</td>
			<td>Invitrogen by life technology</td>
			<td>11791-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit</td>
			<td>Invitrogen by life technology</td>
			<td>12562-019</td>
			<td>Cellfectin transfection reagent and ganciclovir were included in this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR-CAT plasmid</td>
			<td>Invitrogen by life technology</td>
			<td></td>
			<td>Included in BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit, concentration: 0.5 ug/uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated Fetal Bovine Serum, Certified</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>10082-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells in Sf-900 III SFM</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>12659017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction &#38; Lysis Buffer</td>
			<td>G Biosciences by A Geno Technology Inc</td>
			<td>786-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf-900 III SFM (1&#215;) Serum Free Medium Complete</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>12658-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#39;s Insect Medium, unsupplemented</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>11595030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permethrin (isomers) analytical standard</td>
			<td>SUPELCO by Solutions WithinTM</td>
			<td>442748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (analytical graded)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (analytical graded)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GHP Acrodisc 25 mm Syringe Filters with 0.45 &#956;m GHP Membrane (HPLC Certified)</td>
			<td>Pall Life Sciences</td>
			<td>21890388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alliance Waters 2695 HPLC System</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycle</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional characterization of carboxylesterases in insecticide resistant house flies, musca domestica

Считается, что Carboxylesterase опосредованной метаболизм играть важную роль в инсектицидам в различных насекомых. Несколько carboxylesterase гены были найдены вверх регулируются летать штамм устойчив дом, тогда как их роль в присвоении инсектицидам предстоит изучить. Здесь мы разработали протокол для функциональных характеристик carboxylesterases. Представлены три примера эксперименты: (1) выражение и изоляции carboxylesterase белков через бакуловирусы опосредованной насекомое Spodoptera frugiperda (Sf9) клеток выражение системы; (2 на основе клеток МТТ (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-ил] -2, 5-diphenyltetrazolium бромид) анализа цитотоксичности измерить толерантности насекомых клеток для лечения различных перметрин; и (3) в vitro метаболических исследования для изучения возможности метаболических carboxylesterases сторону перметрин. Джин carboxylesterase, что MdαE7 был клонирован с устойчивостью дома летать штамм ALHF и используется для конструирования рекомбинантных бакуловирусы Sf9 клетки инфекции. Жизнеспособность клеток против различных перметрин лечения были измерены с МТТ assay. Расширение ячейки терпимости экспериментальной группы (MdαE7-рекомбинантных бакуловирусы инфицированных клеток) по сравнению с теми из групп управления перметрин (CAT-рекомбинантных бакуловирусы инфицированных клеток и GFP-рекомбинантных бакуловирусы инфицированных клеток) лечение предложил возможности MdαE7 в метаболизм инсектицидов, тем самым защищая клетки от химических повреждений. Кроме того carboxylesterase белки были выражена в насекомое Sf9 клеток и изолированные провести исследование метаболизма в пробирке . Наши результаты показали значительный в vitro метаболические эффективность MdαE7 сторону перметрин, прямо указывающее участия carboxylesterases в метаболизм инсектицидов и таким образом наделение инсектицидам в доме мух.

Жизнеспособность клеток к лечения различных перметрин (МТТ проба)
Цитотоксичность перметрин рассматривался в MdαE7-рекомбинантных бакуловирусы инфицированных Sf9 клетки (экспериментальная группа) и CAT-рекомбинантных бакуловирусы (предос...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica at JoVE.com

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

Здесь мы представляем протокол производить дом летать carboxylesterase белков в пробирке с системой выражение насекомых клеток бакуловирусы опосредованной и позднее функционально характеризуют их роли в метаболизм перметрин, таким образом, присвоение пиретроиды сопротивление путем проведения на основе клеток МТТ пробирного и в пробирке метаболических исследований.

Функциональная характеристика Carboxylesterases в стойкие инсектициды дома мух, Муха Domestica

Carboxylesterase-mediated metabolism is thought to play a major role in insecticide resistance in various insects. Several carboxylesterase genes were ...

