Name: functional characterization of carboxylesterases in insecticide resistant house flies, musca domestica
Uploaded: 2018-08-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica at JoVE.com

1. uttryck och isolering av målproteiner med en baculoviridae-medierad insekt Cell uttryck systemet
<ol><li>Directionally klona blunt-slutade PCR-produkter av målproteiner från hus flugor.<ol>
<li>Design PCR primers av grönt fluorescerande protein (GFP) och huset flyga MdαE7 genen baserat på deras sekvenser och de särskilda kraven för den valda vektorn (tabell 1).</li>
		<li>Använd en termostabila, korrekturläsning DNA-polymeras och primers från steg 1.1.1 för att utföra en 150 µL PCR-rea...

<ol>
	<li>Scott, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insecticide+resistance+in+house+flies+from+the+United+States:+Resistance+levels+and+frequency+of+pyrethroid+resistance+alleles.">Insecticide resistance in house flies from the United States: Resistance levels and frequency of pyrethroid resistance alleles.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 377-384 (2013).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole+transcriptomal+linkage+analysis+of+gene+co-regulation+in+insecticide+resistant+house+flies,+Musca+domestica.">A whole transcriptomal linkage analysis of gene co-regulation in insecticide resistant house flies, Musca domestica.</a> BMC Genomics. 14, 803 (2013).</li><li>Liu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insecticide+resistance+in+mosquitoes:+impact,+mechanisms,+and+research+directions.">Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions.</a> Annual Review of Entomology. 60, 537-559 (2015).</li><li>Grigoraki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+and+genetic+study+reveal+amplified+carboxylesterase+genes+implicated+in+temephos+resistance,+in+the+Asian+tiger+mosquito+Aedes+albopictus.">Transcriptome profiling and genetic study reveal amplified carboxylesterase genes implicated in temephos resistance, in the Asian tiger mosquito Aedes albopictus.</a> e0003771. 9, e0003771 (2015).</li><li>Grigoraki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboxylesterase+gene+amplifications+associated+with+insecticide+resistance+in+Aedes+albopictus:+Geographical+distribution+and+evolutionary+origin.">Carboxylesterase gene amplifications associated with insecticide resistance in Aedes albopictus: Geographical distribution and evolutionary origin.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 11, e0005533 (2017).</li><li>Wheelock, C., Shan, G., Ottea, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+carboxylesterases+and+their+role+in+the+metabolism+of+insecticides.">Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides.</a> Journal of Pesticide Science. 30, 75-83 (2005).</li><li>Feng, X., Li, M., Liu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboxylesterase+genes+in+pyrethroid+resistant+house+flies,+Musca+domestica.">Carboxylesterase genes in pyrethroid resistant house flies, Musca domestica.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 30-39 (2018).</li><li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival:+application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assays.">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays.</a> J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li><li>Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus-insect+cell+expression+systems.">Baculovirus-insect cell expression systems.</a> Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).</li><li>Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+system+for+heterologous+multiprotein+complexes.">Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1583 (2004).</li><li>Gong, Y., Li, T., Feng, Y., Liu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+two+P450s,+CYP9M10+and+CYP6AA7,+in+the+permethrin+resistance+of+Culex+quinquefasciatus.">The function of two P450s, CYP9M10 and CYP6AA7, in the permethrin resistance of Culex quinquefasciatus.</a> Scientific Reports. 7 (1), 587 (2017).</li><li>Cao, C. W., Zhang, J., Gao, X. W., Liang, P., Guo, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+carboxylesterase+gene+associated+with+organophosphorous+insecticide+resistance+in+cotton+aphids,+Aphis+gossypii+(Glover).">Overexpression of carboxylesterase gene associated with organophosphorous insecticide resistance in cotton aphids, Aphis gossypii (Glover).</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 90 (3), 175-180 (2008).</li><li>Zhang, L., Gao, X., Liang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cypermethrin+resistance+associated+with+high+carboxylesterase+activities+in+a+strain+of+house+fly,+Musca+domestica+(Diptera:+Muscidae).">Beta-cypermethrin resistance associated with high carboxylesterase activities in a strain of house fly, Musca domestica (Diptera: Muscidae).</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 89, 65-72 (2007).</li><li>Van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sensitivity+assays:+the+MTT+assay.">Cell sensitivity assays: the MTT assay.</a> Cancer cell culture. , 237-245 (2011).</li><li>Stockert, J. C., Bl&#225;zquez-Castro, A., Ca&#241;ete, M., Horobin, R. W., Villanueva, &. #. 1. 9. 3. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MTT+assay+for+cell+viability:+Intracellular+localization+of+the+formazan+product+is+in+lipid+droplets.">MTT assay for cell viability: Intracellular localization of the formazan product is in lipid droplets.</a> Acta Histochemica. 114 (8), 785-796 (2012).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Riss, T. L., Moravec, R. A., Niles, A. L., Duellman, S., Benink, H. A., Worzella, T. J., Minor, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+viability+assays.">Cell viability assays.</a> Assay Guidance Manual. , (2013).</li><li>Wheelock, C. E., Shan, G., Ottea, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+carboxylesterases+and+their+role+in+the+metabolism+of+insecticides.">Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides.</a> Journal of Pesticide Science. 30 (2), 75-83 (2005).</li><li>Li, X., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+metabolic+resistance+to+synthetic+and+natural+xenobiotics.">Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics.</a> Annual Review of Entomology. 52, 231-253 (2007).</li><li>Nakamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+metabolism+of+a+pyrethroid+insecticide,+permethrin,+and+its+hydrolysis+products+in+rats.">The in vitro metabolism of a pyrethroid insecticide, permethrin, and its hydrolysis products in rats.</a> Toxicology. 235 (3), 176-184 (2007).</li><li>Kruger, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bradford+method+for+protein+quantitation.">The Bradford method for protein quantitation.</a> The protein protocols handbook. , 15-21 (2002).</li><li>Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+protein+production+using+the+Pichia+pastoris+expression+system.">Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system.</a> Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).</li><li>Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+system+for+heterologous+multiprotein+complexes.">Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1583 (2004).</li><li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+bacterial+expression+systems+for+heterologous+protein+production:+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems.">Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211 (2006).</li><li>Bulter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+a+fungal+laccase+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+directed+evolution.">Functional expression of a fungal laccase in Saccharomyces cerevisiae by directed evolution.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 69 (2), 987-995 (2003).</li><li>Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pitfalls+of+the+MTT+assay:+Direct+and+off-target+effects+of+inhibitors+can+result+in+over/underestimation+of+cell+viability.">Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability.</a> Gene. 574 (2), 193-203 (2015).</li></ol>