This method can help the key questions in the field of insect toxicology, such as, if all express the metabolic detoxification genes are involved in insecticide resistance? The main advantage of this technique is that it allows to produce larger scales of proteins, and characterize the function of these proteins in metabolizing of insecticides in vitro. Demonstrating the procedures, will be Xuechun Feng, a grad student in my laboratory.Xuechen's PhD research is focused on the characterization of function of carboxyl esterase in parasite resistance of house flies, Musca domestica. To begin, mix one microliter of GFP entry plasma DNA, with five microliters of a commercially available C-term linear DNA in 250 microliter PCR tubes. Next, add two microliters of commercially available lambda recombination mix to each of the PCR tubes.Gently mix the tubes, and incubate them at 25 degrees Celsius overnight. Seed two milliliters of log phase growth insect SF9 cell culture evenly to the wells of a cell culture plate. Then allow the cells to attach for at least three hours at room temperature, in the hood.Using an inverted phase microscope at 250x, check the cell attachment. Then, remove the cell culture medium, and replace it with two milliliters of Grace's insect medium. After this, prepare transfection mixture A and B solutions according to the text protocol.Then gently mix transfection mixtures A and B together by tapping the tubes. Incubate the mixture at room temperature, in the hood, for 35 minutes. Next, add the mixture drop-wise, onto the seeded cells.Seal the wells with tape, and incubate the cells at 27 degrees Celsius, overnight. Replace the two milliliters of Grace's insect medium, with two milliliters of complete growth medium. Then, add 100 micromole Ganciclovir, to each well.Seal the wells with tape, and incubate the cells at 27 degrees Celsius for 72 hours. 72 hours post-infection, collect the medium from each well, and transfer it to 1.5 milliliter centrifuge tubes. Then centrifuge the tubes at 1500 times G, for five minutes at four degrees Celsius.Add one milliliter of complete growth medium to the well, and use a microscope with fluorescent light, to observe the infection signs of cells at the P1 baculovirus amplification stage. Transfer the supernatant into new 1.5 milliliter centrifuge tubes, and store them at four degrees Celsius, in dark conditions. After this, seed two milliliters of log phase growth insect SF9 cell culture, evenly, in the wells of a cell culture plate.Allow the cells to attach for at least three hours at room temperature, in the hood. Inoculate five microliters of P1 virus stock into the cell seeded wells, then, add 100 micromole Ganciclovir to each well. Seal the wells, and incubate the cells for 72 hours at 27 degrees Celsius.First, culture five milliliters of log phase growth insect SF9 cells, with complete growth medium, in T25 non-treated flasks. Then, add 25 microliters of P1 virus stock solution to infect the cell culture, for 48 hours, with gentle shaking, at 27 degrees Celsius. Using acetonitrile, prepare serial dilutions of 100 millimole permethrin.Then, seed 200 microliters of infected cell culture supplemented with 300 microliters of complete growth media, into a 24 well plate. Making sure that permethrin is fully dissolved in the acetonitrile, and evenly delivered into each well of the plate. After adding the permethrin, gently shake the plate to fully mix the permethrin in the medium.After this, seal the plate with tape, and incubate the plate at 27 degrees Celsius, for 48 hours, in dark conditions. Remove the cell culture medium from the plate without disturbing the bottom attached cell layer. Add 200 microliters of the MMT reagent to each well.Then, incubate the plate at 37 degrees Celsius for four hours, until dark purple formazan precipitants form in each well. Add 500 microliters of DMSO to each well, to fully dissolve the precipitants. Then transfer 200 microliters of the dissolved solution, to each well of a 96 well plate.Fully dissolving the precipitate into DMSO is crucial for the accuracy of the results. After adding the DMSO into samples in the plate, the samples will be washed using the pipette, for several times, until the precipitate has been fully dissolved. Finally, use a microplate reader to measure the absorbance values of the plate at 540 nanometers.At the P1 stage, the infection ratio is low. At the P2 stage, the infection ratio was significantly enhanced. At the P3 infection stage, almost all the cells showed symptoms of detachment from the cell culture plate, increases of cell diameter, as well as the cessation of cell growth.Based on the detected absorbance values, the Md alpha E7 expressing cells showed significantly higher viability, compared to the control CAT cells. While conducting this procedure, it is important to prevent cell contamination in all steps, by wiping the surface of stuffs, such as bottles and tubes, with 70 percentage ethanol before conducting the cell experiments. Following this procedure, some other methods, like the homology modeling and dark analysis, can be performed in order to answer additional questions, like the interactions between carboxyl esterase protein and permethrin ligand.This technique paved the way for the researchers in the insect toxicology, to explore the functional characterization of the genes and mechanisms in insecticide resistance of insects. Don't forget that working with insecticide can be very harmful, and precautions, such as gloves and lab coats, should always be taken while conducting these procedures.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Структурные характеристики Маннан полисахаридов клеточной стенки в растений с использованием ПАСЕ

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Улучшенная протокол для иммунопреципитации Chromatin от мыши скелетных мышц

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Характеристика гликопротеины с складке иммуноглобулина рентгеноструктурного анализа и биофизических методов

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Люминесцентные серебряные пятная белков в полиакриламидных гелей

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Быстрое на основе флуоресценции характеристика одной внеклеточного везикулы в крови человека с анализом наночастиц отслеживание

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Определение функциональных белков регионов путем строительства химерных белка

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Характеристика Мембранных Транспортеров по гетерологусному выражению в кишечной палочке и производству Мембранных Весиклей

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-обязательные организации (SUBEs) как инструменты для обогащения, изоляции, идентификации и характеристики ПРОтеоме СУМО при раке печени

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Функциональная характеристика РИНГ-типа E3 Ubiquitin Ligases in Vitro и В Планте

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Характеристика амилоидных структур в старении C. Elegans использованием флуоресценции пожизненной визуализации

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...