Under de senaste decennierna har heterologa uttryck system använts att uttrycka och isolera stora mängder proteiner, vilket möjliggör biokemiska och funktionell bestämning och karakterisering av enzymer in vitro. Hittills har flera olika modellsystem inklusive Escherichia coli, Pichia pastoris, Sacccharomyces cerevisiaeoch Spodoptera frugiperda har anpassats för rekombinant proteinuttryck, och valet av den in vitro -system är avgörande för storskaliga generat...

Insektsmedel motstånd är för närvarande en huvudfråga hus flugkontroll världsomspännande1,2. Ansträngningar för att fastställa mekanismen av insektsmedel motstånd underlättar bättre förståelse av problemet och ger därmed nya strategier för att effektivt förhindra eller minimera spridning av resistens utveckling3. Carboxylesterases, har som en av de stora avgiftning enzymerna, lockat en hel del uppmärksamhet för sina roller i komplexbildare och metaboliserar insekticider i olika insekter4,5,6. Vår tidigare studie har identifierat flera carboxylesterases i hus flugor och deras uttryck nivåer var inte bara konstitutivt uppreglerat i den resistent ALHF stammen men kan också induceras till högre nivåer som svar på permetrin behandlingar7 . De funktionella karakteriseringar av dessa karboxylesteras gener i metaboliserande insekticider återstår dock undersökas.
Sedan den första rapporten i början av 1980-talet8, har en baculoviridae-medierad utländska gen uttryck system varit allmänt anställd på grund av dess höga protein produktionseffektivitet och eukaryota protein bearbetning kapacitet9. Denna binära systemet består av två grundläggande element: den konstruerade rekombinant baculoviridae att leverera främmande gener i värdcellerna och storskaliga uttrycket av intresserade av proteiner av celler som smittats av rekombinant baculoviridae. Under de senaste decennierna, baculoviridae medierad cell uttryck systemet har använts i stor utsträckning att producera tusentals rekombinanta proteiner, alltifrån cytosoliska enzymerna till membran-bundna proteiner i insekt och däggdjurs celler10. Vår tidigare studie har framgångsrikt uttryckte flera CYP450-enzymer i insekt Sf9 celler med detta system11. I denna studie vi konstruerade en karboxylesteras-rekombinant baculoviridae för att infektera insekt Sf9 celler, utforskade den cell toleransen mot olika permetrin behandlingar och storskaliga uttryckt karboxylesteras proteiner i vitro för funktionell utforskning. Istället för att undersöka flera karboxylesteras isozymet blandningar från insekt homogenates antagits av tidigare studier12,13, detta baculoviridae-medierad insekt cell uttryck systemet tillåter det specifika uttrycket och isolering av riktade proteiner för bättre karaktärisering av deras biokemiska och strukturella egenskaper.
Tetrazolium saltbaserade analysen (MTT) är en hög genomströmning kolorimetrisk metod utvecklad och optimerad för att mäta cellviabilitet. Denna analys bygger på den mekanism som endast levande celler kan av metaboliserande gul-färgade MTT reagens till en mörk lila färgade formazan fällning, som kan analyseras kolorimetriskt efter upplöst i organiska lösningsmedel14, 15. Flera mer exakt, men tidskrävande metoder, såsom Trypan blå utslagning och tymidin titrering assay16,17, har utvecklats under de senaste åren. Cellbaserade MTT analysen redovisas dock fortfarande närvarande som den mest snabb och lättmanövrerad metoden att snabbt upptäcka cellviabilitet. Här, använder vi MTT analysen för att utforska cell toleransen mot insektsmedel behandlingar. Förbättrad tolerans av celler när infekterade med karboxylesteras rekombinant baculoviridae starkt stöder carboxylesterases till insekticider, vilket i sin tur tyder på deras engagemang i insektsmedel motstånd metabola roller.
Dessutom genomfördes ett in vitro- metabola test också i denna studie. Jämfört med allmänna karboxylesteras analyser som använder vanliga substrat såsom α-napthyl acetat (α-NA) och β-naftyl acetat (β-NA) för att återspegla hydrolytiska verksamhet av carboxylesterases, betraktas in vitro- metabola studien som ett korrekt sätt att direkt mäta aktiviteter av carboxylesterases mot insekticider18. Denna metod har använts framgångsrikt i olika insekter att karakterisera flera cytokrom P450s i samband med insektsmedel motstånd11,19,20. Men har denna metod ännu inte tillämpats i karboxylesteras studier. Med tillgängligheten av karboxylesteras proteiner som produceras av baculoviridae-medierade uttryck systemet, kan vi utföra en in vitro- metabola studie av carboxylesterases mot permetrin, vilket ytterligare kan ge starka bevis för inblandning av carboxylesterases i ger pyretroidbaserade resistens i hus flyger.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs inc.</td>
			<td>M0491L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen by life technology</td>
			<td>K240020</td>
			<td>S.O.C medium and universal M13 sequence primers were included in this kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Invitrogen by life technology</td>
			<td>K210002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway LR Clonase II Enzyme mix for BaculoDirectTM Kits</td>
			<td>Invitrogen by life technology</td>
			<td>11791-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit</td>
			<td>Invitrogen by life technology</td>
			<td>12562-019</td>
			<td>Cellfectin transfection reagent and ganciclovir were included in this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR-CAT plasmid</td>
			<td>Invitrogen by life technology</td>
			<td></td>
			<td>Included in BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit, concentration: 0.5 ug/uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated Fetal Bovine Serum, Certified</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>10082-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells in Sf-900 III SFM</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>12659017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction &#38; Lysis Buffer</td>
			<td>G Biosciences by A Geno Technology Inc</td>
			<td>786-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf-900 III SFM (1&#215;) Serum Free Medium Complete</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>12658-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#39;s Insect Medium, unsupplemented</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>11595030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permethrin (isomers) analytical standard</td>
			<td>SUPELCO by Solutions WithinTM</td>
			<td>442748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (analytical graded)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (analytical graded)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GHP Acrodisc 25 mm Syringe Filters with 0.45 &#956;m GHP Membrane (HPLC Certified)</td>
			<td>Pall Life Sciences</td>
			<td>21890388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alliance Waters 2695 HPLC System</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycle</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional characterization of carboxylesterases in insecticide resistant house flies, musca domestica

Karboxylesteras-medierad metabolism tros spela en viktig roll i insektsmedel resistens hos olika insekter. Flera karboxylesteras gener hittades uppreglerat i resistenta house fly stam, medan deras roller i ger insektsmedel resistens återstod för att utforskas. Här har vi utformat ett protokoll för funktionell karakterisering av carboxylesterases. Tre exempel experiment presenteras: (1) uttryck och isolering av karboxylesteras proteiner genom en baculoviridae-medierad insekt Spodoptera frugiperda (Sf9) cell uttryck systemet; (2) en cellbaserade MTT (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-yl] -2, 5-diphenyltetrazolium bromid) cytotoxicitet analys att mäta toleransen av insekt celler på olika permetrin behandlingar. och (3) i vitro metabola studier att utforska de metaboliska funktionerna i carboxylesterases mot permetrin. Karboxylesteras genen MdαE7 klonats från en resistent hus flyga stam ALHF och används för att konstruera en rekombinant baculoviridae Sf9 celler angripits. De cellen förmåga mot olika permetrin behandlingar mättes med MTT-analys. Förbättrad cell toleransen för den experimentella gruppen (MdαE7-rekombinant baculoviridae infekterade celler) jämfört med kontrollgrupperna (CAT-rekombinant baculoviridae infekterade celler och GFP-rekombinant baculoviridae infekterade celler) till permetrin behandlingar föreslås funktionerna i MdαE7 i metaboliserande insekticider, därigenom skydda celler från kemiska skador. Förutom att var karboxylesteras proteiner uttrycks i insekt Sf9 celler och isolerade för att genomföra en in vitro- metabola studie. Våra resultat visade en betydande in vitro- metabolisk effektivitet av MdαE7 mot permetrin, som direkt visar medverkan av carboxylesterases i metaboliserande insekticider och således ger insektsmedel resistens i hus flyger.

Cellviabiliteten mot olika permetrin behandlingar (MTT assay)
Cytotoxiciteten hos permetrin undersöktes i MdαE7-rekombinant baculoviridae infekterade Sf9 (experimentgruppen) och katt-rekombinant baculoviridae (tillhandahålls av baculoviridae infekterade kit) infekterade celler (kontrollgrupperna). Förbättrad cell toleranser att permetrin i MdαE7 uttrycker cellerna starkt stödja detta karboxylesteras mot insekticider och där...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica at JoVE.com

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

Här presenterar vi ett protokoll för att producera house fly karboxylesteras proteiner i vitro med en baculoviridae medierad insekt cell uttryck systemet och senare funktionellt präglar deras roller i Fettnedbrytande permetrin, därmed ger pyretroidbaserade motstånd av cellbaserade MTT assay och in vitro- metaboliska studier.

Funktionell karakterisering av Carboxylesterases i insektsmedel resistenta hus flugor, Musca Domestica

Carboxylesterase-mediated metabolism is thought to play a major role in insecticide resistance in various insects. Several carboxylesterase genes were ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Strukturell karaktärisering av Mannan cellväggen polysackarider i anläggningar som använder takt

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Förbättrat protokoll för kromatin Immunoprecipitation från mus skelettmuskulatur

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakterisering av glykoproteiner med immunglobulin luckan av röntgenkristallografi och biofysiska tekniker

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerande silverfärgning av proteiner i polyakrylamidgeler

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Snabb fluorescens-baserade karakterisering av enda extracellulär blåsor i människans blod med nanopartiklar-tracking analys

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Identifiering av funktionellt Protein regioner genom chimära Protein konstruktion

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Karakterisering av membran transportörer genom heterologt uttryck i E. coli och produktion av membran blåsor

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-bindande enheter (SUBEs) som verktyg för berikning, isolering, identifiering och karakterisering av SUMO Proteome i lever cancer

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Funktionell karaktärisering av RINGTYP E3 ubiquitin Ligaser in vitro och i planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Karakterisering av amyloidstrukturer i åldrande C. Elegans med fluorescenslivslängd imaging

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...